Дослідження системи гемостазу - практичні навички педіатра
ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ
Згортання крові - складний ферментативний процес, в якому поряд з судинними важливу роль відіграють фактори, що знаходяться в плазмі, тканинах, тромбоцитах.
Розрізняють два механізми гемостазу: тромбоцітарно- судинний і коагуляційний. У першому випадку провідна роль в зупинці кровотечі відводиться судинному стінці і тромбоцитів, у другому - плазмової системі згортання крові. При зупинці кровотечі обидва механізму гемостазу знаходяться у взаємодії.
Відповідно до сучасної теорії каскаду (Macfarlane), плазмові фактори, що представляють собою неактивну форму ферменту (проензім), вступають в реакцію в міру їх активації, перетворюючись в активну форму - ензим. Освіта кров`яного тромбопластину починається з активації XII фактора. Активоване XII (ХПА) фактор активує XI (Х1а) фактор. Потім послідовно активуються IX, VIII, X фактори. Утворився кров`яний тромбопластин в присутності іонів кальцію і III тромбоцитарного фактора перетворює протромбін в тромбін (внутрішня система гемостазу). Останній викликає утворення фібрину з фібриногену. Фібриновий згусток стабілізується під впливом XIII фактора. Внутрішній механізм згортання крові може спостерігатися в непошкоджених кровоносних судинах або поза організмом.
У разі нещасного випадку з пошкодженням тканин, рясних крововтратах, некротичних та інших патологічних процесах в кров надходить тканинний тромбопластин (зовнішня система гемостазу), який підвищує тромбопластичних активність плазми і цим прискорює згортання.
ДОСЛІДЖЕННЯ СУДИННО-ТРОМБОЦИТАРНОЇ гемостазу
Резистентність капілярів досліджують за допомогою проби на кровоточивість методом щипка по Юргенсона, банкової проби, проби Кончаловського - Румпеля -
Лееде. Результати оцінюються через 5 хвилин по появі петехіальних крововиливів. Проба вважається позитивною, якщо виникає не менше однієї петехии на 1 см2 шкіри. Позитивні судинні проби характерні для вазопатій, тромбоцитопеній та тромбоцитопатій.
Для визначення часу кровотечі по Duke голкою проколюють шкіру тильної поверхні кінцевої фаланги пальця і через кожні 30 з фільтрувальної папером знімають краплі крові. Час від моменту проколу до відсутності кров`яного плями на папері в нормі становить 2-4 хв. Час кровотечі подовжується при тромбоцитопеніях будь-якого походження, вроджених дефектах тромбоцитів (хвороба Вілленбранда, тромбастенія Гланцмана) і ін.
Запропоновано модифікований метод визначення тривалості кровотечі, в основу якого покладено метод Duke. Дослідження проводиться при підвищеному венозному тиску, що досягається накладенням на плече хворого манжетки тонометра, в якій створюється і підтримується тиск 40 мм рт. ст. Поряд з цим метод дозволяє встановити крововтрату шляхом розрахунку коефіцієнта розведення досліджуваної проби до вихідного рівня гемоглобіну цільної крові. У нормі за цим методом тривалість кровотечі дорівнює (205,2 16,8) с, коефіцієнт розведення (2,56 4: 0,4) ОД, крововтрата (0,05 + -0,009) мл.
ДОСЛІДЖЕННЯ КОАГУЛЯЦІЙНОГО гемостазу
Визначення часу згортання крові. Існує кілька методів визначення часу згортання крові. Метод Бюркера полягає в оцінці часу появи ниток фібрину в плазмі цільної крові на годинному склі при помішуванні скляною паличкою.
Норма 2,5-5,5мін. Метод Лі-Уайта заснований на визначенні спонтанного згортання крові при 37 ° С. Норма 5-10 хв.
Час згортання крові подовжується при дефіциті одного з факторів згортання крові (XII, XI, IX, VIII), що беруть участь в утворенні активного тромбопластину, або при циркуляції в крові антикоагулянтів, в тому числі при введенні гепарину. Скорочення часу згортання вказує на тенденцію до гіперкоагуляції.
Силіконове час згортання цільної крові. Визначається спонтанне час згортання венозної крові в умовах сіліконірованія в двухпробірочном тесті, що виконується за методом Лі-Уайта.
Час від моменту надходження крові в першу пробірку до згортання її в другій пробірці характеризує згортання крові у досліджуваного. У нормі при використанні хорошого силікону цей час становить 15-20 хв. Для кожного виду силікону встановлюється своя норма.
Даний тест особливо цінний для виявлення прихованої гіперкоагуляції. При внутрішньосудинної активації XII і XI факторів, підвищеному вмісті в циркулюючої крові тромбіну і зниженні антикоагулянтної потенціалу час згортання крові в тесті коротшає.
Ставлення згортання активності в сіліконірованной пробірці до згортання активності в несіліконірованной пробірці відповідає індексу контактної активності, який в нормі дорівнює 2.
Визначення каолінового часу рекальцифікації плазми. Час рекальцифікації плазми крові визначається в умовах контактної активації процесу каоліном. Нормальне каолінове час плазми 70-80 с.
Додавання суспензії каоліну - речовини, що володіє високою контактною активністю, стандартизує початкову фазу згортання крові і прискорює цей процес. При дефіциті плазмових факторів згортання, особливо що беруть участь у внутрішньому механізмі утворення тромбопластину (фактори XII, XI, IX, VIII), або надлишку в крові антикоагулянтів (антитромбіну і ін.) Каолінове час подовжується.
Аутокоагуляціоннийтест по Беркарда і співавт. з доповненнями Л. 3. Баркаган. Аутокоагуляціоннийтест (АКТ) відображає динаміку наростання, а потім інактивації тромбопластин-тромбиновой активності в досліджуваній крові.
Поданим АКТ визначаються наступні параметри:
А - згортає активність на 2-й хвилині інкубації гемолізаткальціевой суміші (ГКС) [норма (15,4 ± ± 2,9)%]. Цей параметр найбільш мінливий, так як відображає самі початкові етапи утворення тромбопластину і тромбіну в ГКС-
MCA - максимальна згортає активність [норма (100 ± 1,1)%] -
ІІТТ - індекс інактивації тромбопластину і тромбіну, який розраховується за формулою
MCA (%) / згортає активність на 60-й хвилині інкубації
Норма ІІТТ 2,1 ± 0,1.
Визначення протромбінового часу. За допомогою цього методу визначається активність чотирьох факторів протромбінового комплексу - II, V, VII, X. Метод заснований на визначенні часу згортання плазми хворого після додавання до неї оптимальних кількостей тромбопластина і кальцію хлориду. Результат виражається в секундах (норма 12 с), і обчислюється протромбіновий індекс, де за одиницю приймається середній час згортання в контролі. Норма 0,8-1,1. Подовження часу спостерігається при нестачі одного із зазначених факторів, захворюванні печінки, прийомі антикоагулянтів, відсутності потрібної кількості фібриногену. Скорочення може відбутися при тромбоемболічних станах.
Визначення концентрації фібриногену в плазмі за методом Рутберг. В основі методу лежить наступний принцип: кількість утвореного фібрину еквівалентно змісту фібриногену в плазмі. Для визначення концентрації фібриногену (в міліграм-відсотках) масу згустку після висушування множать на коефіцієнт 22,2. У нормі концентрація фібриногену дорівнює 2-3 г / л. Кровоточивість розвивається при утриманні фібриногену нижче 0,6 г / л.
Для визначення вмісту фібриногену в капілярної і венозної крові можна використовувати мікрометод (В. Я. Сятковскій, 1973).
Етаноловий метод. Поява желеподібної маси (згустку) у плазмі при додаванні туди 50% етанолу свідчить про наявність в ній не згортаються тромбіном комплексів фібрин-мономерів з продуктами деградації фібриногену і фібриногеном. Для попередження утворення таких комплексів в стабілізатор вводиться інгібітор фібринолізу е-амінокапронова кислота.
Якщо в досліджуваній плазмі присутні заблоковані фібрин-мономери, т. Е. Їх комплекси з продуктами деградації фібриногену (продуктами фібринолізу) і фібриноген, то в ній під впливом етанолу формується желеподібний згусток. Результат читається тільки через 10 хв, більш пізнє утворення гелю або згустку не враховується. Позитивний етаноловий тест говорить про те, що в організмі йде диссеминированное або масове локальне внутрішньосудинне згортання крові, що супроводжується лізисом утворився фібрину. Тест використовується для діагностики синдромів дисемінованоговнутрішньосудинного згортання крові, а також масивних тромбозів. Позитивним він частіше буває на ранніх етапах процесу і може стати негативним в період різко вираженою гіпофібриногенемії і після поглинання фібрин-мономірних комплексів клітинами системи фагоцитуючих мононуклеарів. При хвилеподібне перебігу синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові в різні періоди захворювання позитивні і негативні результати тесту можуть чергуватися.
Визначення фібринолітичноїактивності крові. Про фібринолітичноїактивності судять за часом лізису згустку фібрину, який отриманий з фракції плазми хворого, що містить фактори згортання і фібринолізу. Згусток розчиняється зазвичай через 2 ч. Скорочення часу розчинення згустку еуглобуліновой фракції вказує на підвищення активності фібринолітичної системи крові, а збільшення - про дефект або блоці цієї системи.
Визначення фібринолітичноїактивності цільної крові по М. А. Котовщіковой. Випадання формених елементів крові з згустку (третя фракція крові) - результат його природного лізису. Фібринолітична активність крові пропорційна кількості формених елементів, що випали з згустку під час інкубації при 37 ° С протягом 3 год. Знаючи гематокрит досліджуваної крові, можна обчислити (у відсотках) обсяг випали формених елементів по відношенню до всіх формених елементів, т. Е. Показник фібринолітичноїактивності.
Спонтанна фібринолітична активність у дітей може бути досліджена мікрометодом по В. А. Бондарін з співавт. Норма її за цим методом 10-20%.
ДОСЛІДЖЕННЯ ТРОМБОЦИТАРНОЇ ЗВЕНА СИСТЕМИ ГЕМОСТАЗУ
Відео: Практичні навички з фізіології: Визначення полів зору за допомогою периметрії
Фізіологічна функція тромбоцитів полягає в підтримці резистентності судинної стінки за рахунок крайового стояння тромбоцитів в посудині, їх адгезивної функції і участі в гуморально обумовленому спазмі судини під впливом серотоніна- освіті первинного гемостатичного тромбу внаслідок агрегації тромбоцітов- участю в плазмовому згортанні крові, ретракції кров`яного згустку.
Підрахунок тромбоцитів (метод фоніо). Метод заснований на визначенні кількості кров`яних пластинок в забарвлених мазках крові на 1000 еритроцитів з подальшим перерахуванням на кількість тромбоцитів в 1 л крові. Однак більш точно тромбоцити можна підрахувати в лічильної камері за допомогою фазово-контрастної мікроскопії.
У дорослих в нормі міститься 180-10 ° -320-109 тромбоцитів в 1 л крові. Кількість тромбоцитів у дітей коливається в межах 100 - 109-400-10 `в 1 л крові. Зниження числа тромбоцитів до 40 109 в 1 л крові призводить до спонтанної кровоточивості.
Кількість тромбоцитів у дітей знижується при вродженому мегакаріоцітоз (синдром Ландальта), апластичної анемії Фанконі, ізоімунної тромбоцитопенії, пов`язаної з несумісністю матері і плоду по тромбоцитарним антигенів, при придбаних аутоімунних формах тромбоцитопенічна пурпура та придбаної апластичної анемії. Симптоматичні тромбоцитопенії спостерігаються при сепсисі, цитомегалії, ембріопатія, лейкозах, гиперспленизме і ін.
Гіпертромбоцитоз у дітей зустрічаються в післяопераційному періоді при видаленні селезінки, хронічному мієлолейкозі.
Мікрометодом визначення агрегації тромбоцитів в цільної крові по В. П. Балуда з співавт. Заснований на склеюванні тромбоцитів після введення тромбоцітагрегірующего агента в кров. Визначення кількості одиночних тромбоцитів в різні інтервали часу після введення тромбоцітагрегірующего агента дозволяє судити про здатність крові до агрегації тромбоцитів. Цей метод дає можливість встановити: 1) ступінь агрегації тромбоцитів через 1, 3, 6, 10, 15 і 25 хвилин після введення тромбоцітагрегірующего агента, т. Е. Виражену у відсотках різницю між вихідним кількістю тромбоцитів, прийнятим за 100%, і змістом тромбоцитів через 1, 3, 6, 10, 15 і 25 хв-2) час максимальної агрегації тромбоцитів, яка в нормі настає на 3-6-й хвилинах і дорівнює 50-65%.
Визначення адгезивних властивостей тромбоцитів за Марксом і Дерлату. Здатність тромбоцитів до адгезії визначається по убутку їх з крові, пропущеної через скляну трубку. Дослідження проводиться при температурі 37 ° С. У методі стандартизується поверхню контакту і час проходження крові через трубку. Число тромбоцитів підраховується в крові, що пройшла по трубці протягом 5 хв. Відсоток адгезірованних тромбоцитів обчислюється за формулою
де А, В - кількість тромбоцитів в крові відповідно до і після контакту зі склом.
У нормі зміст адгезірованних тромбоцитів становить 40-55%. Висока залишкове число тромбоцитів вказує на знижену їх адгезивні здатність.
Методи оцінки агрегационной і адгезивної здатності тромбоцитів повинні використовуватися для діагностики тромбоцитопатій.
ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКА ГОСТРИХ ПОРУШЕНЬ згортання крові
У відповідності зі схемою лабораторних досліджень, затвердженої М3 БССР в 1980 р, пропонується такий порядок обстеження хворих при гострих порушеннях згортання крові:
1. Проведення трехпробірочной проби. Вона дозволяє встановити:
а) час згортання крові по Лі - Уайту (перша пробірка) -
б) швидкість утворення згустку цільної крові або плазми при внесенні тієї чи іншої кількості тромбіну. Проба проводиться з використанням тест-тромбіну по 3. Д. Федорової (друга пробірка) -
в) час згортання протаміну сульфатом. Метод заснований на прискоренні часу згортання крові при інгібуванні антикоагулянтів протаміну сульфатом (третя пробірка).
- Підрахунок кількості тромбоцитів в крові.
- Постановка етанолового тесту.
- Визначення протромбінового часу.
Відео: Гемостаз 5
Використовуючи перераховані тести, можна виявити причину гостро виникла коагулопатии (споживання факторів згортання, висока фібринолітична активність і рівень антикоагулянтів). Повторення діагностичної схеми в динаміці дає уявлення про характер прогресування патологічних змін або про досягнення певного терапевтичного ефекту в результаті проведених лікувальних заходів.
Найбільш швидко згусток утворюється в пробірці при додаванні тромбіну. За характером згустку, активності його лізису можна оцінити кількісний вміст фібриногену та інших факторів коагуляції, а також активність спонтанного фібринолізу
У третій пробірці з протаміну сульфатом згусток, як правило, не виникає в зв`язку з антикоагулянтну дію протаміну сульфату. Виникнення згустку раніше, ніж в першій пробірці, говорить про надлишок антикоагулянту як можливу причину порушення згортання крові.
При вираженому синдромі внутрішньосудинного згортання значно знижується кількість тромбоцитів і проби на продукти паракоагуляціі позитивні.