Експрес-методи виявлення спадкових біохімічних дефектів - практичні навички педіатра
Відомо близько 500 спадкових захворювань обміну речовин, які можуть порушувати нормальний ріст і розвиток дитини. Діагностика цих захворювань за зовнішніми клінічними ознаками не завжди можлива. Програми біохімічних досліджень для з`ясування суті спадкового дефекту обміну речовин дуже складні, і проводити їх можна лише в спеціалізованих генетичних лабораторіях. Однак в дитячих клінічних та поліклінічних лабораторіях можуть виконуватися проби першого етапу, що допомагають лікареві «відсівати» (screening) дітей з підозрою на спадкове захворювання обміну речовин. Тому такі експрес-методи називають скрінірующіх пробами. Це переважно якісні проби. Діти з позитивними результатами по скрінірующіх пробам
обстежуються в спеціалізованих лабораторіях при медико-генетичних консультативних центрах за програмою другого етапу. Для уточнення характеру спадкового дефекту застосовуються хромосомний аналіз, фізичні, біохімічні, особливо хроматографические, методи дослідження.
Наводимо найбільш часто використовувані в практичної педіатрії проби першого етапу.
Мікробіологічні методи діагностики. У ряді країн Європи і Америки використовується тест Гатрі. При цьому в середу з культурою В. Subtilis додають інгібітори, що пригнічують ріст мікроба. При наявності в крові і сечі у хворих підвищеного кількості амінокислот (фенілаланіну, лейцину, гістидину та ін.) Гальмівний вплив інгібіторів усувається і зони росту мікроба збільшуються.
У нашій країні з цією метою часто використовують ауксотрофності штами В. Е. coli, К-12. В основі методу лежить стимуляція зростання ауксотрофності мутантів підвищеною кількістю амінокислот, що містяться в крові і сечі.
Проба з 10% розчином треххлористого заліза (FeCt3). FeCb вступає в реакцію з фенилпировиноградной, іммідазолпіровіноградной кислотами та іншими сполуками. При цьому відбувається фарбування розчину, характер і інтенсивність якого вказують на особливості обмінних порушень.
Реактиви: 10% розчин FeCl3, 10% розчин НС1, магнієвий реактив (11 г MgCh, 20 мл концентрованого NH4OH, 1 л дистильованої води).
Техніка: до 4 мл сечі для зв`язування фосфатів додають 1 мл магнієвого реактиву, перемішують і через 5 хвилин фільтрують через паперовий фільтр. Фільтрат подкисляют 2 краплями 10% розчину НС1, після чого додають 3-4 краплі 10% розчину FeCh. Протягом 5-7 хвилин відзначають зміну забарвлення.
При фенілкетонурії суміш приймає синьо-зелену окраску- Тирозиноз - синьо-зелену, швидко вицветающую- гістидинемія - сіро-зеленую- при порушенні абсорбції метіоніну - пурпурову, що переходила в червоно-корічневую- алкаптонуріі - зелену, швидко вицветающую- діабеті - червоно-коричневу і т. д.
Проба легальний на кетони тіла. Реактиви: 5% водний розчин натрію нітропрусиду (готують ex tempore), крижана оцтова кислота, 10% розчин NaOH.
Т е х н і к а: до 1 мл сечі додають дві краплі 5% розчину натрію нітропрусиду і 0,5 мл 10% NaOH. Потім вводять 0,5 мл крижаної оцтової кислоти. Суміш збовтують і враховують характер фарбування.
При наявності в сечі ацетону, ацетоуксусной, р-оксимасляної кислот (кетонові тіла) введення нітропрусиду дає вишнево-червоне забарвлення, яке зникає, якщо додати оцтової кислоти. Пробу вважають позитивною і при слабо-рожевого забарвлення в умовах достатнього підкислення сечі.
Проба на кетокислот з 2,4-дінітрофенілгідразіном (2,4-ДНФГ). Р е а кт і в и: 0,2% розчин 2,4-ДНФГ в 2 н. НС1, ефір, 10% розчин На2СОз.
Техніка: 0,25 мл сечі змішують з 1 мл 0,2% розчину 2,4-ДНФГ, через 10 хвилин до суміші додають рівний об`єм ефіру, змішують і відстоюють. Після того як вміст пробірки розділиться на 2 шари, верхній (ефірний) шар піпеткою переносять в чисту пробірку і додають рівний об`єм 10% розчину №гСОз.
В реакції 2,4-ДНФГ реагує з кетокислот сечі, внаслідок чого утворюються забарвлені гідрозоною. При позитивній реакції нижній карбонатний шар забарвлений в жовтий або помаранчевий колір. Інтенсивність забарвлення оцінюється візуально за шкалою від 0 до + + + +. При різко позитивній пробі нижній шар має майже коричневу (темно-помаранчеву) забарвлення, при негативній залишається безбарвним.
Реакція буває позитивною при фенілкетонурії, хвороби кленового сиропу, Тирозиноз, або тірозінуріі, гістидинемія. Подібне фарбування може бути також при гіпергліцінемію і глікогенозах типу 1, 3, 5, 6 за рахунок реагування з ацетоном.
Проба на мукополісахариди з цетілтріметіламмо-ніумбромідом (ЦТАБ, або цетавлон). Реактиви: 2,5% розчин ЦТАБ в 1 М цитратному буфері, pH 5,75 (перед розчиненням ЦТАБ буфер підігрівають).
Методика приготування цитратного буфера наступна: 1) розчиняють 210 г лимонної кислоти (CeHeOzX X Н2О) в 500 мл дистильованої води-2) додають 150 мл 20 н. NaOH, розчин перемішують і охолоджують до кімнатної температури-3) використовуючи потенціометр, pH розчину доводять до 5,75 при кімнатній температурі
з додаванням 2и. NaOH- 4) обсяг реактиву шляхом додавання дистильованої води доводять до 1 л.
Техніка: до 5 мл свіжої сечі додають 1 мл 2,5% розчину ЦТАБ, змішують. Проба вважається позитивною, якщо протягом 20-30 хвилин з`являється каламутний або пухнастий преципитат. Реакція буває позитивною при таких мукополісахарідозов, як синдроми Hurler Hunter, Sanfilippo, Scheie, а також при деяких інших спадкових і неспадкових захворюваннях: синдромі Марфана, артроніходісплазіі, множинних екзостозах, ревматоїдному артриті, кретинізм та ін.
Проба на мукополісахариди з толуїдиновим синім.
Краплю сечі мікропіпеткою наносять на фільтрувальний папір, висушують при кімнатній температурі, потім занурюють в толуїдиновий реактив на 1 хвилин і відмивають в 95% розчині етанолу. При позитивній пробі пляма забарвлюється в пурпурно-червоний колір. В якості контролю паралельно ставлять пробу з сечею хворого гаргоілізм або з розчином хондроінтінсульфата А в концентрації 2 мг / мл.
Нітрозонафтоловая проба на Тирозинемія. Реактиви: 1) 2,63 н. азотна кислота, для її приготування один обсяг концентрованої азотної кислоти розчиняють в 5 обсягах води-2) NаNОз, 2,5 г якого розчиняють в 100 мл води-3) а-нитрозо-в-нафтол, 100 мг якого розчиняють в 100 мл 25 % розчину етанолу. Всі реактиви зберігають в холодильнику.
Техніка: до 1 мл 2,63 н. азотної кислоти додають краплю розчину NаNОз і 10 крапель розчину а-нітрозо- b-нафтол. Після змішування зазначених розчинів додають три краплі сечі і знову змішують. Про позитивному результаті говорить оранжево-червоне забарвлення, що з`являється протягом 3-5 хв. Таке фарбування можуть дати тільки тирозин і його метаболіти, що спостерігається при недостатності трансамінази тирозину і тірозінеміі.
Проба на ацетон у сечі. Проводиться за допомогою таблеток, що містять натрію нітропрусид. Ацетон і ацетоуксусная кислота в лужному середовищі реагують з нитрозогруппу натрію нітропрусиду. При цьому утворюються комплексні аніони червоно-коричневого кольору. За кольоровий шкалою визначають кількість ацетону в сечі. Таблетки для експрес-аналізу сечі на ацетон є в наборі заводу «Реагент». У набір входить також піпетка, кольорова шкала і інструкція.
Проба з нингидрином на гіпераміноацідурія. Реактиви: розчин 1 г нингидрина в 500 мл 95% розчину етанолу, який зберігають в темній скляній банці в холодильнику.
Техніка: до 1 мл реактиву додають три краплі сечі і змішують. Поява блакитний або пурпурового забарвлення через 3-5 хвилин вказує на вміст у сечі надмірної кількості амінокислот. Можливі артефакти, що буває при висококонцентрованою сечі або великому вмісті в ній амонію.
Проба Ерліха на уробіліноген і порфобилиноген. Реактив: 2% розчин діметіламінобензоальдегіда в 2 н. НС1.
Техніка: до 5 мл сечі додають 1 мл реактиву. При наявності уробилиногена і порфобилиногена через 10 хвилин з`являється рожеве забарвлення.
Пробу використовують при підозрі на спадкове порушення обміну білірубіну.
Проба Селіванова на фруктозу. Реактив Селіванова: 0,5% розчин резорцину в 20% розчині НС1.
Техніка: до 1 мл сечі додають 0,5 мл вказаного реактиву, змішують і ставлять в киплячу водяну баню на 1 хв, При наявності в сечі фруктози після кип`ятіння з резорцином з`являється вишнево-червоне забарвлення. Однак, якщо суміш кип`ятити триваліше, подібне фарбування може дати і присутність глюкози.
Пробу використовують для виявлення спадкової Фруктоземія.
Проба Сулковича на кальцій. Реактив Сулковича: 2,5 г щавлевої кислоти-2,5 г амонію сульфата- 5 мл крижаної оцтової кислоти-150 мл дистильованої води.
Техніка: до 1 мл сечі в пробірку додають 1 мл реактиву Сулковича і перемішують. Через 1-2 хв, коли з`являється мутність, пробу порівнюють з профільтрованої сечею того ж дитину. Ступінь помутніння оцінюють візуально за шкалою від 0 до + + ++.
Різко позитивною проба Сулковича буває при ідіопатичною гіперкальціємії.
Проба з ортотоллуідіном на мідь. Реактиви: 0,1 г ортотоллуідіна- 0,5 г роданистого аммонія- 5 мл ацетону.
Перед проведенням проби перераховані реактиви в зазначених кількостях змішують.
Техніка: дві краплі сечі наносять на тонку фільтрувальну папір і висушують Потім на утворилося пляма наносять краплю свежеприготовленной суміші реактивів.
Проба вважається позитивною, якщо протягом 30 секунд показуватиме синє забарвлення, що говорить про надмірному вмісті в сечі міді. Постановка проби сприяє виявленню хворих гепатолентикулярной дегенерацією.