Методи визначення імунологічної реактивності - практичні навички педіатра

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

У педіатричній практиці широко використовуються алергологічні шкірні проби з мікробними і немікробного антигенами, туберкулінові проби, дослідження білкових фракцій і імуноглобулінів сироватки крові, слизу верхніх дихальних шляхів та інших екськретов, ставляться реакції аглютинації, преципітації, иммунофлуоресценции, реакція зв`язування комплементу (РСК), реакція Кумбса , проводяться дослідження неспецифічних факторів захисту - С-реактивного білка, інтерферону, пропердина, комплементу та ін. Для орієнтування викладемо принципи деяких найбільш часто використовуваних імунологічних досліджень.

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ НЕСПЕЦІЦІФІЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТІ

Гемолітична активність комплементу. Комплемент (син. Алексин) -це неспецифічний фактор захисту, в систему якого входить ряд сироваткових білків. За номенклатурою ВООЗ система комплементу позначається символом С, а її індивідуальні компоненти - цифрами від 1 до 9 (Ci, С2, С9). В системі комплементу 8 білків є індивідуальними, а Сд є комплексом, до якого входять 4 білка системи пропердина, 1 інгібітор ферменту і 2 ферменту. Білки системи комплементу можуть бути активовані в певній послідовності за принципом біологічного посилення при реакції антиген - антитіло або неспецифічними факторами (С3-проактіватор, С-проактіва-торконвертаза, фактор кобри і ін.). Сироватка, підігріта до 56 ° С, протягом 30 хвилин втрачає комплементарную активність. Комплемент здатний приєднуватися до комплексу антиген - антитіло, на чому заснована РСК. Існує ряд модифікацій РСК. Знижений титр комплементу спостерігається при вираженому ступені алергізації організму, деяких аутоімунних захворюваннях (коллагенозах і ін.).
Про рівень вмісту комплементу в сироватці крові судять по його гемолітичної активності. Найбільш широко використовується уніфікований метод визначення гемолітичної активності комплементу по 50% гемолізу. В основу методу покладено принцип, згідно з яким комплемент досліджуваної сироватки викликає гемоліз сенсибілізованих баранячих еритроцитів у присутності сироватки кролика, імунізованих баранячими еритроцитами (гемолітична сироватка). Активність комплементу враховується в умовних гемолитических одиницях. Одна 50% гемолітична одиниця - це така кількість комплементу, яке викликає гемоліз 50% 0,5 мл стандартної суспензії сенсибілізованих еритроцитів при 37 ° С за 45 хв. У сироватці здорових людей міститься 20-40 гемолитических одиниць комплементу.
пропердин. Відноситься до неспецифічним імунним факторів організму. У присутності комплементу і іонів магнію пропердин проявляє бактерицидну дію і здатний інактивувати деякі віруси. У сироватці крові людини в нормі міститься 4-8-10 од. пропердина.
Для визначення рівня пропердина в сироватці крові застосовують зімозановий метод титрування. Він заснований на здатності пропердина зв`язуватися з полисахаридом зімозаном. Утворений при цьому комплекс пропердин - зимозан інактивує третю фракцію комплементу (Сз). Облік результатів проводять за ступенем інактивації Сз.
Визначення С-реактивного білка. У сироватці крові здорових людей С-реактивний білок не визначається. Він виявляється при гострому запальному процесі, захворюваннях, що супроводжуються тканинною деструкцією, і є показником активності цих процесів.
У скляний капіляр розміром 0,4 X 100 мм набирають до 1/3 обсягу антисироватки і такий же обсяг сироватки хворого. Похитуючи капіляр 12-15 разів, що містяться в ньому реагенти перемішують. Потім капіляр утримують в горизонтальному положенні і кінець його занурюють в пластилін таким чином, щоб при наданні капіляри вертикального положення суміш перебувала над стовпчиком повітря, не торкаючись до пластиліну. Реакція може відбуватися при кімнатній температурі, в такому випадку попередній облік результатів проводиться через 4 ч, а якщо суміш інкубується в термостаті при температурі 37 ° С - через 2 год. Остаточний результат враховують після витримування суміші сироватки в капілярі при кімнатній температурі 18-20 год , т. е. в кінці доби. На наявність С-реактивного білка вказує випадання преципітату: висота осів преципитата в

1. мм оцінюється одним хрестом (+), в 2 мм - (+ +). в
2. мм - (+ + +) »в 4 мм і більше - (+ + + +).

Титр гетерофільних аглютинінів. До факторів природного неспецифічного імунітету відносяться гетерофільних аглютинінів, які утворюються у відповідь на спонтанне вплив на організм широко поширених в навколишньому середовищі антигенів. Титр гетерогенних агглютининов в сироватці крові залежить від віку: в перші 5 років життя він наростає, а в старості - падає. У здорових дорослих людей титр гетерофільних аглютинінів коливається в розведеннях від 1: 8 до 1:32 (в середньому 1:16). Титр визначаються за методикою Пауля - Буннеля.
лізоцим. Це - один з вроджених факторів протимікробну захисту, виявляється в слізної рідини, мокротинні, шкірі, сироватці крові, молоці, нирках, печінці, серці та інших тканинах організму людини. Особливо багаті цим речовиною лейкоцити і слізна рідина. Вперше лізоцим був виявлений А. Флемінгом (1922). Дослідженнями 3 В. Ермольевой з співр. (1968) було показано, що лізоцим є фермент мурамідаза, що руйнує пептідополісахаріди клітинних стінок бактерій.
Існує кілька методів визначення активності лізоциму біологічний, шлях серійних розведень з тест-мікробом, турбодіметріческій і метод дифузії на агарі.
Згідно з літературними даними (3. М. Михайлова, П. А Міхєєв, 1966), у дітей перших років життя і новонароджених титр лізоциму значно вище, ніж у дорослих.
Фагоцитарна активність лейкоцитів. Явище фагоцитозу як найважливіший фактор природного імунітету було відкрито І. М. Мечникова. Здатністю поглинати і перетравлювати мікроорганізми і інші чужорідні частинки мають в крові нейтрофіли (мікрофаги), моноцити і клітини ретикулоендотеліальної системи (рухливі і фіксовані макрофаги).
У відалевской пробірці готується суміш, в яку входять 0,1 мл лімоннокіслого натрію в 2% розчині, 0,2 мл досліджуваної крові і 0,1 мл суспензії тест-мікроба (стафілокок № 209 або ін.), Отриманої з добової агарної культури і розведеної до 400 млн мікробних тіл в 1 мл. Після перемішування перерахованих компонентів суміш поміщають в термостат при температурі 37 ° С на 30 хв. Потім суміш центрифугують, з верхнього шару осаду готують мазки, фіксують їх сумішшю Никифорова і фарбують по Романовським- Гімзою. Препарат микроскопируют, вираженість фагоцитозу оцінюють за кількістю спожитих нейтрофилами мікробів (фагоцитарне число) і кількості лейкоцитів, які виявили фагоцитарну активність. З цією метою переглядають 100 нейтрофілів. У нормі у здорових людей фагоцитирующие лейкоцити складають 50-70%, а фагоцитарне число - 2-4.
Реакція бласттрансформації (РБТ) лімфоцитів. Це здатність лімфоцитів перетворюватися в недиференційовані бластні клітини при культивуванні лейкоцитів in vitro на штучному живильному середовищі. Такий процес може бути стимульований специфічними і неспецифічними агентами. Неспецифічним стимулятором є рослинний білок фитогемагглютинин, під впливом якого через 72 год відбувається трансформація лімфоцитів в великі зародкові клітини, причому багато хто з них знаходяться в стані мейозу.
У роботах багатьох дослідників було показано, що при важкому перебігу ряду захворювань РБТ лімфоцитів, отриманих у таких хворих, різко пригнічена. При поліпшенні стану хворих відновлюється здатність лімфоцитів перетворюватися під дією стимулятора в бластні клітини.