Особливості розвитку специфічних реакцій при деяких токсичних і фармакологічних впливах - рівень загальної неспецифічної реактивності організму

ГЛАВА 4
ОСОБЛИВОСТІ РОЗВИТКУ СПЕЦИФІЧНИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ДЕЯКИХ ТОКСИЧНИХ І фармакологічного впливу ЗАЛЕЖНО ВІД УОНРО
Основну, обов`язкову і велику за обсягом частина токсикологічних і фармакологічних досліджень, пов`язаних з вивченням взаємодії речовин і живих організмів, становить проведення експериментів на тваринах [Батрак Г.Є., Кудрін О.М., 1979]. Фармакологічну активність досліджуваних речовин прийнято характеризувати кількісними категоріями і якісними реакціями організму на їх введення. При цьому, як правило, враховують видові, вікові та статеві особливості тварин, що використовуються в токсикологічних і фармакологічних дослідженнях [Березовська І.В., 1993- Лоскутова З.Ф., 1980]. Деякі автори пропонують додатково враховувати фізіологічний стан піддослідних тварин (стадії статевого циклу, режими годування), їх мікробіологічний і генетичний статус, сезонність, час доби виконання експериментів, вважаючи, що тільки при наявності цих відомостей можна судити про відтворюваності і порівнянності одержуваних результатів [Березкін М .В., 1989].
Незважаючи на безсумнівну значимість обговорюваних умов забезпечення токсикологічних і фармакологічних експериментів, ряд чинників, здатних впливати на результати дослідів, залишається неврахованих. Про різної чутливості окремих людей і тварин до однакових доз вводяться речовин, а також досягненні одноманітних ефектів у різних індивідів при застосуванні доз, що відрізняються в кілька разів, відомо давно [Холодов Л.Е., Лільїн Е.Т., 1980]. Однак навіть сучасної регламентацією проведення даних досліджень не передбачається додаткове диференціювання піддослідних тварин за рівнем загальної реактивності [Березовська І.В., 1993]. Ігнорування цього факту перешкоджає правильному вибору адекватно реагують груп тварин, виявлення контрольних доз випробовуваних речовин, об`єктивній оцінці реакцій і, отже, достовірним остаточних висновків експериментальної роботи.

1. Прояв гострої і підгострої токсичності в залежності від УОНРО

Токсикологічні дослідження проводяться з метою виявлення несприятливої дії хімічних речовин і біологічних препаратів на живий організм. Вакцина і сироваткове виробництво вимагає специфічного контролю біопрепаратів з використанням бактеріальних токсинів, що володіють заданою активністю. Як правило, передбачається визначення гострої та підгострої токсичності з виявленням летальних, які переносяться і діючих доз. Для дотримання стандартності забезпечення токсикологічного ефекту першорядне значення має підбір максимально однотипно реагують особин в досвідчені і контрольні групи. З урахуванням виявленої інтегративності УОНРО і можливості впливу даного показника на ступінь вираженості токсикологічних реакцій нами були виконані відповідні дослідження.
Перший досвід здійснювали на 30 золотистих хом`яків, змоделювавши гостре хімічне токсичний вплив за допомогою йоду (Iodum). Тварин попередньо диференціювали по УОНРО, сформувавши 3 досвідчені групи, по 10 особин у кожній. Йод вводили одночасно всім піддослідним тваринам одноразово підшкірно в дозі 720 мг / кг (DCL) у вигляді 10% -го спиртового розчину. Потім щогодини протягом доби проводили індивідуальний облік полеглих тварин.
В результаті експерименту встановили певну залежність тривалості життя тварин від УОНРО. Середня тривалість життя індивідів з високим УОНРО склала 7,8 ± 2,6 години, з середнім - 10,5 + 2,96 і з низьким - 12,4 + 2,84.
Статистичний аналіз отриманих результатів, виконаний методом Монцевічюте-Ерінгене, виявив тенденцію до достовірності відмінностей тривалості життя хом`яків між групами тварин з високим і низьким УОНРО (р lt; 0,25).
Другий досвід виконували на 18 білих щурах, попередньо порівну розподілених в три досвідчені групи з урахуванням УОНРО. Гостре токсичну дію моделювали шляхом внутрішньочеревно введення всім піддослідним тваринам сальмонеллезного ендотоксину (Salmonella typhimurium) в разовій дозі 15 мг / кг (LD95). Потім щогодини протягом доби проводили індивідуальний облік полеглих тварин.
В результаті експерименту було встановлено залежність тривалості життя піддослідних щурів від УОНРО. Термін загибелі тварин, що характеризуються високим УОНРО, склав 13,3 + 2,37 години. Для білих щурів, що відрізняються середнім УОНРО, він склав 16,3 + 2,74 години. Термін загибелі тварин з низьким УОНРО дорівнював 19,2 + 2,24 години, при цьому дві особини в даній групі залишилися живі (рис. 12).

Мал. 12. Динаміка загибелі білих щурів при впливі сальмонеллезного ендотоксину в LD95 в залежності від УОНРО
Статистичний аналіз отриманих результатів, виконаний із застосуванням критерію Вілкоксона - Манна - Уїтні, показав достовірність відмінностей термінів загибелі експериментальних тварин, що відносяться до крайніх груп по УОНРО (р lt; 0,05).
Третій досвід виконали на 48 морських свинках, попередньо порівну розподілених в три досвідчені групи з урахуванням УОНРО. Для моделювання гострого токсичного впливу також використовували ендотоксин S. typhimurium, вводячи його одночасно всім піддослідним тваринам внутрішньоочеревинно в DCL. Протягом наступної доби щогодини проводили індивідуальний облік полеглих тварин.
В результаті дослідження встановили залежність стійкості експериментальних тварин до пред`явленого токсичного впливу від індивідуального УОНРО. При цьому тривалість життя морських свинок після введення токсину склала в групах з високим УОНРО - 13,8 + 1,79 години, із середнім - 14,6 + 1,51 години і з низьким УОНРО - 17,6 + 1,73 години ( рис. 13).

Мал. 13. Динаміка загибелі морських свинок при впливі сальмонеллезного ендотоксину в DCL в залежності від УОНРО
Статистична обробка даних, виконана методом Монцевічюте-Ерінгене, виявила тенденцію до достовірності відмінностей показника тривалості життя між групами тварин з високим і низьким УОНРО (р lt; 0,25). Таким чином, узагальнивши експериментальні дані, можна зробити висновок про вплив УОНРО на індивідуальну стійкість до гострого токсичного впливу, незалежно від природи токсину. Причому найбільшою стійкістю відрізняються особини з низьким УОНРО, а найменшою - з високим УОНРО. Індивіди, що володіють середнім УОНРО, характеризуються проміжним положенням в стійкості до токсинів між крайніми групами тварин, фактично відбиваючи среднепопуляціонний токсикологічний ефект.
Крім контролю гострої токсичності, в практиці токсикологічних досліджень широко використовують оцінку підгострій токсичності. При цьому ступінь токсичності визначають по вираженості реакції організму на введення досліджуваної речовини, що має для нього несприятливе значення [Батрак Г.Є., Кудрін О.М., 1979].
Оцінку підгострій токсичності мікробних токсинів найбільш часто проводять за результатами «питної проби». Метод дослідження заснований на прояві дії бактеріальних токсинів, що обумовлюють зниження живої маси біопробних тварин. Як біомоделі використовують мишей. Безпосередньо перед введенням препарату визначають живу масу дослідної та контрольної груп тварин. Досліджуваний препарат вводять внутрішньочеревно і протягом тижня спостерігають за динамікою зміни маси мишей дослідної групи. Чим вище відставання живої маси у мишей дослідної групи від тварин контрольної групи, тим виражено ступінь токсичності досліджуваного препарату.
З огляду на вплив УОНРО на стійкість організму до гострого токсичного впливу, ми припустили, що і реакція на підгострий токсичний вплив так чи інакше буде залежати від індивідуального УОНРО.
Для вивчення залежності зміни живої маси біопробних тварин від УОНРО при підгострому токсичний вплив виконали відповідні дослідження.
Роботу проводили на 60 білих мишах, підібраних за віком (55-65 днів) і живою масою (17,0-19,0 г). Крім того, тварини були диференційовані з урахуванням УОНРО і порівну розподілені в три групи. У I групу увійшли особи з високим, в II групу - із середнім, а в III групу - з низьким УОНРО. Кожну групу мишей додатково розділили на дві підгрупи, досвідчену і контрольну, по 10 особин. Формування підгруп виробляли за 6 діб до досвіду (рекомендований період адаптації). У цей період середня маса тварин I групи знизилася на 0,1 г, маса мишей II групи залишилася незмінною, а в III групі збільшилася на 1,5 м На 7-у добу всім тваринам досвідчених підгруп одномоментно внутрибрюшинно вводили МДД (10 мг / кг) стафилококкового екзотоксину (S. aureus). Одночасно всім мишам контрольних підгруп аналогічним чином вводили відповідний об`єм фізіологічного розчину. Потім щодня в наступні 7 діб виробляли зважування кожної підгрупи тварин.
В результаті експериментів виявили певні особливості динаміки живої маси мишей досвідчених і контрольних підгруп в залежності від УОНРО.
З моменту ін`єкцій маса тварин дослідної підгрупи I групи знизилася до других діб в середньому на 1,5 г, потім трималася на одному рівні, на четвертий день почала зростати, а до кінця тижня її дефіцит склав в середньому 0,5 г від вихідного рівня. Жива маса мишей досвідчених підгруп II групи за час досвіду зросла в середньому на 1,2 г, а III групи - на 1,5 г (рис. 14).
У всіх контрольних підгрупах спостерігали стійке підвищення маси тварин. При цьому маса мишей I групи перевищила вихідний рівень на 0,5 г, а II і III груп практично збіглася зі значеннями відповідних досвідчених підгруп.
Таким чином встановили, що тварини, які характеризуються високим УОНРО, відрізняються підвищеною чутливістю до підгострий токсичного впливу, що визначається методом «питної проби».

Мал. 14. Динаміка зміни живої маси білих мишей, розподілених по УОНРО, до і після впливу МДД стафилококкового екзотоксину Крім використання «питної проби», для оцінки підгострій токсичності нерідко застосовують аналіз морфологічних змін, характерних для патологічних процесів, що викликаються токсичним впливом.
Для вивчення впливу УОНРО на зміну маси внутрішніх органів при підгострому токсичний вплив виконали наступні дослідження.
Як біомоделі використовували 36 морських свинок. Тварин з урахуванням індивідуального УОНРО порівну розподілили в три групи. Кожну з груп додатково, методом випадкової вибірки, розділили на дослідну і контрольну підгрупи, по 6 особин. Подострое токсичний вплив моделювали шляхом триразового, з годинним інтервалом, внутрішньочеревно введення МПД (0,5 мг / кг) сальмонеллезного ендотоксину (S. typhimurium) тваринам досвідчених підгруп. Одночасно морським свинкам контрольних підгруп вводили відповідний об`єм фізіологічного розчину за аналогічною схемою. Через 10 годин здійснювали одночасну евтаназію всіх експериментальних тварин шляхом декапитации. Провівши аутопсію, витягли печінку, легені, серце, селезінку, нирки і надпочеч-
ники. Потім витягнуті органи зважили і розрахували їх масову частку в індивідуальному порядку.
В результаті експериментів встановили певну тенденцію до змін відносної маси деяких внутрішніх органів при підгострому токсичний вплив (табл. 17).
Таблиця 17
Зміна відносної маси внутрішніх органів у морських свинок в залежності від УОНРО при впливі МПД сальмонеллезного ендотоксину

* Статистично достовірне зміна (р lt; 0,05) за критерієм Вілкоксона - Манна - Уїтні.
При цьому через значних величин статистичних помилок розрахованих середніх арифметичних показників достовірних змін відносної маси внутрішніх органів, за винятком наднирників, не виявлено. Однак отримані результати дозволяють констатувати, що в більшій мірі морфологічних змін внутрішніх органів, характерних для інтоксикації, схильні до особини з низьким УОНРО.
Отримані результати дозволяють в значній мірі оптимізувати оцінку підгострій токсичності за рахунок цілеспрямованого підбору біомоделей з заданим УОНРО. Однак визначення порогових доз токсичних речовин залишається проблематичним через відсутність методів якісної оцінки даного показника.
Припустивши, що у самок з високим УОНРО репродуктивна система виявиться щодо більш чутливою до порогової величиною інтоксикації, ми зробили дослідження, що дозволяють сподіватися на виявлення показників якісної оцінки МДД токсичного впливу. Роботу виконували на білих митах - вигляді тварин, що має поліестральний тип статевої циклічності зі спонтанною овуляцією. Всього в досліді використовували 198 мишей (162 + 36), попередньо диференційованих з урахуванням УОНРО і порівну розподілених в три групи. I група включала в себе особин з високим УОНРО, II - з середнім і III - з низьким. Кожна група складалася з трьох рівних підгруп, двох досвідчених (А і В) і однієї контрольної. Кожна підгрупа, в свою чергу, комплектувалася з двох сімей (по 6 + 2) і однієї одностатевої (6) мінігрупи. Всі сім`ї досвідчених А-підгруп формувалися безпосередньо після підшкірного введення самкам сальмонеллезного ендотоксину в розрахунковій МДД (0,4 мг / кг в 0,2 мл 0,9% -го розчину NaCl). Всі сім`ї досвідчених В-підгруп формувалися на 7-у добу після аналогічного токсичного впливу.
Тварини одностатевих мінігрупи піддавалися токсичного впливу одночасно з самками своїх підгруп, з метою врахування можливого впливу часу ін`єкцій на чутливість організму до ендотоксину. Всі самки контрольних підгруп, як в сім`ях, так і в мінігрупах, піддавалися впливу плацебо (0,9% -й розчин NaCl). Формування сімей досвідчених (А і В) і контрольних підгруп всіх груп проводилося одночасно, при варіюванні термінів введення токсину. На 14-у добу з моменту формування сімей всіх самок перших контрольних і досвідчених підгруп А і В приспали ефіром і забили шляхом зміщення шийних хребців. Потім зробили аутопсію, витяг матки і після розтину її рогів визначили ембріональну смертність. У всіх самок друге контрольних і досвідчених підгруп А і В з 20-х по 30-у добу з моменту формування сімей щодня фіксували появу приплоду.
В ході експерименту у всіх самок одностатевих мінігрупи виробляли щоденний облік статевої циклічності.
В результаті виконаних досліджень встановлено такі принципові моменти.
У 70% самок I групи досвідчених мінігрупи в підгрупах А і В на 4-6-у добу після токсичного впливу розвивалася анафродизія (припинення статевих циклів). У 50% тварин III групи досвідчених мінігрупи в підгрупах А і В у ті ж терміни спостерігалася активація репродуктивної сфери (овуляція під час відсутності самця).
У першій дослідній А-підгрупі I групи у самок при розтині матки виявлено повну відсутність ембріонів. В аналогічних підгрупах II і III груп спостерігали повноцінний розвиток вагітності (табл. 18).

Показники ембріональної загибелі у самок білих мишей в залежності від УОНРО при впливі МДД сальмонеллезного ендотоксину

У порівнянні з тваринами перших контрольних підгруп відповідних груп ембріональна смертність в досвідчених А-підгрупах, крім I групи, не мала суттєвих змін величин досліджуваних показників. Причому у тварин III групи дослідної А-підгрупи виживаність імплантувалися ембріонів перевищувала таку у особин контрольної підгрупи.
Значення показників ембріональної загибелі у тварин перших досвідчених В-підгруп всіх груп практично повністю співпали з аналогічними величинами в контрольних підгрупах.
Величини показників відтворення в кожній з груп не мали істотних відмінностей у тварин друге контрольних і друге По-дослідних підгруп.
Поява приплоду в другій А-підгрупі I групи в контрольні терміни зафіксовано не було. Значення показників відтворення по-друге досвідчених А-підгрупах II і III груп відповідали аналогічним величинам, отриманим в однотипних контрольних підгрупах.
Таким чином, вплив МДД мікробного ендотоксину, надаючи переважна дію на функціональну активність репродуктивної сфери самок білих мишей, що відрізняються високим УОНРО, одночасно активує статеву систему особин, що характеризуються низьким УОНРО. Тимчасової пік пригнічення репродуктивної функції тварин з високим УОНРО доводиться на 5-ту добу після однократного токсичного впливу, а повне її відновлення відбувається до 8-ї доби.
Виявлені взаємозв`язки дозволяють запропонувати новий показник якісної оцінки МДД токсичних речовин бактеріальної природи.

Узагальнюючи експериментальні дані виконаних досліджень, можна зробити висновок про безсумнівну вплив УОНРО на особливості прояву гострої і підгострої токсичності у лабораторних тварин. Причому, виконуючи оцінку підгострій токсичності різних речовин, необхідно враховувати специфічні моменти розвитку тих чи інших патологічних реакцій в залежності від індивідуального УОНРО.