Діагностика на основі реєстрації швидкостей спрямованого руху - лазерна діагностика в біології та медицині
3.4. Діагностика біологічних об`єктів на основі реєстрації швидкостей спрямованого руху
Електрофорез. Одним з яскравих прикладів застосування спектроскопії квазіпружного розсіювання в біології та медицині є електрофоретичної светорассеяніє (ЕФС), що використовується для вимірювання рухливості заряджених светорассеивающих частинок в електричному полі. У однолучевой або двопроменевий ЛДА, забезпечений низькочастотної системою обробки сигналу, вставляється електрофоретична кювету з гомогенним розчином або суспензією досліджуваних частинок. Найпростіший тип кювети є Спектрофотометричні осередок, в яку вводяться близько розташовані електроди (найчастіше платинові або паладієві). При накладенні різниці потенціалів в розчині виникає спрямований рух частинок зі швидкістю
де ц, - електрофоретична рухливість (ЕФП), е і г) - діелектрична проникність і в`язкість середовища, - поверхневий потенціал частинок. Відповідний доплеровській зрушення частоти відповідно до формул (3.1) і (3.3)
(3.5)
Отже, знаючи напруженість поля в кюветі і вимірявши доплеровській зрушення частоти, можна прямо визначити ЕФП і з неї - поверхневий потенціал частинок. Наочну інформацію про ЕФС несуть доплеровские спектри. На рис. 3.7 представлений доплеровській спектр, отриманий за допомогою однолучевого ЛДА (кут розсіювання 0 = 11,7 °) від популяції формених елементів крові - сме
Мал. 3.7. Спектр ЕФС, отриманий від суспензії лімфоцитів (1) і еритроцитів (2)
сі лімфоцитів і еритроцитів в буферному розчині [33]. Амплітуда доплеровских піків пропорційна концентрації клітин, які, як видно, добре розрізняються в цьому експерименті. Якщо відповідно до вираження (3.5) перерахувати доплеровские частоти в рухливість, то можна побудувати спектри ЕФП в відповідних одиницях. Приклад спектрів ЕФП тромбоцитів і еритроцитів людини показаний на рис. 3.8 [34].
Мал. 3.8. Спектри ЕФП тромбоцитів (1) і еритроцитів (2) людини
Широке поширення ЕФС в біології та медицині як високочутливого і оперативного аналітичного методу визначається великою різноманітністю частинок, які можуть бути досліджені: від субмікронних макромолекул до великих еукаріотів, а також широким спектром вирішуваних завдань. Це і аналіз складу суміші частинок (формених елементів і білків плазми крові, популяцій вірусів і бактерій і т. Д.), І аналіз імунологічних реакцій, що проводиться при діагностиці захворювань, пов`язаних зі зміною імунного статусу організму (появою злоякісних пухлин, імунодефіцитного стану і т . д.). ЕФС використовується для вивчення процесів агрегації і полімеризації білкових молекул (наприклад, переходів тетрамер - димер гемоглобіну), які спостерігаються при високих значеннях pH, самозборки актінових филаментов (F-актину) з глобулярних мономерів (G-актину).
На рис. 3.9 зображені три спектра ЕФС актину в розчині з різним вмістом іонів Mg2. + [35]. Спектр, зображений на рис. 3.9а, отриманий при куті розсіювання 9 ° в розчині 8,3 ммоль G-актину при температурі 20 ° С і напруженості електричного поля 104 В / см. Характерно, що спектр містить один вузький пік, ширина якого визначається дифузією мономерів G-актину (апаратне розширення в цьому випадку істотно менше). Доплеровский зрушення на 139 Гц відповідає ЕФП ц = 2,4 см2 / (В-с) в стандартному стабилизирующем буфері.
Мал. 3.9. Три спектра ЕФС, отримані від розчину білка актину з різним вмістом іонів магнію
Наступний спектр (рис. 3.96) отримано через 30 хвилин після додавання в розчин MgCl2 з відповідним підвищенням концентрації Mg2 + до 0,5 ммоль. Видно, що це призводить до утворення частинок з меншою ЕФП і до розширення діапазону значень ЕФП. З плином часу спектр набуває вигляду двох вузьких піків, відповідних меншим частотним зрушенням. Спектр, зображений на рис. 3.9в, отриманий через 12 годин після першого. Правий пік дають повільно рухаються філаменти F-актину. Лівий пік можна віднести до Актинові филаментам, що прикріплюється до стінок кювети.
Методом лазерного ЕФС в даний час користуються в багатьох лабораторіях медико-біологічного профілю.
Специфічні труднощі застосування цього методу, пов`язані з нагріванням розчину, з необхідністю обліку електроосмотіческій явищ і ряду інших, вже частково подолані. Дослідження, спрямовані на вдосконалення методу та на розширення сфери його застосувань »тривають.
Гемодинаміка. Іншим напрямком робіт, пов`язаних з реєстрацією спрямованого руху часток в медичній діагностиці, є вимір швидкісних характеристик потоків крові: середньої інтенсивності кровотоку, розподілу швидкостей по перетину судини, інтенсивності турбулентних пульсацій та ін. Ці роботи важливі для розвитку досліджень по фізіології і реології крові і кровоносних судин у зв`язку з завданнями створення їх штучних замінників і з завданнями діагностики захворювань. ЛДА знаходить в цих роботах все більше застосування [36].
Перші вимірювання швидкості кровотоку in vivo за допомогою ЛДА були проведені на початку 70-х років на артеріях сітківки ока кролика [37]. Експериментальна установка дозволила оцінити швидкість кровотоку, яка виявилася порядку 1,1-1,8 см / с, що знаходиться в хорошому відповідно до результатів, отриманими традиційними методами. Однак необхідність порівняно великого рівня потужності лазерного випромінювання (близько 10 мВт) при тривалості вимірювань близько 2 хвилин, а також анестезування і розширення зіниці не дозволили відразу використовувати цей метод в клінічній практиці і зажадали його значної модернізації [38-40].
Для отримання значень швидкостей кровотоку і спрощення юстування системи стали використовувати схеми з опорним пучком. Конструктивно всі елементи оптичної схеми розташовують в модернізованої фундус-камері, що дозволяє проводити незалежні вимірювання швидкості кровотоку з використанням звичайної флуоресцентної ангіографії при експериментальних дослідженнях. Подібним системам притаманний загальний недолік: зміщення кровоносної судини від точки фокусування під час вимірювань. Тому зазвичай намагаються або скоротити час вимірювання до 0,5 с і менше [40], або використовувати спеціальні компенсаційні схеми, що дозволяють в автоматичному режимі стежити за становищем променів на кровоносній судині з їх подальшим коректуванням [41].
В офтальмології ЛДА може з успіхом використовуватися для вивчення відносної закупорки вен і артеріальної недостатності при захворюваннях судин сітківки, впливу фотокоагуляции на судинну циркуляцію і для інших діагностичних цілей.
Необхідно зауважити, що точність вимірювання швидкості кровотоку досить висока лише в разі дуже тонких
Мал. 3.10. Доплерівські спектри, отримані від потоку розведеної (/) і цільної (2) крові в скляному капілярі
капілярів діаметром менше 100 мкм, що мають прозорі стінки, коли виконується умова одноразового розсіювання. У більших капілярах починають позначатися ефекти багатократного розсіяння [42].
На рис. 3.10 показаний характерний вид доплеровских спектрів, зареєстрованих за допомогою диференціального ЛДА в модельному експерименті на скляному капілярі діаметром 210 мкм, за яким з однією і тією ж швидкістю, оціненої по об`ємній витраті, протікала розбавлена (/) і цільна (2) кров. Розведення було таким, що забезпечувався режим одноразового розсіювання. Звертає на себе увагу асиметрична форма спектра в другому випадку. Однак, незважаючи на багаторазове розсіювання, доплеровській спектр від цільної крові містить добре виражений максимум, за яким, власне кажучи, можна судити про швидкість течії. Це пояснюється тим, що еритроцити, що вносять основний внесок в розсіювання, за своїми розмірами більше ніж на порядок перевищують довжину хвилі випромінювання лазера, і їх індікатріса розсіювання різко витягнута вперед. Однак багаторазове розсіювання призводить до зміщення спектра. Якщо не враховувати це зміщення при вимірах, то можна отримати спотворені результати [36].
Велика об`ємна концентрація еритроцитів у цільної крові і наявність непрозорих стінок у великих одиночних судин унеможливлюють невозмущающіе оптичні вимірювання швидкості in vivo. Тому в таких випадках випромінювання вводять всередину судини за допомогою волоконно-оптичних катетерів діаметром 100-500 мкм [43, 44]. Ці ж катетери служать і для виведення розсіяного випромінювання з потоку. При цьому основний внесок в реєстрований сигнал вносять еритроцити, рухомі поблизу торця світловода, що дає просторову роздільну здатність вимірювань близько 100 мкм. Очевидним недоліком такого методу вимірювань є обурення потоку, так що реально вимірюється не справжня швидкість, а швидкість обтікання. Її відхилення від істинного значення залежить від відносних розмірів світловода і судини, а також від форми торця світловода. Проте подібні системи успішно застосовуються для вимірювання не тільки стаціонарних, але і пульсуючих потоків [45].
Діагностику ряду серцево-судинних, ендокринних, шкірних та інших захворювань можна проводити, вимірюючи порушення мікроциркуляції - кровотоку в мікросудинах приповерхневого шару органів. Такі вимірювання можна проводити безконтактно, реєструючи світло, розсіяне на еритроцитах, які рухаються в різних напрямках в шарі тканини товщиною 0,5-2 мм [46, 47]. У зондіруемой лазерним пучком області є капіляри, орієнтовані в різних напрямках і мають, отже, різні проекції на вектор розсіювання. Тому сигнал, що виникає в результаті оптичного змішання світла, розсіяного на рухомих еритроцитах і на відносно нерухомих тканинах, має характерний низькочастотний спектр, центрований біля нульової частоти, без виражених максимумів. Полуширина такого спектру, як було показано в модельних експериментах [46], пропорційна інтенсивності мікроциркуляції в досліджуваній області.
До теперішнього часу розроблено кілька модифікацій фотон-кореляційних волоконно-оптичних датчиків мікроциркуляції, застосування яких в умовах клініки показало їх високу ефективність [47, 48]. Розробляються також діють за таким же принципом компактні прилади, що використовують в якості випромінювача малогабаритні діодні лазери, інтегровані в один блок з детекторами [49].
