Мікробіологічна лабораторія в клініці - інфекційні захворювання у дітей

ІНФЕКЦІЙНІ ХВОРОБИ 0
МІКРОБІОЛОГІЧНА ЛАБОРАТОРІЯ В КЛІНІЦІ
Відповідальність за правильне і ефективне використання можливостей мікробіологічної лабораторії з метою діагностики інфекційних хвороб повинні нести клініцисти. Саме вони, а не співробітники лабораторій вирішують, які матеріали необхідно зібрати для дослідження, коли і як їх отримати і які лабораторні методи використовувати. Клініцист повинен також стежити за своєчасною і правильною транспортуванням отриманих матеріалів, вміти правильно розуміти і трактувати результати мікробіологічного дослідження.
Результати діагностичних досліджень, їх успіх або невдача визначаються обраним матеріалом. У багатьох випадках клініцист, керуючись симптоматикою захворювання, може правильно припустити його етіологію. Однак часто клінічна симптоматика настільки нехарактерна, що тільки мікробіологічна лабораторія може допомогти в діагностиці. Матеріал для бактеріологічного дослідження необхідно отримувати з органів, залучених до патологічного процесу, наприклад спинномозкову рідину слід відбирати при менінгіті, а внутрішньосуглобову - при артриті. Особливу увагу необхідно приділяти можливим воріт інфекції, наприклад верхніх дихальних шляхів у хворих з менінгеальної симптоматикою.
Клініцист повинен вирішити, чи слід йому проводити пошуки збудника, виявити антитіла до нього або зробити те й інше. Для виділення збудника захворювання часто буває необхідно зробити кілька посівів.

1. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА БАКТЕРІАЛЬНИХ ІНФЕКЦІЙ

Найкращим методом діагностики бактеріальних інфекцій є виявлення збудника в мазках і посівах.
Посіви калу. Посіви з тампона (мазок з прямої кишки) або калу виробляють з двох причин: з метою ідентифікувати звичайні бактеріальні патогени, наприклад сальмонели, шигели, і визначити переважну флору кишечника у хворих з ослабленим імунітетом, у яких нормальна флора може набути патогенних властивостей. Необхідно пам`ятати, що в калі містяться переважно анаеробні мікроорганізми, а звичайне бактеріологічне дослідження дозволяє виявити переважно аеробні. При захворюванні нормальна кишкова флора в значній мірі замінюється патогенною, в зв`язку з чим полегшується виділення останньої. Однак навіть в цих умовах необхідно використовувати селективні середовища, що затримують зростання супутньої мікрофлори.
В останні роки число патогенних мікроорганізмів, які можуть бути присутніми в калі, помітно збільшилася. До них відносяться кампілобактерії, иерсинии і клостридії (табл. 9-1). У певних епідеміологічних умовах необхідно досліджувати кал на холерний і парагемолітічеських вібріони, виробляючи для цього посіви на спеціальні живильні середовища.

Таблиця 9-1. Деякі патогенні мікроорганізми для культивування яких потрібні спеціальні поживні середовища

Дослідження виділень з носоглотки, зіву і шкіри. Сухий ватяний тампон із спеціального матеріалу (водорості) найбільш зручний для отримання патологічного матеріалу з шкіри і зі слизових оболонок. Оскільки при висиханні патогенні мікроорганізми швидко руйнуються, тампони з біологічними пробами необхідно негайно помістити в щільно закриті пробірки, які в свою чергу поміщають в переносні штативи.
Інтерпретація результатів досліджень культур, отриманих з шкіри і зі слизових оболонок, утруднена, оскільки на них і в нормі знаходиться різноманітна мікрофлора. Деякі мікроорганізми розцінюються як безумовно-патогенні, наприклад збудники дифтерії, коклюшу, гонореі- інші, наприклад стрептококи, стафілококи, збудники грипу, нейсерії, в залежності від конкретних клінічних обставин можуть бути розцінені як патогенні, непатогенні або ж тільки як показники бактеріоносійство. У той же час деякі мікроорганізми, наприклад Branhamella catarrhalis, рідко стають патогенними. Не слід занадто категорично заперечувати взаємозв`язок мікрофлори верхніх і глибоких відділів дихальних шляхів при захворюваннях легенів. Оскільки мокроту для посіву отримати важко, доводиться вдаватися до аспірації її з трахеї або пункції легкого.
посіви крові. Результати бактеріологічних досліджень крові нерідко бувають найбільш важливими для уточнення етіології інфекційного процесу.
Посів необхідно проводити до початку введення антибіотиків, звертаючи увагу на дотримання стерильності. Після венепункції змінюють голку і розливають кров у пробірки з живильним середовищем кімнатної температури. Якщо перед початком лікування антибіотиками не можна отримати більше однієї проби, то загальна кількість крові повинно бути достатнім, т. Е. У новонародженого забирають 10 мл, у дорослої людини - 60 мл і відповідно пропорційно меншу кількість у осіб проміжного віку. У кожну 50-міллілнтровую колбу поміщають не більше 5 мл крові (для руйнування присутнього в ній пеніциліну деякі бактеріологи рекомендують додавати пеніциліназу). В даний час в поживні середовища вводять сульфонат поліенетанола для попередження згортання її та інактивації лейкоцитів. У деяких пробірках середу збагачують С02 для вирощування анаеробних мікроорганізмів. При виявленні зростання посів необхідно повторити, для того щоб визначити: 1) чи буде успішним лікування, якщо хворий вже почав приймати антібіотікі- 2) чи не є зростання результатом забруднення середовища пепатогеіпим мікроорганізмом- 3) залишається чи мікроорганізм в крові, якщо хворий ще не почав отримувати антибіотики.
Особливої аналізу потребує питання, чи стосується виділений мікроорганізм до істинно патогенним або ж він являє собою результат випадкового забруднення матеріалу під час взяття проби, оскільки зазвичай непатогенні мікроорганізми можуть викликати захворювання у осіб з порушенням імунітету,
Дослідження спинномозкової рідини. Отриману при люмбальної пункції або з шлуночків мозку спинномозкову рідину (СМР) необхідно зібрати в стерильні ємності і негайно транспортувати в лабораторію. У лабораторії СМЖ центрифугируют з метою осадження мікроорганізмів. При фарбуванні осаду по Граму визначають бактеріальну або вірусну природу менінгіту, проте враження, отримане при дослідженні мазків, не повинно обмежувати лікування. Помилки можливі навіть у досвідчених фахівців, тому краще призначати препарати широкого спектру дії, особливо при загрозливому життя захворюванні, а не чекати результатів посіву СМЖ. Коагуляція містить кров або плазму СМЖ ускладнює виявлення мікроорганізмів і підрахунок клітин. У цьому випадку частина її слід помістити в пробірку з оксалатом. Велике число мікроорганізмів дозволяє проводити серологічне дослідження з використанням антитіл до Н. influenzae або різним типам менінгококів і пневмококів. До швидких і точних діагностичних методів відносяться кількісний іммуноелектрофорез і реакція латекс-аглютинації. Для визначення антигенів, таких як П. influenzae типу b, N. meningitidis, S. pneumoniae, стрептокок групи В і Е. coli К1, може бути використана специфічна антисироватка. Якщо етіологія менінгіту залишається неясною, слід за допомогою забарвлення на кислотостійкі форми мікроорганізмів і посіву виявити мікобактерії туберкулеза- рекомендується також провести проби на криптококові антигени і посіяти СМЖ з метою виявити гриби.
посіви сечі. Для посіву і підрахунку колоній необхідно взяти середню порцію сечі або отримати її за допомогою катетера або надлобковій пункції. Останній метод більш точний, тому що дозволяє отримати менш забруднену сечу.
При вмісті в 1 мл середньої порції сечі, отриманої після відповідної підготовки, більше 105 мікроорганізмів можна констатувати, а в кількості 104-105 лише припускати розвиток інфекції. Це відноситься тільки до неускладнених сечовим інфекціям, викликаним грамнегативними кишковими паличками. Інші критерії використовують відносно грампозитивних і дріжджоподібних мікроорганізмів у хворих, які страждають мочеизнурением, хронічний пієлонефрит або отримують антибіотики. Незважаючи на малу ймовірність захворювання осіб, в сечі яких визначається невелике число бактерій, в будь-якому випадку необхідно проводити повторні посіви і проводити клінічне обстеження перед вирішенням питання про метод лікування. Неадекватно велике число мікроорганізмів часто виявляють у сечі дівчаток, взятої без достатньої попередньої підготовки і протягом тривалого часу залишалася при кімнатній температурі. У подібних випадках повторні дослідження не підтверджують бактериурии. Посів необхідно проводити з великою ретельністю, так як хибнопозитивні результати можуть зумовити тривале лікування хворого антибіотиками.
Ексудати і транссудату. Вміст абсцесів, внутриплевральное випіт, внутрішньосуглобова рідина, виділення з уретри, інші ексудати і транссудату можуть бути посіяні безпосередньо на агар. Необхідно якомога швидше доставляти зібраний матеріал в лабораторію. Крім дослідження мазків і посіву, в ексудатах і транссудату необхідно визначати рівень цукру і склад клітин з тих же причин, що і при аналізі спинномозкової рідини.
Забарвлення мазків по Граму. З усіх рідин, спрямованих на бактеріологічне дослідження, в тому числі і осад сечі, повинні бути приготовлені мазки, пофарбовані по Граму. Бактериоскопия мазків забезпечує отримання швидкої відповіді і, крім того, допомагає в подальшій трактуванні результатів посіву.
Спеціальні методи культивування. Більшість патогенних мікроорганізмів можна культивувати на кров`яному і шоколадному агарі і на середовищі Мак-Конки. В останні роки в зв`язку з більш широким використанням середовищ з низьким відновним потенціалом все частіше стали виділяти анаеробні мікроорганізми. Тіогліколатовий бульйон, прекрасне середовище для звичайного посіву, не сприяє зростанню строго анаеробної флори. Проби, в яких передбачаються анаеробні збудники, повинні транспортуватися в герметичному шприці або спеціальному тампони, вміщеному в безкисневому середу. У деяких випадках за клінічними показаннями слід використовувати спеціальні середовища (див. Табл. 9-1). Припущення клініциста про можливе збудника повинні бути повідомлені в лабораторію заздалегідь. Якщо в лабораторії лікарні відсутній відповідне середовище, необхідно виробляти ці дослідження в іншій лабораторії.
флюоресцентний метод. Метод флуоресцентних антитіл значно розширив можливості бактеріоскопічної діагностики. В даний час доступні різні специфічні антисироватки для багатьох патогенних мікроорганізмів. У них молекули антитіл міцно пов`язані з флюоресцентним барвником.
Мазок, що містить передбачуваний мікроорганізм, обробляють відповідної сироваткою і микроскопируют в ультрафіолетовому світлі. При цьому навколо патогенного мікроорганізму концентруються молекули антитіл, обумовлюючи яскраву флюоресценцію. Цей метод дозволяє виявити мінімальне число збудників в препараті. Описана техніка прямої флюоресценції можлива тільки в присутності антитіл, мічених флюоресцеином. В іншому випадку вдаються до більш складній техніці непрямий флюоресцентної бактеріоскопії, що полягає в наступному. По-перше, досліджуваний мазок покривають немічених специфічної антисироватки, що дозволяє фіксувати антитіла, а їх надлишок (нефіксовані антитіла) змиваються. По-друге, до мазку додають гамма-глобулін, мічений флюоресцентним барвником і містить антитіла до сироватці тварин, від яких була отримана антисироватка. При цьому мічені антитіла фіксуються на специфічному комплексі мікроорганізм - антитіло. Метод флуоресцентних антитіл використовують особливо для ідентифікації мікобактерій туберкульозу, збудників коклюшу, дифтерії, гонореї, стрептококів групи А, легіонел та ін. Для виявлення мікобактерій туберкульозу вдаються до методу без використання антітел- мазки при цьому фарбують аураміп-родаміном, вибірково захоплює мікобактеріями, і микроскопируют в ультрафіолетовому світлі. Це фарбування більш чутлива, але менш специфічна, ніж звичайна, заснована на властивості мікобактерій до кислотоустойчивости.
Шкірні проби. Основним показанням для проведення шкірних проб залишається підозра на мікобактеріальну інфекцію.
Очищені білкові похідні мікобактерій туберкульозу (PPD-S) та інших мікобактерій (PPD-B, PPD-Y і ін.) Самі по собі не сенсибилизируют макроорганизм, але здатні виявити підвищену чутливість його, що в багатьох випадках полегшує і прискорює діагностику. Негативні результати шкірних проб при підозрі на туберкульоз можуть вказувати на алергію, в зв`язку з чим необхідно провести додаткові проби з набором антигенів, до складу якого входять антигени до грибів. Шкірні тести можна проводити і при грибкових інфекціях, але вони мають значення швидше для епідеміології, ніж для діагностики окремих випадків захворювання.
серологічні реакції. Типування бактерій часто проводять за допомогою реакції аглютинації зі специфічною сироваткою (іноді прикріпленою до частинкам латексу). Визначення титру антитіл в сироватці має значення лише при деяких бактеріальних інфекціях, в тому числі викликаних стрептококами, сальмонелами, бруцеллами, легионеллами і лептоспірозом.
При стрептококової інфекції антитіла проти екзотоксину досліджують Для того, щоб визначити, чи дійсно вони утворилися під час останньої інфекції.

Методи з використанням скла типу стрептозіма

Wampole дозволяють швидко і точно виявити антитіла до численних екзотоксинах. Відносно сальмонел (тест Відаля) антитіла можуть бути виявлені окремо для кожної групи (А, В, С, D і ін.) І для джгутикових і соматичних. Точність серологічних тестів залежить від якості антисироваток, які необхідно періодично контролювати. При проведенні серодиагностики доводиться враховувати можливість перехресної чутливості і присутність антитіл після попередніх контактів зі збудником. У будь-якому випадку достовірним вважають лише 4-кратне збільшення титру антитіл до відповідного збудника і більше.

Проби на чутливість до антибіотиків. У більшості лабораторій досліджують чутливість мікроорганізмів до антибіотиків. Відповідна інформація вкрай необхідна лікарям-клініцистам для вибору засоби лікування, але вони не завжди знайомі з тим, як запросити максимальну інформацію в лабораторії і яким чином інтерпретувати її.
До найбільш поширених методів визначення чутливості до антибіотиків відноситься метод Кірбі - Бауера, при якому на пластинки засівають стандартизоване число мікроорганізмів. Шматочок фільтрувального паперу, просочений антибіотиком, поміщають на пластинку і вимірюють зону пригнічення росту навколо кожного шматочка (диска). Концентрація антибіотика в паперовому диску приблизно відповідає створюваному рівню препарату в крові, а діаметр зони пригнічення свідчить про чутливість до нього мікроорганізму. Повинен бути відомий стандартний розмір зони, що вказує на чутливість або стійкість до антибіотика.
Однак метод дисків відрізняється рядом недоліків. Так, дослідження геометричних показників дозволили встановити, що різниця між зонами пригнічення росту в 1 мм відповідає 17%, що еквівалентно 17% активності відповідного антибіотика. Отже, навіть дуже невелика різниця в діаметрі зон переростає в значні відмінності активності препаратів. У зв`язку з цим вкрай важливе значення набувають точність вимірювання і швидкість дифузії антибіотика.
Для більш точного визначення чутливості до антибіотиків все ширше застосовуються методи розведення розчинів в пробірці або мікротітрованія на стеклах. Антибіотик послідовно розводять живильним середовищем в певних обсягах, приблизно відповідають рівню його в крові. Потім в кожну пробірку або на платівку поміщають певну кількість культури мікроорганізму (близько 105 особин), варьирующее в залежності від його особливостей та обсягу живильного середовища. Через 24 год пробірки або пластинки перевіряють, визначаючи в них помутніння: прозорість розчину в першій пробірці свідчить про мінімальну концентрації антибіотиків, що надає бактеріостатичну дію на збудника (мінімальна інгібуюча концентрація - МІК). Потім матеріал з пробірок або з пластинок висівають на щільну агарове середовище для підрахунку числа колоній. Концентрація антибіотика, нищівна 99,9% мікроорганізмів, вважається мінімальною бактерицидної (МБК).
Крім технічних погрішностей, помилки можуть бути обумовлені неправильною інтерпретацією отриманих результатів клініцистом. Інтерпретувати їх необхідно тільки при обліку фармакокінетики антибіотика. У певних клінічних ситуаціях, наприклад, при ендокардиті або остеомієліті) необхідно використовувати насамперед бактерицидні, а не бактериостатические кошти. При гематогенних інфекціях, зумовлених стафілококами, чутливими до еритроміцину і напівсинтетичних пеніцилінів, слід призначати лікування пеніциліном. Необхідно брати до уваги також токсичність лікарських препаратів і віддавати перевагу менш токсичним. В кінцевому підсумку досягнутий рівень антибіотиків в крові і тканинах є показником клінічної ефективності його. Так, поліміксин В пригнічує ріст бактерій на великій площі тільки in vitro- в клініці ж найбільш висока з переносите доз не забезпечує досить високого рівня його в крові. На противагу цьому карбенициллин, що не проявляє активності in vitro, виявляється високоефективним in vivo, оскільки в крові створюється висока концентрація його і відзначається синергізм дії з іншими антибіотиками, наприклад з гентаміцином.
Бактериостатическую і бактерицидну активність антибіотика в сироватці або інших біологічних рідинах організму хворого можна виміряти. Для цього збудник, виділений від хворого, поміщають в сироватку цього хворого різного розведення, отриману через певний час після введення антибіотика. Точно концентрацію антибіотика в крові можна визначити за допомогою хімічного або мікробіологічного методу, коли використовують набір штамів бактерій з точно відомою чутливістю до відповідного препарату. Ці вимірювання необхідно проводити при лікуванні аміноглікозидами хворих з нирковою патологією.
Значення зазначених методів підтверджується даними, отриманими при спостереженні за хворими з стрептококовим ендокардитом. Перш за все визначають чутливість виділеного збудника до пеніциліну G. При чутливості до нього мікроорганізмів вимірюють бактериостатическую і бактерицидну активність препарату через 30 хв і 6 годин після його введення. Бактерицидну дію препарату відзначається через 30 хв при розведенні крові не менше 1: 8 і через 6 год - в розведенні 1: 2.

Відео: Зараження через кров