Методи реєстрації пепсіно-, муцінообразующей і моторно-евакуаторної функцій шлунка - виразкова хвороба шлунка

Велике значення в оцінці функціональної активності шлунка при виразковій хворобі має дослідження в шлунковому соку концентрації і дебіту загального і активного пепсину (протеолітичної активності).
Основні методи визначення протеолітичної активності шлункового соку засновані на визначенні його здатності перетравлювати білковий субстрат - 2% розчин сухої плазми (В. Н. Туголуков, 1965) або звурдженого дії на молоці (Н. П. П`ятницький, 1968). Ці методи є хоча і легковідтворюваною і широкодоступними, але вельми неточними, оскільки на підставі даних, отриманих цими методами, можна судити лише про загальну перетравлює здібності шлункового соку хворого в порівнянні зі здоровими, а не про концентрацію і дебите ферменту в шлунковому соку. Найбільш точним в цьому сенсі є гемоглобінового метод (J. Anson, М. Mirsky, 1932) і його модифікація «П. М. Старицької та Е. Г. Моргун (1972).
В основі методу лежить здатність розщеплювати поліпептидний ланцюг гемоглобіну із звільненням тирозину, кількість якого прямо пропорційно концентрації в розчині активного пепсину. Концентрація тирозину визначається колориметрически по інтенсивності забарвлення розчину.
Реактиви: кристалічний пепсін- 0,5% HCl- 2,5% хлористоводневий гемоглобін 0,3 і. HCl- 0,3 і. ТХУ- 0,5 і. NaOH- реактив Фолина.
Приготування гемоглобіну: 1-2 л цитратной або дефибринированной крові великої рогатої худоби центрифугируют при 5000 об / хв. Плазму відсмоктують. До осадку еритроцитів додають рівний об`єм 1% розчину NaOH, центрифугують, відсмоктують надосадову рідину. Центрифугують 2 рази.

3. Визначення кількості гемоглобіну в розчині

Маса розчину JHb 100 28-10
6-X
Х = 21,4%
Розчин гемоглобіну містить 21,4% білка Hb. Хлорнстводородний Hb в 2,5% концентрації готують:

21,4 мл 2,5% Hb.
Додають 1/4 (за обсягом) 0,3 і. HCl. Отримують 26,75 мл 2,5% хлористоводневої Hb.

Осад еритроцитів поміщають в целофан і в холодну воду на добу в холодильник. Відбувається діаліз. Розчин гемоглобіну розливають у флакони по 5-10 мл і заморожують. Розморожений розчин гемоглобіну придатний 1 день.
Визначення концентрації гемоглобіну: фільтрувальну папір розміром 10X10 см зважують на торзіонних вагах, змочують розчином гемоглобіну і знову зважують, наколюють на гачок і висушують в сушильній шафі протягом 10 20 хв при 100сС. По різниці маси вологого і сухого паперу визначають кількість гемоглобіну в розчині (табл. 3).
Приготування реактиву Фолина за методом Фолина-Чіопалтеу. Титр 1,95-2,4. 1 мл розчину розводять водою до титру, потім додають подвійний обсяг Н20.
Хід реакції визначення пепсину в шлунковому соку. У широкі короткі пробірки вливають по 1 мл соку і по 2 мл 0,5% HCl. Інкубують на водяній бані при температурі 25 ° С. Тут же инкубируют розчин 2,5% хлористоводневої Hb. Через 10 хв в кожну пробірку додають по 5 мл Hb і знову інкубують 10 хв. Потім в кожну пробірку додають 10 мл 0,3 і. ТХУ, пробірки струшують і їх вміст пропускають через фільтрувальну папір.

Паралельно ставлять контроль. До 1 мл соку з 2 мл 0,5% HCl додають 10 мл 0,3 і. ТХУ і через кілька хвилин 5 мл розчину- струшують і фільтрують. Прозорий безбарвний фільтрат в кількості 25 мл поміщають в ерленмейеровскую колбу об`ємом 50 мл, додають 10 мл 0,6 і. NaOH і 3 мл реактиву Фолина. Через 5 хв проби і контроль колориметрируют на ФЕК при червоному фільтрі в кюветі обсяг 5 мм. Від оптичної щільності проби віднімають оптичну щільність контролю. Кількість пепсину визначають по калібрувальної кривої в мкг на 1 мл соку.
Побудова калібрувальної кривої (табл. 4). Для. приготування розчину пепсину 20 мг кристалічного препарату розтирають у ступці з невеликою кількістю 0,5% HCl, кількісно переносять в мірну колбу і доводять 0,5% HCl до 100 мл. 1 мл такого розчину містить 200 мкг пепсину.
Контроль аналогічний шлункового соку, замість соку - 1 мл розчину- пепсину.
Придатний тільки кристалічний (а не фармакопейний) пепсин, активність якого відповідає кількості пепсину в шлунковому соку і не перевищує кількості білка в ньому.

де Dp- дебіт пепсину в міліграмах, V - об`єм шлункового соку в міллілітрах- Р - концентрація пепсину в мілліграмм- відсотках.
За нашими даними (І. І. Дегтярьова. 1983- І. І. Дегтярьова і співавт., 1983, 1987, 1992-1994- І. І. Дегтярьова, В. Є. Кушнір, 1983), протеолітична активність шлункового соку у здорових людей коливається при гистаминовой стимуляції від 10 до 20 мг%, становлячи в середньому 16,4 мг% ± 0,55 мг% - при інсулінової стимуляції концентрація активного пепсину в шлунковому соку здорових коливається від 12 до 28 мг%, становлячи в середньому 19, 2 мг% ± 0,72 мг%.
У хворих на виразкову хворобу та з передвиразковий станом (хронічним первинним гастродуоденіт) середні цифри протеолітичної активності шлункового соку перевищують такі у здорових і складають (25,7 ± 1,6) мг% (межі коливань 12-60) при гистаминовой стимуляції і (23, 7 + 1,03) мг% (межі коливань 15-68) при інсулінової стимуляції шлункової секреції. У хворих з передвиразковий станом протеолітичнаактивність шлункового соку в середньому дорівнює (24,9 ± ± 1,2) мг% (межі коливань 15-42) при гистаминовой стимуляції і (26,3 ± 0,9) мг% (межі коливань 14 -50) при інсулінової стимуляції шлункової секреції.
Таким чином, як свідчать наші дані, протеолітична активність шлункового соку у хворих на виразкову хворобу та з передвиразковий станом підвищена. Однак, як це видно з розкиду абсолютних цифр концентрації активного пепсину шлункового соку у хворих на виразкову хворобу та з передвиразковий станом, при тяжкому перебігу виразкової хвороби і виразкової хвороби шлунковоїлокалізації абсолютні цифри протеолітичної активності залишаються в межах норми, а іноді навіть трохи знижені.
Дебіт протеолітичної активності вічісляют за формулою:

При дослідженні шлункового соку у хворих на виразкову хворобу багатьма авторами виявлено підвищення активності протеолітичних ферментів. І. Л. Янсон (1975) у хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки, що супроводжується гіперацидні шлункового соку, виявила підвищення активності протеолітичних ферментів до введення гістаміна- після введення гістаміну у хворих з гіперсекрецією шлунка, але без виразки протеолітичнаактивність різко зростала, в той час як у хворих з виразкою вона різко падала. На думку автоpa, таке зниження активності шлункових ферментів можна пояснити збільшенням кількості секрету. Однак існує і протилежна думка (J. Rudick, H. D. Jonowitz, 1974), що гістамін, так само, як гастрин, інсулін і холінергічні стимулятори, збуджує кислотообразование і секрецію пепсину. Відомо, що гастрин і гістамін стимулюють вироблення пепсину в меншій мірі, ніж секрецію HCl. При дослідженні впливу атропіну на шлункову секрецію (І. JL Янсон, 1975) з`ясувалося, що атропін знижує виділення секрету і HCl, але знижує протеолітичної активності ферментів. Автор вважає, що протеази шлункового соку грають вирішальну роль в утворенні пептичних виразок, тому не можна не рахуватися зі збільшенням їх активності і концентрації натще, що може бути шкідливо для шлунка. За даними цього автора, отримані натщесерце порції шлункового соку у хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки мають найвищу протеолітичної активністю в порівнянні з такими у хворих з вираженою гіперацидні, але без виразки, а тим більше у здорових. Допускається також, що в шлунку відбуваються якісні або кількісні зміни спектра протеолітичних ферментів (пепсину). Деякі дослідники визнають можливість патологічного зміни структури самих протеолітичних ферментів і зміни цих співвідношень в їх групах. Так, J. Rudick, Н. D. Jonowitz (1974) встановили генетичний поліморфізм пепсиногенов і зв`язок з виразковою хворобою агресивних пепсиногенов першої групи V фракції. На думку авторів, це пов`язано з недостатністю простого аутосомного рецесивного гена. Про появу патологічної форми пепсину, який виявляє свою активність при pH 7,4 (тканинне pH), повідомляє в своїх роботах Н. Ш. Аміров (1974). Н. Veen, L. Hollinger (1947) вважають, що не можна не враховувати відщеплення пептидів від молекули ферменту при переході в активний стан і пепсіноінгібірующего їх дії. Чим інтенсивніше відбувається цей процес, тим більше утворюється натуральних інгібіторів шлункових протеаз, а саме: концентрація цих інгібіторів і визначає кількість активних ферментів. В даний час існує також думка (І. JI. Янсон, 1975), що виразкова хвороба дванадцятипалої кишки з тяжким перебігом не супроводжується високою активністю шлункових протеаз. Автор пояснює це захисною реакцією, спрямованої на збільшення концентрації пригнічують компонентів з метою виключення високої концентрації протеолітичної активності шлункового соку. Однак це припущення потребує подальших доказів, оскільки дані наших досліджень (І. І. Дегтярьова і співавт., 1982- І. І. Дегтярьова, 1983 І. І. Дегтярьова, В. Є. Кушнір, 1983 І. І. Дегтярьова , І. Н. Старостенко, 1988- I. Degtjaryova і співавт., 1988, 1991, 1992 Н. В. Харченко, 1993), отримані при обчисленні нових показників (коефіцієнтів агресивності пепсину і захисту шлункового соку), свідчать про те, що навіть знижені абсолютні цифри протеолітичної активності шлункового соку у хворих на виразкову хворобу та з передвиразковий станом є вкрай високими для таких хворих, тому в період рецидиву і в міжрецидивний період з метою профілактики загострень необхідно призначати препарати з антіпептіческой механізмом дії, що зв`язують активний пепсин в порожнині шлунка і стимулюючі синтез захисних білків слизу покривними епітеліоцитами, оскільки шлункові муцини також пов`язують активну фракцію пепсину.
Протеолітичнаактивність, на думку С. Н. David (1974), J. Rudick, Н. D. Jonowitz (1974), не завжди має певний характер, тому не завжди представляє діагностичну цінність при виразковій хворобі.
На клінічне значення пепсину-кислотних співвідношень в шлунковому вмісті при виразці дванадцятипалої кишки вказують Н. А. Скуя і А. Я. Данілос (1973). Автори прийшли до висновку, що у хворих на виразку дванадцятипалої кишки в залежності від тяжкості клінічного перебігу хвороби спостерігаються різні співвідношення кислотно-і ферментовиделенія. У початкових стадіях розвитку виразки дванадцятипалої кишки спостерігається збудження ферментовиделітельной клітин, що дає високий базальний пепсину-кислотний індекс, який має діагностичне значення. Прогноз при вже діагностованою хронічній виразці дванадцятипалої кишки у хворих з малим базальним пепсину-кислотним індексом (ВПК) поганий. За допомогою ВПК, на думку авторів, можна прогнозувати клінічний перебіг виразкової хвороби.
Дані Ц. Г. Масевича і В. А. Горшкова (1976) також свідчать про те, що розвиток виразкових дефектів шлунка і дванадцятипалої кишки пов`язане з рівнем протеолітичної активності шлунка. Величина останньої залежить від взаємодії ендо-. і екзогенних факторів: обсягу, сокогонних і буферних властивостей їжі, інтенсивності та тривалості секреторного відповіді, швидкості евакуації вмісту шлунка в дванадцятипалу кишку, депресорних впливів привратниковой печери (антрума) і дванадцятипалої кишки на секреторну функцію шлункових залоз. При вивченні интрагастрального протеолізу автори встановили високу протеолітичну активність шлункового соку при виразковій хворобі, яка під впливом лікування (атропіну сульфатом, Вікалін) не завжди знижувалася, а в 1/3 випадків навіть підвищувалася. Такі дані вказують на необхідність фармакологічної корекції підвищеної протеолітичної активності антіпептіческой засобами.
Вивчення интрагастрального протеолізу В. А. Горшковим (1977), Ц. Г. Масевич і співавторами (1979) показало, що протеолітична активність при виразковій хворобі значно вище, ніж в витягнутому шлунковому соку. Інтрагастральний протеолиз при локалізації виразки в шлунку не відрізняється від контрольних показників, при виразці дванадцятипалої кишки - перевищує їх як в травний, так і в межпіщеварітельний період.
Найбільша відмінність у величині интрагастрального протеолізу у хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки і у здорових виявляється при нормальній кислотності шлунка. У хворих на виразкову хворобу нічний інтрагастральний протеолиз переважає над денним.
Вивчаючи топографію протеолітичної активності шлунка і дванадцятипалої кишки, В. А. Горшков (1980) прийшов до висновку, що можна виділити три зони протеолізу: зону пептического гідролізу білка, перехідну і зону триптичного гідролізу білка. Перша відповідає тілу шлунка, перехідна - антропілоріческому відділу та початкової відділу дванадцятипалої кишки і триптичних - гідролізу в дванадцятипалій кишці.
Отримані дані мають пряме відношення до розуміння патогенезу дуоденальних виразок, походження яких прийнято пов`язувати зі збільшенням кислотно-пептичної впливу на СО кишки. Значна варіабельність протягом зони пептического гідролізу білка у різних пацієнтів наводить на думку, що при визначенні патологічного стану зона пептического гідролізу може зміщуватися в дистальному напрямку, захоплюючи початковий відділ дванадцятипалої кишки. Внаслідок цього протеолітичнаактивність в області цибулини буде зростати, наближаючись до такої в тілі шлунка. В результаті можуть виникнути умови для пептического пошкодження СО дванадцятипалої кишки, що не володіє стійкістю до перетравлюється дії пепсину. Тим більше, що гистохимически виявлено зменшення числа келихоподібних ентероцитів в СО дванадцятипалої кишки і зниження секреції ними сіало і сульфомуцінов, в результаті чого знижуються адаптаційні можливості СО дванадцятипалої кишки і при підвищенні кислотності вмісту дванадцятипалої кишки виникають умови для його шкідливої дії (JI. І. Аруін, В. С. Городинская, 1975).
До додаткових діагностичних тестів, які б підвищення пепсінообразовательной функції шлунка, належить визначення плазмо, або гемопепсіногена біохімічно або пепсиногена I RIA методом, а також уропепсіногена. Як відомо, 99% пепсиногену виділяється в просвіт шлунка, а 1% -у кров і потім виводиться з сечею. За даними А. В. Палія, В. П. Головченко (1973), плазмопепсіноген у хворих на виразкову хворобу був підвищений в порівнянні з контролем у 33 з 37 хворих.
Кількість уропепсіногена, за даними багатьох авторів, підвищується (С. Д. Светова, 1970 В. І. Афаунова, 1968), що також свідчить про підвищення кількості ферментів в сечі хворих на виразкову хворобу дванадцятипалої кишки. Однак прямої кореляції між виділенням уропепсіногена і пепсінообразовательной функцією шлунка не спостерігається, оскільки виділення цього ферменту залежить від ренального фактора (добовогодіурезу, функціонального стану нирок), гормональних порушень коркового речовини надниркових залоз (стероїдні гормони впливають на зміст пепсиногену в сечі).
За даними деяких авторів, при виразковій хворобі рівень протеолітичної активності шлункового соку коливається в досить великих межах - від підвищених до нормальних і навіть знижених цифр (І. І. Дегтярьова і співавт., 1983). Є дані (І. Л. Янсон, 1975, і ін.), Що важкі форми виразкової хвороби з вираженою клінічною картиною захворювання (жорстока біль, диспепсичні явища) іноді протікають на тлі зниженої протеолітичної активності, т. З., За твердженням авторів, тяжкість захворювання не завжди корелює з підвищеним протеолізом шлункового соку.
Ми вважаємо, що настільки суперечливі дані про коливання протеолітичної активності і концентрації пепсину в шлунковому соку обумовлені тим, що протеолітична активність залежить від багатьох причин (локалізації виразкового процесу, тяжкості і давності захворювання і т. Д.). Має значення також і те, що деякі автори, говорячи про концентрацію пепсину в одиниці об`єму шлункового соку, не враховують, що насправді мова йде лише про активної фракції пепсину, про яку вони судять по його протеолітичної активності. Мабуть, для судження про здатність залозистого апарату шлунка виділяти протеолітичні ферменти необхідно враховувати не тільки протеолітичну активність шлункового соку, а й абсолютне (загальне) виділення всіх фракцій пепсину - активних і неактивних, а також визначати їх співвідношення.
Для діагностики виразкової хвороби можна застосовувати і деякі інші методи, які дозволяють ефективно вивчати протективного властивості СО шлунка і дванадцятипалої кишки. Важливе значення має стан слізеобразующіх функції шлунка (А. А. Шептулин, В. X. Василенко, А. Л. Гребенсв, 1987).
Склад шлункового слизу та інтенсивність її секреції можна оцінити за допомогою визначення в шлунковому соку концентрації і загальної продукції гликопротеинов. При цьому велику роль відіграє вивчення змісту в шлунковому соку фукоза, що бере участь у формуванні в`язкості вироблюваної слизу і нейрамінової кислоти, що забезпечує стійкість слизу до протеолитическому дії шлункового соку.
У клініці акад. В- X. Василенко визначали вміст фукози в шлунковому соку цістеінового методом, який заснований на тому, що похідні продукти фукоза, з`єднуючись з гідрохлоридом цистеїну, утворюють речовини, що дають специфічний спектр поглинання на спектрофотометрі. Рівень нейрамінової кислоти вивчався тіобарбітуровую методом, розробленим Н. Warren (1959), в якому специфічний спектр поглинання давали речовини, що утворилися при взаємодії похідних сіалових кислот з тіобарбітурової кислотою. За допомогою даного методу можна визначити загальну продукцію цих вуглеводних компонентів слизу і їх концентрацію в шлунковому соку, що отримується натщесерце, а також в базальних і стимульованих умовах (А. А. Шептулин, 1987). Було встановлено, що у хворих на виразкову хворобу знижується концентрація фукоза і нейрамінової кислоти.
Особливо цей процес був виражений при локалізації виразки в шлунку, у хворих старших вікових груп з важким перебігом виразкової хвороби, множинними виразками, що зловживають алкоголем, які перенесли шлунково-кишкова кровотеча і перфорація виразки.
Таким чином, абсолютний і відносний дефіцит - слизеобразования може бути фактором патогенезу виразкової хвороби і несприятливо відбиватися на перебігу захворювання.
Діагностика стану слізеобразующіх функції шлунка у хворих на виразкову хворобу дозволяє правильно оцінити особливості патогенезу захворювання у даного хворого навіть при низькій секреторної активності шлунка, виявити причини торпидного перебігу захворювання та частого рецидивування виразки, раціонально підійти до вибору лікувального комплексу противиразкових засобів, до складу якого слід включати репаративні препарати, що стимулюють синтез білків слизу в шлунку.
Про зниження слізеобразующіх функції шлунка і дванадцятипалої кишки у хворих на виразкову хворобу можна судити на підставі гістохімічних методів дослідження (В. М. Успенський, 1982).
І. М. Бєлової (1986) встановлено зниження вмісту фукози і гексоз, пов`язаних з білком, в фазі загострення виразкової хвороби і деяке підвищення в фазі ремісії, що може грати певну роль в ослабленні резистентності СО дванадцятипалої кишки при виразковій хворобі.
Існує думка, що розвиток виразкової хвороби і її перебіг пов`язані не стільки зі станом кіслотообразовательной функції шлунка, а й з співвідношенням між кислотністю і секрецією слизу, яка при виразковій хворобі порушується В. М. Успенський, 1982- S. Takemoto і співавт., 1982 ). Найчастіше на тлі підвищеної або нормальної кислотності знижується продукція захисних компонентів слизу, зокрема, ацетілнейраміновой кислоти (Е. Я- Скляров, 1980).
В даний час проводяться численні дослідження, присвячені порушенню синтезу компонентів шлункового слизу, сприяють виразкоутворення (П. Д. Рабинович, Н. І. Домрачева, 1976- А. П. Лінчевська, Д. Кан, 1980 P. D. Rabinowich, 1976).
За даними цих авторів, синтез глікопротеїнів, особливо фукоглікопротеінов, в МОР знижений, а також утруднений їх вихід в порожнину шлунка через порушення композиції вуглеводних гілок. Все це призводить до виснаження захисних механізмів, в результаті чого зменшується стійкість МОР до агресивної дії шлункових протеаз.
Ц. Г. Масевич і співавтори (1980), І. С. Синдаловский (1981) вивчали вплив протеаз шлунка і підшлункової залози на слизові речовини дванадцятипалої кишки при дуоденальної виразці. В результаті встановлено, що протеази шлунка надають більш виражене протеолітичну дію на сіаломуцинів дуоденального вмісту у хворих на виразку дванадцятипалої кишки у порівнянні з контрольною групою. Протеази підшлункової залози надають більш виражене дію на гексози дуоденального вмісту в порівнянні з контрольною групою. Встановлено також, що при впливі певної кількості пепсину на дуоденальний вміст при оптимальному її дії (pH 2) концентрація слизових речовин (сіаломуцинів) і кількість білкових фракцій зменшено і більш виражено у хворих на виразкову хворобу в порівнянні зі здоровими. Все це свідчить про зниження резистентності слизових речовин шлунка і дванадцятипалої кишки при виразковій хворобі.
Білковий склад шлункового соку, в тому числі і білки слизу, пепсину, альбуміни, пептони, зазвичай визначається методом електрофорезу, диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі, хроматографическим способом на ДЕАЕ-целюлозі (І. Л. Янсон, 1975- І. Е. Трубицина , Н. Ш. Аміров, 1977- І. С. Синдаловский, 1981- G. К. Glass і співавт., 1956, 1957) або за допомогою дифузного висолювання (Н. В. Зеленський, 1959).
До теперішнього часу в медичній практиці при дослідженні білків рідин і тканин організму (кров, шлунковий сік, сеча та ін.) Широко використовували метод електрофорезу, запропонований Тізеліус в 1937 р G. К. Glass і співавтори (1956, 1957) розшифрували електрофореграмме білків шлункового соку. У колишньому СРСР дослідження білків шлункового соку методом електрофорезу (на апараті вільного електрофорезу, діскелектрофореза і ін.) Проводили при хронічному гастриті і виразковій хворобі Н. Ш. Аміров і співавтори (1978), А. Г. Бараков і співавтори (1980), при раку шлунка - Ф. М. Ейдельмана (1964), І. В. Касьяненко та співавтори (1974), І. JL Янсон (1975). За допомогою цього методу була уперше визначена білковий спектр шлункового соку, що складається з пепсину (Р), муцинов - білків слизу (М, 1-4), альбуміну і продуктів перетравлення білків соку - пептонов (Х-, У-, Z-фракції) . Метод дозволяє якісно визначати фракції білків шлункового соку і їх зміни в залежності від різних функціональних і патологічних станів шлунка. Метод електрофорезу має ряд недоліків, які призводять до певного відсотку помилок. Для дослідження білків шлункового соку методом електрофорезу необхідно проводити тривалу трудомістку обробку шлункового соку (діаліз соку, лиофилизация, обробка ацетоном, концентрація на сефадексе і т. Д.). При такій обробці внаслідок агрегації можуть змінюватися фізико-хімічні властивості білкових молекул (Ф. М. Ейдельмана, 1964), і це може привести до перекручення істинної інформації про кількісний та якісний склад білків шлункового соку.
Дослідження білків шлункового соку методом електрофорезу займає кілька діб (діаліз, концентрація, разгонка на апараті, забарвлення, висушування, денсітометрірованіе або елюювання). Денсітограмми також потребують тривалої обробці, перш ніж будуть отримані цифрові дані. Для аналізу білків методом електрофорезу необхідно попереднє підвищення концентрації білка в розчині до грам-відсотків. Концентрація соку, а також високий відсоток білків в досліджуваному розчині ведуть до злипання (агрегації) білкових молекул, що ускладнює аналіз показників. Удосконалення лабораторних методів дозволило усунути ці недоліки і визначати білковий спектр методом хроматографічного аналізу та ін.
В даний час широко використовують нові вдосконалені методи електрофорезу (диск-електрофорез в ПАА-гелі і хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі). У наших дослідженнях ми користувалися високоінформативним, зручним для застосування в будь-якій лабораторії і клініці методом дифузного висолювання білків, описаним Н. В. Зеленським (1959).
Метод дифузного висолювання білків застосовували в одиничних випадках для визначення білків сироватки крові і зовсім не використали для дослідження білків шлункового соку при будь-яких захворюваннях. А. Г. Загороднева і співавтори (1977) цим методом вивчали білковий склад шлункового соку у здорових людей.
Ми (І. І. Дегтярьова, 1983 І. І. Дегтярьова і співавт., 1983, 1985, 1987, 1994- І. І. Дегтярьова, С. Н. Старостенко, 1988) вперше використовували метод дифузного висолювання білків шлункового соку з метою діагностики передвиразковий стану, активної фази виразкової хвороби, а також для підтвердження переходу захворювання в стадію ремісії і можливості корекції лікувальних заходів при виразковій хворобі. Метод дифузного висолювання білків заснований на властивості білкових молекул зневоднені під впливом розчину амонію сульфату. При цьому різні білки висаліваются при різній концентрації амонію сульфату, що дозволяє їх розділяти. Дегідратація білкової молекули змінює оптичні властивості розчину, і ці зміни реєструються на фотоелектроколориметри, відкаліброваному по білковим розчинів певної концентрації.
Визначення білків методом дифузного висолювання в порівнянні з визначенням білків загальновідомим методом електрофорезу має ряд істотних переваг:
Можливість визначення білків при концентрації їх в розчині близько 200-250 мг%. Завдяки цьому можна досліджувати нативний шлунковий сік без попереднього концентрування.
Швидкість отримання інформації: весь процес аналізу проби соку (розливання розчину амонію сульфату, нашарування соку, колориметрування і креслення кривої) займає близько 2 ч. Таким чином, через 2 години після отримання проби соку можна дізнатися кількісний і якісний склад знаходяться в ньому білків.
Більш висока, ніж при електрофорезі, точність поділу білкових фракцій. Мала концентрація білка в досліджуваному розчині (200-250 мг%) виключає взаємодію різних білкових молекул між собою. Необхідно відзначити, що застосовуються останнім часом для аналізу білкових розчинів методи поділу в поліакриламідних гелях також передбачають концентрацію білків в досліджуваному розчині не більше 200-250 мг% (К. Davis, 1964). Тільки при такій концентрації білків, використовуючи деякі сучасні методи аналізу білкових розчинів, можна визначити чітку межу між аналізованих фракціями, що дуже важливо для судження про їх кількісний та якісний склад. Автором методу дифузного висолювання білків Н. В. Зеленським (1959) і нами точність отримання кривої оцінювалася шляхом проведення двох паралельних аналізів одного і того ж розчину білків. Розбіжність показань між двома кривими було менше 5%, т. З. менше допустимої в біологічних дослідженнях помилки.
Можливість додаткового визначення коефіцієнтів агресивності пепсину і захисту шлункового соку при діагностиці передвиразковий стану, активної фази виразкової хвороби і оцінки лікувальних заходів (при переході захворювання в стадію ремісії).
Точність і простота постановки, можливість застосування в умовах лабораторії будь-якого гастроентерологічного і загальнотерапевтичного стаціонару. Для дифузного висолювання не потрібно спеціальної апаратури, крім лабораторного посуду і фотоелектроколориметра.
Виходячи з того що нечисленні роботи (І. JT. Янсон, 1975, і ін.), Присвячені вивченню білкового складу шлункового соку при виразковій хворобі, виконані в основному з використанням методу електрофорезу і результати досліджень дозволяють судити лише про якісні зміни в білкових фракціях, в наших дослідженнях використаний простий, але інформативний метод дифузного висолювання (Н. В. Зеленський, 1959), модифікований для визначення білків шлункового соку А. Г. Загороднева і співавторами (1977), що дозволяє судити не тільки про якісні зміни в білковому спектрі (пепсину , білків слизу і т. д.), але і оцінити кількісні відмінності білкових фракцій шлункового соку хворих на виразкову хворобу від таких у здорових осіб.
Використаний для визначення білків шлункового соку метод дифузного висолювання білків опублікований давно, однак не отримав широкого поширення, тому наводимо короткий його опис.
Метод досить простий, але з високою точністю розділяє білки на фракції і визначає їх кількісний склад. Аналіз складу білків в розчині за цим методом проводять наступним чином. В ряд пластмасових стаканчиків об`ємом по 100 мл наливають 0,5 мл розчину амонію сульфату збільшується концентрації - від 0 до 95%. На сольові розчини через тонку голку нашаровуються по 0,5 мл розчину досліджуваного білка. Розчин білка тонким шаром розтікається по поверхні більш щільного сольового розчину. У такому вигляді розчини закривають і залишають до 60 хв на антивібраційної основі при температурі 20- 21 ° С. Через поверхню розділу шарів відбувається дифузія розчину, і білкові молекули дегидратируются. Внаслідок цього у всьому обсязі нашарованого розчину висаліваются білки і оптична щільність розчину змінюється. Різні білки висаліваются при певній мірі насичення амонію сульфату. На фотоколориметрі ФЕК-М, заздалегідь відкаліброваному за розчином білків певної концентрації, реєструється ступінь світлопропускання досліджуваних розчинів. Крива дифузного висолювання має дві калібрувальні осі: вертикальна вісь показує концентрацію білків (% Б), горизонтальна - якісний склад білків і значення концентрації висалівателя (% В). Таким чином, дифузне висолювання дає можливість одночасно визначати кількісний і якісний склад білків.
При використанні цього методу пепсину висаліваются між 20 і 60% насичення висалівателя (амонію сульфату). Максимальна точка підйому кривої на 60% насичення висалівателя відображає кількість всіх пепсину, що знаходяться в соку. У середній частині шкали - від 60 до 80% насичення - висаліваются білки слизу і сироватковий альбумін, на останніх точках насичення висалівателя (після 80%) - поліпептиди (продукти розщеплення високомолекулярних компонентів шлункового соку).
Перш ніж перейти до викладу власних даних, слід звернути увагу на те, що в роботах, присвячених вивченню перетравлює здібності шлункового соку, визначали активність пепсину і на підставі цього судили про концентрацію пепсину в соку. При такому підході встановлюють не сумарна кількість виділених пепсину, а лише активну частину ферменту. Визначення обох показників загального сумарного пепсину (активного і неактивного кількості ферменту) і його активної фракції (протеолітичнаактивність) і їх співвідношень необхідно для оцінки стану шлункових залоз і порушення їх діяльності у хворих на виразкову хворобу.
Нами встановлено, що виразкова хвороба і передвиразковий стан супроводжуються різким зниженням у всіх порціях соку (натще, базальном і стимульованому гистамином і інсуліном) кількості загального білка в середньому на 50%, кількості сумарних пепсину (активних і неактивних) в середньому на 50%, так само як і інших білкових фракцій шлункового соку: білки слизу + альбуміни - в середньому на 60%, пептони-в середньому на 50%, що можна пояснити зниженням при даному захворюванні белковосинтетической функції МОР, катаболической спрямованістю процесів в ній, обумовлених порушенням нейротрофічної регуляції з переважанням парасимпатичної імпульсації і порушенням мікроциркуляції в гастродуоденальної зоні. Отримані дані узгоджуються з результатами проведених нами електронно-мікроскопічних досліджень, які свідчать про посилення катаболічних процесів, зниженні синтезу білка і порушення мікроциркуляції при виразковій хворобі, а також амінокислотного фонду сож-
Отримані дані про виражене зниження кількості всіх білкових фракцій шлункового соку при виразковій хворобі вказують на патогенетичне значення при цьому захворюванні зниженої здатності МОР синтезувати білки, що необхідно враховувати при призначенні лікувальних заходів хворим на виразкову хворобу.
Ще більше зниження кількості загального білка і його фракцій у всіх порціях соку (за винятком порції після інсулінової стимуляції) встановлено в гострому спостереженні на тлі часткової фармакологічної блокади блукаючого нерва, яку викликали лікарської комбінацією малих доз холиноблокаторов іспазмолітиків, часто вживаних, враховуючи патогенез захворювання, в лікувальних комплексах.
Незважаючи на те що після курсового лікування хворих на виразкову хворобу холиноблокаторами встановлена деяка активація белковосінтетіческой процесів в СОШ (у порівнянні з активною фазою захворювання), рівень останніх далеко не досягає нормальних величин, а в період максимально вираженого дії холиноблокаторов в гострому спостереженні в якийсь період часу навіть спостерігається пригнічення білкового синтезу. Для стимуляції репаративних процесів в СО гастродуоденальної зони до застосованих при виразковій хворобі лікувальні комплекси необхідно включати крім антихолинергических, анаболічні засоби.
Звертає на себе увагу той факт, що при інсулінової стимуляції шлункової секреції у хворих на виразкову хворобу в гострому спостереженні на тлі фармакологічної блокади блукаючого нерва концентрації загального білка шлункового соку і окремих його фракцій не відрізнялися один від одного. Відсутність зниження рівня загального білка та окремих фракцій білків шлункового соку у хворих на виразкову хворобу на тлі блокади блукаючого нерва при інсулінової стимуляції можна пояснити вираженим анаболічним дією інсуліну на білковий обмін- останнім перекриває інгібуючу дію на синтез білка блокади блукаючого нерва. Отримані дані вказують на доцільність включення препаратів анаболічного дії, зокрема, невеликих доз інсуліну, в лікувальні комплекси, що застосовуються при виразковій хворобі, особливо на тлі антихолінергічних препаратів.
Незважаючи на сформовану думку про те, що протеолітична активність шлункового соку при виразковій хворобі підвищена, є дані, що виразкова хвороба може протікати на тлі нормальної або навіть зниженою протеолітичної активності.
Нами встановлено, що у хворих на виразкову хворобу протеолітичнаактивність шлункового соку в працях натщесерце, базальної і стимульованої гіетаміном і інсуліном в середньому була підвищена, складаючи від 33 до 54%, а її дебіт збільшений більш ніж в 2 рази. Ще більше збільшення протеолітичної активності відзначено в гострому спостереженні на тлі часткової фармакологічної блокади блукаючого нерва (від 47 до 74%). Однак у частини хворих абсолютні цифри протеолітичної активності залишалися в межах нормальних величин, а у деяких були навіть трохи знижені. Як уже зазначалося, концентрація сумарних пепсину (активних і неактивних фракцій) в шлунковому соку хворих на виразкову хворобу, а також в гострому спостереженні на тлі блокади блукаючого нерва була різко знижена (в середньому на 50-60%). Таким чином, нами встановлено, що при виразковій хворобі в активній фазі, а також в гострому спостереженні на тлі фармакологічної блокади блукаючого нерва найчастіше збільшувалася кількість активних пепсину (іноді воно залишалося в межах норми або було кілька зниженим) при вираженому зниженні кількості загальних пепсину. Останнє проявляється різким збільшенням у всіх хворих на виразкову хворобу, а також в гострому спостереженні на тлі фармакологічної блокади блукаючого нерва в 2-3 і більше разів виведеного нами коефіцієнта агресивності пепсину (К4), що представляє собою відношення протеолітичної активності (т. З. Активної частини пепсину ) до загального його кількості. Отже, Ка показує, яка частина з виділених пепсину знаходиться в активному стані, а також побічно вказує на зниження белковосінтетіческой процесів в СОШ і концентрації факторів інактивації пепсину, зокрема, білків слизу.
Відомо, що перетворення пепсиногену в пепсин в шлунковому соку відбувається під дією HCl, відщеплюється дрібні пептиди, які мають пепсіноінгібірующім дією. Оскільки при виразковій хворобі різко зменшувалася кількість фракцій пепсину, то і концентрація пептидів невелика, а її величина, до певної міри, визначає пепсіноінгібірующій ефект. Кількість білків слизу, що зв`язують частину активного пепсину, при виразковій хворобі також знижено. Якщо врахувати обидва ці чинники, то стає зрозумілим, що, незважаючи на загальне низький вміст пепсину в шлунковому соку, велика частина його знаходиться в активному стані. У здорових ж, як показали результати наших досліджень, протеолітичної активністю володіє лише 1/3 виділеного пепсину.
Проведені нами дослідження шлункового соку у хворих на хронічний гастрит, що супроводжується зниженою кислотної продукцією шлунка, а іноді і гістамінрезістентная ахлоргидрией, показало, що у них також спостерігалося зниження в шлунковому соку кількості сумарних пепсину в середньому на 32%, при різкому пригніченні протеолітичної активності в середньому на 74%. Все це призводило до вираженого зменшення (в 3-4 рази) в порівнянні зі здоровими Ка пепсину.
При дослідженні протеолітичної активності, кількості загальних пепсину та Ка пепсину у хворих з передвиразковий станом були виявлені ті ж зміни, що і у хворих на виразкову хворобу: підвищення протеолітичної активності шлункового соку (від 30 до 60%) на тлі вираженого зниження сумарної кількості пепсину в середньому на 58%, що призводило до різкого збільшення Ка пепсину - в 2,9-3,7 рази в порівнянні з нормою. Слід зазначити, що якщо протеолітичнаактивність шлункового соку в активній фазі виразкової хвороби підвищувалася, то протеолітичнаактивність у хворих на виразкову хворобу в стадії неповної ремісії і у здорових часто перебувала на однаковому рівні і не уявляла діагностичної цінності. Кількість же пепсину при виразковій хворобі різко знижений як в активній фазі захворювання, так і в стадії ремісії. Ка пепсину як в активній фазі захворювання, так і, в меншій мірі, в стадії ремісії підвищений в порівнянні з аналогічними величинами у здорових. Таким чином, якщо протеолітичнаактивність не може служити надійним критерієм діагностики виразкової хвороби, то визначення кількості пепсину та обчислення Ка пепсину є досить чітким показником, що сприяє постановці діагнозу. Визначення Ка пепсину і загальної кількості пепсину підвищує точність діагностики виразкової хвороби в порівнянні з визначенням плазмопепсіногена на 34%, протеолітичної активності - на 33%, кислотоутворюючої функції - на 31%.
Звертає на себе увагу той факт, що у обстежених нами хворих на виразкову хворобу кислотність була збільшена в середньому в 1,6 рази, протеолітична активність - в 1,4 рази, плазмопепсіноген - в 1,45 рази, в той час як кількість пепсину шлункового соку було зменшено в середньому в 2,1 рази, а Ка пепсину збільшений в середньому в 3 рази. У багатьох хворих у стадії ремісії величина протеолітичної активності і плазмонепсіногена знижувалася до норми, а К а пепсину, незважаючи на тенденцію до зниження в порівнянні з аналогічними величинами в активній фазі захворювання, часто залишався підвищеним. Тому визначення Ка пепсину є додатковим лабораторним методом, що сприяє діагностиці виразкової хвороби в обох фазах - в період загострення і в період ремісії. За динамікою змін Ка пепсину можна судити про перехід активній стадії захворювання в стадію ремісії.
В результаті проведених нами електронно-мікроскопічних досліджень встановлено, що в МОР, поряд з клітинами в гіперфункціонального стані, є велика кількість клітин в помірному функціональному стані. У головних клітинах у великій кількості зустрічалися суцільні секреторні поля замість окремих пепсиногеном гранул, а в секреторних гранулах ламеллярние, міеліноподобние і паракрісталліческіе структури, які, мабуть, відповідальні за порушення фізико-хімічних властивостей і дегенеративні зміни пепсиногена всередині гранули, порушення секретірованія головними клітинами . Все це може спричинити за собою зменшення фракції сумарних (загальних) пепсину в шлунковому соку.
Нами виведений також коефіцієнт захисту шлункового соку (Кз), що представляє собою відношення кількості білків слизу до протеолітичної активності.
З огляду на дані досліджень, які свідчать про різке зниження кількості білків слизу і про підвищення протеолітичної активності шлункового соку у хворих на виразкову хворобу та з передвиразковий станом, стає очевидним, що коефіцієнт захисту (К3) шлункового соку у цих хворих різко знижений. Так, у здорових цей коефіцієнт дорівнює, в середньому 2,82 + 0,08, у хворих на виразкову хворобу - 0,43 ± 0,07, у хворих з передвиразковий станом - 0,52 + 0,08. Таким чином, якщо співвідношення агресивних і захисних факторів (Ка / Кз) в порожнині шлунка здорових дорівнює 0,1, то у хворих на виразкову хворобу воно дорівнює 1,8, а у хворих з передвиразковий станом - 2,3.
Таким чином, при виразковій хворобі і передвиразковий стан на підставі обчисленого Ка / К.3 можна говорити про переважання чинників агресії над захистом в 18-23 рази.
Таким чином, результати проведених нами досліджень показали, що нерідко як при підвищеній, так і при зниженій кислотності, також як при підвищеній, нормальної, а іноді і кілька зниженою протеолітичної активності Ка пепсину при виразковій хворобі і передвиразковий стан різко підвищений, а К3 - різко знижений. Навіть при нормальній або дещо зниженою протеолітичної активності шлункового соку у хворих на виразкову хворобу і значно підвищеному при цьому Ка, пепсину за рахунок різкого зниження кількості сумарних пепсину, що відображає загальне пригнічення синтезу білків в МОР, можна говорити про підвищений протеолизе в порожнині шлунка і вираженої агресивності цього процесу. Зниження протеолітичної активності в шлунковому соку у хворих на виразкову хворобу на фазі підвищеного Ка пепсину свідчить про різко катаболической спрямованості белковосінтетіческой процесів в СОШ, що приводить до зниження синтезу пластичних і специфічних білків (в.том числі і протективного білків слизу), до легкої вразливості клітин, щодо великій концентрації активних шлункових протеаз (для такого хворого нормальні або кілька знижені абсолютні цифри протеолітичної активності є високими), тому навіть на тлі невисокої концентрації активних пепсину необхідно включати в лікувальний комплекс препарати антациди і антіпептікі. Встановлено, що прогноз захворювання при зниженій протеолітичної активності та високому Ks пепсину шлункового соку погіршується.
Те ж можна сказати про К3 шлункового соку. На тлі підвищеної, - збереженої і навіть зниженою протеолітичної активності спостерігається різке зниження Кз шлункового соку за рахунок зменшення продукції захисних білків слизу, що є також відображенням гноблення загальної белковосинтетической функції МОР і її резистентності.
Отримані дані про зниження загальної кількості білка шлункового соку і окремих його фракцій (пепсину, білків слизу + альбумінів, пептонов) на тлі підвищення, а в деяких випадках незначного зниження протеолітичної активності і різкого підвищення Ка пепсину і зниження Кз при виразковій хворобі дозволяє зробити висновок про патогенетичне значення отриманих даних. У зв`язку з виразністю агресії в порожнині шлунка з боку протеолізу доцільно включати в будь-який лікувальний комплекс препарати антацидного і антіпептіческой дії, що сприяють зниженню протеолітичної активності в шлунку (типу фосфалюгеля, топалкан), і препарати анаболічного дії, що стимулюють білковий синтез в МОР як пластичних, так і специфічних білків слизу.
Таким чином, на тлі традиційної терапії хворих на виразкову хворобу, що включає холіноблокатори, спазмолітики, антациди і ін., Необхідно застосовувати препарати антіпептіческой дії і стимулятори репаративних процесів (білкового синтезу), оскільки, як випливає з даних І. Л. Янсон (1975), Ц. Г. Масевича, В. А. Горшкова (1976), атропін не тільки не знижує ферментовиделітельной функцію шлунка у хворих на виразкову хворобу, але у 1/3 з них збільшує її. Ці дані цілком узгоджуються з отриманими нами. Комбінація лікарських засобів, спрямована на зниження тонусу блукаючого нерва, в гострому спостереженні ще більше, ніж в активній фаз? виразкової хвороби, знижує загальну кількість білка і його фракцій і призводить до ще більшого підвищення величини Ка пепсину. Тому на тлі традиційних холинолитических сумішей, застосування яких в зв`язку з підвищеним тонусом блукаючого нерва при виразковій хворобі виправдано, також можна рекомендувати включати в комплексну фармакотерапію антациди, антіпептікі і стимулятори білкового синтезу.
Отримані нами дані про ідентичність змін, концентрації спільних, активних фракцій пепсину, К а пепсину і К3 шлункового соку при передвиразковий стан і виразкової хвороби обох локалізацій узгоджуються з даними клінічного аналізу, ендоскопічного, електронно-мікроскопічного дослідження гастродуоденальної зони, що свідчать про односпрямованість порушень, але різного ступеня їх вираженості у хворих з передвиразковий станом і виразковою хворобою. Все сказане дозволило нам розглядати передвиразковий стан (хронічний первинний гастродуоденіт) не як передхвороба, а як початкову пред`язвенное стадію виразкової хвороби.
Зупинимося детальніше на можливості застосування Ка пепсину і К3 шлункового соку в практичній охороні здоров`я.
Існує цілий ряд методів визначення протеолітичної активності шлункового соку, серед яких найбільш поширеними є методи Н. П. П`ятницького (1968) по-звурдженого дії шлункового соку на молоко- метод В. Н. Туголукова (1965) по перетравлюється дії шлункового соку на суху плазму і гемоглобінового метод Ансона-Мирського (1932) в модифікації А. М. Старицької та Е. Г. Моргун (1972), заснований на утворенні під впливом активного пепсину шлункового соку тирозину, що визначається колориметрически.
Незважаючи на те що останній метод відрізняється високою точністю і інформативністю, при його постановці можуть виникнути труднощі, пов`язані з приготуванням і зберіганням розчинів гемоглобіну, необхідністю користуватися складними реактивами. Тому, з огляду на велику цінність Ка-пепсину і К3 шлункового соку для діагностики виразкової хвороби, ми вважали за доцільне порівняти дані величини протеолітичної активності, Ка пепсину і К3 шлункового соку з результатами використання більш простого, широко розповсюдженого, легко відтвореного методу В. Н. Туголукова ( 1965).
Білковий склад шлункового соку в цій частині дослідження ми також визначали методом дифузного висолювання білків (Н. В. Зеленський, 1959).
Спосіб визначення протеолітичної активності шлункового соку по Туголукова включає забір шлункового соку, вплив шлункового соку, що містить протеолітичний фермент, на білковий субстрат (розчин сухої плазми), осадження неперетравленого білка за допомогою трихлороцтової кислоти і визначення ступеня перетравлення субстрату за різницею в обсязі осаду в дослідному і контрольному зразках. З метою встановлення залежності ступеня перетравлення від концентрації пепсину в шлунковому соку використаний фармакопейний (аптечний) пепсин. За допомогою цього пепсину виведена калібрувальна крива і складена робоча таблиця для перерахунку показників перетравлення на утримання пепсину в досліджуваному матеріалі, виражене в грам-відсотках стандартного (фармакопейного) пепсину.
Відомий також метод визначення протеолітичної активності шлункового соку по Ансону-Мирського в модифікації Л. М. Старицької та Е. Г. Моргун, що полягає у впливі шлункового соку, що містить активний пепсин, на білковий субстрат - гемоглобін, денатурований HCI. Нерозщеплений білок осідає за допомогою трихлороцтової кислоти, а кількість продуктів розщеплення визначається фенольним реактивом Фолина. Калібрування проводиться кристалічним пепсином, результати виражаються в міліграм-відсотках активного пепсину.
Як уже зазначалося, метод Ансона-Мирського відрізняється високою точністю і інформативністю, його використовують для обчислення Ка пепсину, запропонованого нами (І. І. Дегтярьова і співавт., 1983) і має велике діагностичне значення при виразковій хворобі.
Однак, як було зазначено вище, цей метод малодоступний для широкого застосування в лабораторіях районних лікарень, загальнотерапевтичних стаціонарів.
У той же час метод визначення протеолітичної активності по Туголукова простий, легко відтворюємо, не вимагає дорогих реактивів і апаратури, його можна широко застосовувати в звичайних лабораторіях, в тому числі районних лікарень. Однак величини пепсину, отримані за допомогою даного методу, в 120- 200 разів перевищують показники, отримані за допомогою методу Ансона-Мирського, і тому відображають не дійсний зміст пепсину в шлунковому соку, а лише його загальну переваривающую здатність.
Концентрація пепсину (однієї з фракцій білка шлункового соку) в 12-48 разів перевищує кількість загального білка шлункового вмісту, що неможливо. Через зазначеного недоліку використовувати метод Туголукова для підрахунку Ка пепсину і К3 шлункового соку неможливо.
З метою підвищення точності діагностики виразкової хвороби для визначення протеолітичної активності по В. Н. Туголукова при побудові калібрувальної кривої використовують не фармакопейний пепсин, що містить лише 0,8-1% активного ферментації а високоактивний стандартний кристалічний (І. І. Дегтярьова і співавт. , 1986- І. І. Дегтярьова, І. Н. Старостенко, 1988-
І. Н. Старостенко, 1988), активність якого в 120 разів вища за активність фармакопейного пепсину (П. М. Бабаскін, 1965).
Це здійснюється наступним чином. Готують серії розчинів з різною концентрацією стандартного кристалічного пепсину (від 10 до 5000 мкг / мл). У градуйовані центрифужні пробірки поміщають по 1 мл кожного розчину пепсину і по 2 мл 2% розчину сухої плазми. Для контролю на кожні 3 пробірки з розчином пепсину ставлять 1 пробірку з 1 мл води. Штатив із пробірками поміщають в термостат на 20 год, потім в кожну з них вводять по 2 мл 10% трихлороцтової кислоти, центрифугують і визначають величину осаду в пробірці. Обчислюють показник перетравлення (М) за формулою:

де А - величина осаду в контролі, В - обсяг осаду в досвіді.
На підставі отриманих результатів виводиться крива залежності показника перетравлення білкового субстрату (М) від змісту стандартного кристалічного пепсину в 1 мл розчину. Ця крива дозволяє скласти робочу таблицю для перерахунку показника перетравлення на утримання пепсину в досліджуваному матеріалі, виражене в микрограммах на мілілітр стандартного пепсину.
Після побудови калібрувальної кривої приступають до визначення протеолітичної активності шлункового соку. Для цього беруть 1 мл профільтрована, розведеного в 100 разів водою шлункового соку, поміщають в градуйовану центрифужную пробірку (досвід). В іншу градуированную пробірку поміщають 1 мл прокипяченного розведеного шлункового соку (контроль). Пробірки ставлять в термостат при температурі 37 ° С на 2 год. Потім в кожну пробірку додають по 2 мл 10% трихлороцтової кислоти і центрифугують 10 хв. Визначивши величину осаду в дослідному і контрольному зразках, обчислюють показник перетравлення субстрату за вказаною вище формулою. За даними калібрувальної таблиці виробляють перерахунок його на вміст активного ферменту в досліджуваному соку, виражене в мкг / мл стандартного кристалічного пепсину.
Далі обчислюють Ка пепсину, що є відношенням протеолітичної активності до загальної кількості пепсину шлункового соку, і Кз, що є відношенням концентрації білків слизу до протеолітичної активності.
Хворий Д1, 45 років, історія хвороби № 11392, поступив у клініку 18.08.83 р з діагнозом: виразкова хвороба в стадії загострення, виразка цибулини дванадцятипалої кишки.
Взято для дослідження шлунковий сік, отриманий в умовах базальної секреції. Дебіт-годину HCl - 3,2 мекв (норма -2,6). Концентрація загального пепсі
на (активного і неактивного), певна методом дифузного висолювання, 25,2 мг%, або 252 мкг / мл (норма 43,5 мг%, або 434,6 мкг / мл).
Концентрація білків слизу - 24,4 мг%, або 244 мкг / мл (норма 52,8 мг%, або 528 мкг / мл).
Протеолітичнаактивність (по Туголукова) - 22 000 мкг / мл, або 2200 мг% (норма-1700 мг%, або 17 000 мкг / мл). Ка пепсину і К-r шлункового соку підрахувати неможливо, так як концентрація активного пепсину у багато разів перевищує загальну кількість пепсину і концентрацію білків слизу.
Протеолітичнаактивність по нашому методу 220 мкг / мл, нли 22 мг% (норма-172,8 мкг / мл, або 17,3 мг%).

Перевага пропонованого методу полягає в тому, що він дозволив наблизити метод Туголукова до найбільш точному визначенню концентрації активного пепсину за методом Ансона- Мирського в модифікації Л. М. старому і Е. Г. Моргун, що відбиває справжній зміст активного ферменту в шлунковому соку.
Так, у здорових протеолітичнаактивність в порції шлункового соку натще по В. Н. Туголукова в нашій модіфікаціі- (186,2 + 13,0) мкг / мл, або 18,6 мг% - по Ансону-Мірскому- (154,2 ± 8,4) мкг / мл, або 15,4 мг% - в базальному секреті по Туголукову- (172,8 + 12,6) мкг / мл, або 17,3 мг% - по Ансону- Мірскому- (148, 4 + 9,6) мкг / мл, або 14,8 мг% - після стимуляції гістаміном по Туголукову- (210,5 ± 15,3) мкг / мл, або 21 мг% - по Ансону-Мирського - (179,7 ± 11,5) мкг / мл, або 17,9 мг%.
У хворих на виразкову хворобу протеолітичнаактивність шлункового соку натще по методу Туголукова в нашій модифікації становить (269,2 + 16,5) мкг / мл, або 26,9 мг% - по Ансону-Мірскому- (201,5 + 9,2) мкг / мл, або 20,1 мг% - в базальної порції - (258,5 + 13,4) мкг / мл, або 25,8 мг% (по Туголукова), і (210,6 + 10,3) мкг / мл, або 21,0 мг% (по Ансону-Мирського) - в гістамінових соке- (312,6 + 16,8) мкг / мл, або 31,3 мг% (по Туголукова), і (305,8 ± 10,4) мкг / мл, або 30,6 мг% (по Ансону- Мирського).
Деяка відмінність цифрових даних ми пояснюємо відносної неточністю методу Туголукова в порівнянні з методом Ансона-Мирського, пов`язаної, ймовірно, з неможливістю стандартизувати субстрат (суху плазму) візуальною оцінкою кількості неперетравленого білка.

Таблиця 6 Протеолитическая активність шлункового соку у здорових і хворих на виразкову хворобу

Примітка: 1 здорові особи (контрольна група), 2 - хворі на виразкову хворобу.

Модифікація способу Туголукова (І. І. Дегтярьова, І. Н.Старостенко, 1985, 1988) дозволила також використовувати його для обчислення Ка пепсину і К3 шлункового соку, мають важливе діагностичне значення при виразковій хворобі як у фазі загострення, так і в стадії ремісії захворювання.
Ка пепсину у здорових в шлунковому соку натще з використанням модифікованого методу Туголукова становить 0,42 ± 0,06 за Ансону - Мирського - 0,32 ± 0,09- в базальному секреті цей коефіцієнт дорівнює 0,39 ± 0,05 за Туголукова і 0,31 ± 0,07 - по Ансону-Мірскому- в гістамінових соку - 0,37 + 0,05 і 0,33 ± 0,08 відповідно.
У хворих на виразкову хворобу До s пепсину в шлунковому соку натще по Туголукову- 1,05 ± 0,08 і по Ансону-Мирського - 0,84+ ± 0,08, в базальному секреті-1,15 + 0,07 і 0, 92 ± 0,06 в гистаминовой порції - 0,82 ± 0,06 і 0,80 + 0,06 відповідно.
К3 шлункового соку у здорових натще становить по Туголукова 3,60+ 0,20 і по Ансону-Мирського-4,38 + 0,23- в базальної секреції відповідно 3,12 ± 0,21 і 3,48 + 0,18 після введення гістаміну - 2,56 ± 0,19 і 3,24 ± 0,2.

Таблиця 7. Протеолитическая активність, концентрація пепсину і Ка пепсину у здорових і хворих на виразкову хворобу (з використанням методу В. Н. Туголукова)

Примітка: 1 - практично здорові особи, 2 хворі на виразкову хворобу.

У хворих на виразкову хворобу Кз натщесерце по Туголукова - 1,2 ± 0,09 і по Ансону-Мирського - 1,52 ± 0,10 в базальному секреті - відповідно 1,0 + 0,08 і 1,15 ± 0,09 - в гістамінових соку - 1,04 + 0,07 і 1,05 ± 0,09 (табл. 6, 7).
Таким чином, зміни Кй пепсину і Кз шлункового соку, отримані за допомогою методу В. Н. Туголукова з використанням замість фармакопейного кристалічного пепсину, мають абсолютно ідентичну спрямованість з даними, отриманими нами з використанням методу Ансона-Мирського. Простота і доступність цього методу, а також ідентичність результатів, отриманих при застосуванні двох способів визначення протеолітичної активності, Ка і Кз дозволяють широко використовувати метод Туголукова в практичній охороні здоров`я, навіть на рівні районної лікарні, для визначення агресивних і захисних факторів шлункового соку і їх співвідношення у хворих на виразкову хворобу (табл. 8).
У ряді випадків виразкової хвороби (особливо при низькій кислотної продукції) певне діагностичне значення набуває і дослідження активної секреції гідрокарбонатів підшлункової залози із застосуванням секретин-панкреозіміновий тесту (або з використанням церулеіна).

Таблиця 8 Ка пепсину і Ке шлункового соку і їх співвідношення у здорових і хворих на виразкову хворобу (за методом Ансона - Мирського)

Примітка: 1 практично здорові особи, 2 - хворі на виразкову хворобу.

Знижена вироблення гідрокарбонатів, наприклад, у хворих на хронічний панкреатит, може негативно позначатися на перебігу виразкової хвороби і вимагає корекції лікування (В. X. Василенко і співавт., 1987).