Кількісні критерії токсичності - токсикологія полімерних матеріалів

Говорячи про кількісні критерії токсичності на смертельному рівні, зупинимося на дискусійному питанні про використання показників максимально стерпних (ЛД0) і абсолютно смертельних (ЛД100) доз. Багато дослідників не рекомендують користуватися цими показниками, оскільки вони, не маючи імовірнісного значення, не є точними і не допомагають з`ясувати причину негараздів про токсичність досліджуваних речовин. Однак необхідно відзначити, що якась особлива точність, в тому числі і помилка, при встановленні смертельних доз не має практичного сенсу, так як ці параметри вказують тільки на порядок величин, використовуваних в підгострих і хронічних дослідах. При встановленні ефективних доз в дослідах, коли відчувають кілька їх варіантів, знову можуть з`явитися помилки і неточності, які не пов`язані з величиною среднесмертельной дози, а є помилками і неточностями підгострого або хронічного досвіду.

Багато дослідників вважають, що точність і інформативність ЛД50 можна істотно підвищити, якщо більш повно охарактеризувати конкретні умови експерименту (стать, вік, вид тварин, концентрація і обсяг розчинів, розчинник та ін.) І максимально їх уніфікувати. На жаль, зазначені дані рідко наводяться в наукових роботах і застосовуються різні способи визначення среднесмертельних доз. Таким чином, особливої точності можна очікувати навіть від ЛД50, встановленої методом пробитий-аналізу, причому з причин, не залежних від характеру математичної обробки результату. Відомо, що є способи надати максимально переносної дози розподіл усіх значення, т. Е. Розглядати її для 95% і 99% рівня значущості (визначивши їх на логарифмічною пробітной кривої). ЛД01 або ЛД05 дають уявлення про максимально переносної дози. В. Н. Ракитский і Ю. С. Каган (1983) в якості мінімальної летальної дози пропонують вірогідну ЛД2,5. На думку інших авторів, визначення ЛД50 з точними довірчими межами є марнотратним щодо кількості тварин, так як її статистична надточних знижується через вплив інших факторів (A. Rowan, 1983). Часто дослідники посилаються на те, що величина ЛДО буде зменшуватися зі збільшенням кількості взятих в досвід особин, що знаходить своє пояснення в варіабельності індивідуальної чутливості тварин до отрут. При цих же умовах величина ЛД100, природно, повинна зростати. Однак це заперечення втрачає переконливість, якщо визначати ЛД0 НЕ підбором що не викликає загибелі дози, а розрахунковим шляхом - в місці перетину кривої летальності з віссю абсцис.

 Не можна не враховувати і ту обставину, що графічне визначення ЛД0 і ЛД100 має виявитися значно точнішим, ніж графічне виявлення ЛД50, так як S-подібна крива летальності в початковій і кінцевій частині представлена майже прямими лініями.
Таким чином, якщо точність встановлення ЛД0 (або ЛД01) практично не відрізняється від точності визначення ЛД50, то виникає питання, яку інформацію ми втрачаємо, не використовуючи перший із зазначених кількісних критеріїв токсичності.
Як відомо, такі параметри, як зона токсичної дії або тангенс кута нахилу прямої летальності, рідко використовуються у водному і харчової токсикології. Тому 2 речовини з приблизно однаковою ЛД50 повинні стосуватися одного і того ж класу токсичності. Але якщо максимально стерпні дози цих речовин будуть відрізнятися між собою хоча б на один порядок, що зустрічається часто, то нахил прямих летальності і токсичність цих речовин за цим критерієм будуть оцінені інакше. Д. Г. Хорсфолл (1978) вважає, що ЛД50 дає лише статичну картину, а нахил кривої - динамічну.
Іншим аргументом на користь необхідності використання максимально переносної дози є ситуації, коли 100% або 50% загибелі тварин в гострому досвіді не вдається досягти через низьку токсичність речовини. В цьому випадку при проведенні токсікометріі ЛД0 може виявитися єдиним орієнтиром у виборі доз для подальших досліджень.
Останнім часом кількісні критерії гострої токсичності, зокрема среднесмертельние дози, все частіше використовують в рівняннях для розрахунку порогових доз і ГДК. Так як на шкалі кількісних параметрів токсичності ЛД0 розташована значно ближче до порога хронічної дії (не тільки в графічному, але, головним чином, в біологічному сенсі). З нашої точки зору, доречним буде використання в розрахункових рівняннях ЛД0 замість ЛД50. Мабуть, це також є перспективним напрямком застосування ЛД0.
Наведені міркування дозволяють рекомендувати використання максимально переносної дози (ЛД0) в якості одного з основних кількісних критеріїв токсичності, що встановлюються в гострому досвіді. Є підстави погодитися з думкою М. L. Tattersall (1982), який вважає, що хоча ЛД0 менш точна, ніж ЛД50, інформативність її і практичне значення для токсикологічної оцінки хімічних речовин більше ніж ЛД50, що представляє в цьому сенсі тільки академічний інтерес.
У Швеції (1985) відбувся перший міжнародний симпозіум, присвячений використанню ЛД50 і її можливих альтернатив, на якому зазначалося, що стандартне визначення среднесмертельной дози вимагає витрати великої кількості тварин.
Симпозіум привернув увагу дослідників до альтернативних щодо ЛД50 методам, що дозволяє отримати інформацію того ж самого або кращої якості, використовуючи меншу кількість тварин (A. Rowan, 1983). Заміна ЛД50 тоншими і точними методами, на думку Е. Paget (1983), є фундаментальною проблемою, з якою стикається наука при проведенні токсикологічних досліджень і гігієнічної регламентації вмісту хімічних речовин у навколишньому середовищі.
Проте, як справедливо підкреслює З. І. Жолдакова (1985), питання про методи вивчення смертельних ефектів речовин недоцільно зводити до альтернативи ЛД50 або ЛД0, а в залежності від поставлених завдань обсяг дослідів, об`єкти досліджень і розраховуються параметри можуть широко змінюватися.
У відповідно до реальних умов надходження інгредієнта ПМ з повітрям, водою, їжею або через шкіру среднесмертельную дозу (концентрацію) визначають при внутрішньошлунковому, інгаляційному або шкірному шляху введення (не менше ніж на 2 видах тварин).
При виявленні смертельних доз речовини, розчинні у воді і маслі, вводять в шлунок у вигляді розчинів, нерозчинні - в вигляді емульсій або суспензій. Як емульгатори використовують ОП-7, ОП-10 або молоко. Емульсію готують, змішуючи емульгатор з навішуванням досліджуваного речовини в певному відношенні, поступово додають воду і ретельно розтирають отриману масу. Контрольним тваринам вводять емульсію, що містить тільки емульгатор. Мишам вводять 0,5-1 мл рідини, щурам 3-8 мл, гвінейських свинок - 4-6 мл, кроликам - 100 200 мл (в залежності від маси тіла тварин). При вивченні гострої токсичності для мишей фосфорорганічних сполук Е. А. Єршова і співавтори (1975) показали, що обсяг введеної в шлунок рідини впливає на показники токсичності. Автори рекомендують речовина вводити в обсязі 0,2-0,6 мл. Оскільки щури їдять вночі, велика кількість їжі рано вранці в порівнянні з післяполуденні часом в їх шлунку може змінити гостру токсичність при в / ж введенні. З метою усунути подібний вплив в експеримент необхідно брати тварин, які вночі можуть не харчуватися. ЛД50, певна натщесерце, зазвичай в 2-3 рази нижче, ніж у годівлі тварин.
Речовина вводять в шлунок дрібних лабораторних тварин металевим зондом, кроликам, кішкам і собакам - гумовим зондом. Їжу тваринам слід давати не раніше, ніж через 3-4 години після введення речовини. Введення речовини за допомогою зонда забезпечує точне дозування і дозволяє уникнути місцевої дії його на слизові оболонки порожнини рота і стравоходу. Залежно від токсичності речовина можна вводити в чистому вигляді або в розчині. Іноді вдаються до нейтралізації з`єднань кислого або лужного характеру. Є повідомлення про те, що ПАР, які використовуються в якості емульгатора при введенні хімічних речовин в шлунок, підвищують їх токсичність через прискорення процесу всмоктування.
При токсикологічної оцінки будівельних полімерних матеріалів речовина або комплекс газовиділень вводять через дихальні шляхи. Моделювання такого роду інтоксикацій проводиться за допомогою приманок камер об`ємом 100-1000 л. В даний час використовують камери різних конструкцій в залежності від завдань експерименту і фізико-хімічних властивостей досліджуваного речовини (І. В. Саноцкий, 1970). У затравочние камери летючі речовини подаються в динамічному режимі, для чого необхідно централізоване постачання всього камерного господарства стисненим повітрям і створення системи витяжної вентиляції. При вивченні токсичності комплексу газовиділень з будівельних полімерних матеріалів затравочние камери підключають до камер-генераторів. У дослідженнях по експериментальному обґрунтуванню ДУ міграції окремих летких компонентів з будівельних полімерних матеріалів в затравочние камери подають певні концентрації речовини в повітрі. Піддослідних тварин завантажують в камери, переконавшись, що досягнута і стабільно підтримується необхідна концентрація речовини в повітрі. Кількість подається в камери повітря вимірюють за допомогою Реометр і ротаметрів. Реометр-регулятор дозволяє підтримувати потік повітря на заданому рівні при зміні режиму роботи воздухоснабжающіх пристроїв. При встановленні ЛK50 експозиція для мишей повинна дорівнювати 2 ч, для щурів і тварин інших видів - 4 год. Тварини спостерігаються 2-4 тижні.
Нашкірне нанесення речовини при визначенні ЛД50 має строго регламентуватися, так як величини среднесмертельних доз знаходяться в зворотній залежності від площі аплікації: чим більше площа аплікації, тим менше ЛД50 (Ю. І. Кундієв, 1978). Ділянка нанесення речовини у білих щурів - 2X2 см2, у кроликів - 4X5 см2.
При відсутності загибелі тварин від нанесення речовини на шкіру для вивчення шкірно-резорбтивної дії можна використовувати метод занурення хвоста (миші або щури) в пробірку з розчином досліджуваної речовини.
Після закінчення затравки описують зовнішній вигляд і поведінку тварин, стан шерстного покриву і видимих слизових оболонок, ставлення їх до їжі, рухливість, ритм і частоту дихання, а також характер і вираженість симптомів інтоксикації, їх тривалість, терміни і можливі причини загибелі. Досліджують функціональні і біохімічні показники, внутрішні органи і тканини.
Різні методи розрахунку среднесмертельних доз і концентрацій вимагають виконання певних умов досвіду. Методи Беренса і Кербера передбачають однакову кількість тварин в кожній групі, метод Беренса - однакові інтервали між величинами доз. Більш точним у порівнянні зі згаданими методами є метод пробитий-аналізу. При дотриманні рівних інтервалів між вводяться дозами для визначення среднесмертельних доз можна використовувати досить простий і точний графічний метод Асковіца (В. О. Шефтель, 1981).
На недоцільність скрупульозного уточнення ЛД50 і її помилки, а отже, і громіздких обчислень, пов`язаних з проведенням пробитий-аналізу, вказує Б. М. Штабскій. Автором описаний прийом, що спрощує визначення среднесмертельних доз і концентрацій (Б. М. Штабскій і співавт., 1980). Суть його полягає в тому, що в діапазоні доз ЛД0 - ЛД100 графік залежності частоти летального результату (у%) від дози має вигляд сігмоідной кривої, причому сутність пробитий-аналізу зводиться до випрямлення симетричною кривою на основі її подібності з кривою нормального розподілу шляхом висловлення доз в одиницях середнього квадратичного відхилення (а). Потім число таких одиниць збільшують для зручності на 5, отримуючи відповідні пробиті, кожен з яких еквівалентний строго визначеному відсотку летальності. Вважають, що залежність між пробитими і логарифмами доз (дозами) близька до лінійної. Пряма будується по 3 середніх точок, які добре лягають на пряму і без звернення до пробиття, так як в своїй середній частині будь-яка сігмоідной крива завжди може бути апроксимована прямою. При цьому відносно такої прямої зберігає силу умова 2ст = ЛД84 - ЛД16, а середня помилка (м) среднесмертельной дози по Міллеру і Тейнтер обчислюється за формулою

де N - загальне число тварин в групах, в яких погіблоілі вижило хоча б одну тварину (довірчі кордону ЛД50 знаходять при р = 0,05 для числа ступенів свободи t = N-1). Значення ЛД50 і ЛД100 до уваги не беруться.
Отже, об`єктивно пробитий-аналіз зайвий, а для оцінки ЛД50 досить випробувати не більше 3 доз речовини, одна з яких призводить до загибелі щонайменше 50% тварин, інша - більш 50%, а третя є проміжною між ними. У цьому діапазоні доз залежність відсотка летальності (у) від дози (х) практично має вигляд прямої і може бути описана рівнянням прямої з кутовим коефіцієнтом (а):
(1)
де b - вільний член.
Значення а й b знаходять з нормальної системи Гауса:
(2) (3)
де X1 і х2 - значення двох крайніх з 3 випробуваних доз (що призводять до загибелі менш і більш 50% тварин відповідно) - y1 і у2 - відповідні відсотку летальності- п - число випробуваних доз, що дорівнює 3.
Знаючи а й б, вирішують рівняння 1 щодо х:
(4)
Потім послідовно підставляючи в 4 рівняння значення у1, рівні 50, 84 і 16%, знаходять ЛД50, ЛД84 і ЛД] 6 і далі, як зазвичай, розраховують о, m, mt (t-критерій Стьюдента).
Приклад розрахунку. При визначенні ЛД50 ОЛОВООРГАНІЧНИЙ стабілізатора діоктілоловокарбоксілата методом пробитий-аналізу отримана величина среднесмертельной дози для білих щурів, що дорівнює 5,4 г / кг. Величини летальних ефектів розподілилися наступним чином:

Помилка в порівнянні з методом пробитий-аналізу склала близько 3%.
Т. В. Пастушенко і співавтори (1985) запропонували експрес- експериментальний методичний прийом визначення ЛД50 хімічних речовин і їх довірчих інтервалів, який вимагає незначних витрат часу і обмеженого числа тварин. Цей метод більш простий в порівнянні з табличним методом Б. В. Прозоровського і співавторів (1978, 1980). Він дозволяє за допомогою однієї таблиці визначати ЛД50 хімічних речовин і їх довірчі кордону в широкому діапазоні вираженості токсичних властивостей.
При визначенні ЛД50 на декількох видах тварин з метою економії часу і тварин часто використовують метод однієї точки. Встановлення ЛД50 методом однієї точки по Ван дер варденів (1940) засновано на припущенні, що кут нахилу прямих летальності у тварин різних видів приблизно однаковий. На іншому вигляді, тварин визначають точку, відповідну отриманому ефекту загибелі від введеної дози, і через неї проводять пряму, паралельну прямій летальності від введення речовини
на першому з випробуваних видів тварин. ЛД50 виявляють графічним способом. І. В. Саноцкий (1970) та інші автори виявили достатню відповідність при зіставленні среднесмертельних величин, визначених за описаним методом, з даними розгорнутих дослідів. Автори рекомендують використовувати метод Ван дер Вардена для встановлення среднесмертельних концентрацій, статевої і вікової чутливості до впливу хімічних речовин для білих мишей і щурів. Інформація, отримана в результаті гострого досвіду, використовується, як правило, в повному обсязі, так як не враховуються коливання тимчасового параметра, обумовлені індивідуальною чутливістю тварин до речовини.
Останнім часом застосовують такий показник гострої токсичності, як середній час загибелі половини піддослідних тварин (ЕТ50). Цей параметр визначається з довірчими межами і має імовірнісний характер. На значущість середнього часу загибелі тварин вперше вказав Б. М. Штабскій (1980). Г. Н. Красовський і співавтори (1982) запропонували метод визначення ЕТ50, в якому за основу береться таблиця обліку часу і частоти загибелі тварин в гострому досвіді по добі або годинах спостереження. По таблиці розраховують ЕТ50 для кожної дози. Отримані величини наносяться на графік з логарифмічною сіткою і аппроксимируются прямий. З точки на прямій, що відповідає ЛД50, опускають перпендикуляр до перетину з віссю абсцис, де і визначається величина ЕТ50 - середній час загибелі тварин від введення їм ЛД50. Т. В. Пастушенко і співавтори (1983) застосували розрахунковий метод імовірнісної оцінки середньоефективний часу загибелі тварин від среднесмертельной дози речовини. Для розрахунку використовують лінійне рівняння регресії:
у = а + бх,
де а і b - коефіцієнти регрессіі- у - доза (Д) - х- середній час загибелі тварин.
Коефіцієнти регресії а і b встановлюють методом найменших квадратів і за рівнянням знаходять х (або ЕТ50), підставляючи в нього замість у значення ЛД50. Довірчі кордону ЕТ50 визначають таким же чином, підставляючи замість у довірчі кордону ЛД50. Автори пропонують користуватися таблицею обліку часу і частоти загибелі тварин, запропонованої раніше Г. Н. Красовським і співавторами (1982). На підставі цієї таблиці розрахунковим шляхом складається робоча таблиця для визначення коефіцієнтів регресії. Дози (Д), що викликають загибель тварин, і середній час загибелі тварин (Т) від кожної з введених доз речовини виражають в натуральних величинах. j
Наведений метод визначення ЕТ50, за даними Т. В. Пастушенко і співавторів (1982), добре збігається з графічним методом Г. М. Красовського і співавторів (1982). Величина ЕТ50 є інтегральним показником і враховує коливання тимчасового параметра, пов`язані з індивідуальною чутливістю тварин до дії речовини в дозах нижче і вище ЛД50. Розрахунок ЕТ50 є досить точним способом оцінки кумулятивности речовин.
Г. Н. Красовський і співавтори (1982) запропонували рівняння, в які введені індивідуальні коефіцієнти, що враховують ступінь вираженості кумулятивних властивостей різних класів хімічних сполук.
Подострая токсичність охоплює ефекти, викликані значним впливом, обмеженим у часі.
Завданням підгострого досвіду є: 1) оцінка кумулятивних властивостей речовини-2) виявлення уражених органів, функцій і системних 3) уточнення механізму дії речовини-4) вибір доз для хронічного досвіду-5) вивчення залежності доза - ефект.
При постановці підгострих дослідів необхідно визначити на одному або декількох видах тварин рівні впливу, при яких за обраним морфологічним, фізіологічним, біохімічним і іншим параметрам виявляється несприятливий ефект від повторного впливу речовини. Найважливішим завданням підгострих дослідів є вивчення та оцінка кумулятивного ефекту. Для раціонального планування хронічного експерименту необхідно виявити органи і системи, які пошкоджуються в результаті акумуляції.
Під час проведення підгострих дослідів визначають динаміку зміни маси тіла тварин, споживання корму, фіксують проявляються ознаки інтоксикації і причини смерті. За допомогою необхідних показників оцінюють фізіологічну активність і функцію найважливіших органів і систем. У разі необхідності проводять додаткові біохімічні, імунологічні, гістологічні та інші дослідження, а також вивчають вплив речовини на репродуктивну функцію тварин. Дослідження кумулятивних властивостей речовини направлено на виявлення значення фактора часу в розвитку інтоксикації.