Вірусологічні методи дослідження при інфекційних хворобах
Вірусологічні дослідження в клініці інфекційних хвороб набувають все більшого значення, що в першу чергу обумовлено зростанням питомої ваги інфекцій вірусної природи, клініка яких не завжди типова. У той же час швидкі і надійні методи вірусологічної діагностики розроблені не для всіх інфекційних хвороб, багато з них трудомісткі, для їх проведення потрібні спеціальні умови, експериментальні тварини, поживні середовища та підготовлений персонал. В даний час для діагностики вірусних інфекцій використовують 3 основних види дослідження.
1. Мікроскопічне дослідження заразного матеріалу з метою виявлення вірусного антигену або патогномонічних змін в тканинах. У діагностичних цілях пряме мікроскопічне дослідження інфекційного матеріалу від хворих використовується при обмеженому числі вірусних інфекцій (сказі, вітряної віспи, жовтої лихоманки, герпес і ін.). Більш широке застосування отримав метод, заснований на виявленні вірусного антигену за допомогою флуоресціюючих антитіл. Метод иммунофлуоресценции може бути достовірним лише при чіткому виконанні всіх технічних вимог.
2. Вірусологічні методи.
3. Серологічні дослідження для визначення приросту титру антитіл в динаміці хвороби. Серологічні методи дослідження більш доступні в лабораторних умовах.
Для цих досліджень необхідно взяття сироватки крові в гострий період хвороби і в період реконвалесценції (парні сироватки). Проби крові для серологічних досліджень беруться стерильно без антикоагулянтів і консервантів.
Основними етапами вірусологічних досліджень є виділення вірусів, їх ідентифікація, характеристика основних біологічних властивостей. Для виділення різних груп вірусів в даний час не існує єдиної методики. Це в першу чергу обумовлено різноманіттям їх властивостей і особливостями культивування поза організмом господаря. Для дослідження використовують біосубстратами (змиви зі слизових оболонок, кров та її компоненти, спинномозкова рідина, сеча і випорожнення, біоптати органів і тканин або їх шматочки, взяті при аутопсії), які піддають спеціальній обробці з подальшим пассированием матеріалу. Взятий для дослідження матеріал повинен зберігатися при температурі від -20 ° С до -70 ° С. Залежно від попереднього діагнозу обробка матеріалу має свої особливості, але у всіх випадках передбачається отримання субстрату, максимально очищеного від домішок слизу, клітин органів і тканин або їх фрагментів, бактерій. Це досягається гомогенизацией досліджуваного матеріалу в спеціальному апараті або розтиранням в ступці на холоді з кварцовим склом (шматочки органів і тканин) з додаванням стерильного охолодженого (+4 С) 0,9 %
Відео: Найстрашніші віруси і хвороби в історії людства
розчину хлориду натрію до отримання 10-30% суспензії і подальшим центрифугуванням при 1500-3000 об / хв протягом 10-15 хв. Отриману таким чином надосадову рідину використовують для проведення подальших досліджень.
До інтенсивного розвитку і впровадження в широку практику методу культури тканин і клітин застосовувалося зараження експериментальних тварин або ембріонів курки. Ці методи застосовуються і в даний час. Виявлення вірусів з використанням тварин найбільш доцільно в тих випадках, коли вдається відтворити в експерименті типову картину інфекційного захворювання або окремі його прояви. Так, збудники групи арбовирусов і Коксакі можуть бути виявлені при зараженні в мозок мишей-шмаркачів, грипу - при зараженні курячих ембріонів або інтраназальному введенні досліджуваного матеріалу мишам. У вірусологічних лабораторіях в останні роки найбільш широко стали застосовувати метод культури клітин і тканин, що дозволяє виділяти аденовіруси, герпес-віруси, респіраторно-синцитіальних вірус, міксовіруси та інші вже на перших етапах дослідження здійснювати етіологічну діагностику захворювання. Підставою для цього є добре вивчені цитологічні особливості взаємодії більшості вірусів і клітин. Так, зараження клітин HeLa, Нер-2 матеріалом, що містить аденовірус 2-го типу, вже на 3-й добі призводить до зміни характеру зростання клітинного моношару і до появи типових клітин у вигляді виноградних грон і т. Д., Добре визначаються в звичайному світловому мікроскопі при малому збільшенні.
Виключне значення для етіологічної діагностики інфекційного захворювання має стандартизація виділення вірусу з досліджуваного матеріалу, що на даному етапі роботи передбачає використання генетично чистих лінійних тварин з урахуванням їх фенотипічних (в першу чергу вікових) особливостей. Це обумовлено перш за все тим, що експериментальні тварини різних генетичних ліній і віку в різному ступені сприйнятливі до вірусів. Так, при інтрацеребральному зараженні мишей нейротропним штамом WSN вірусу грипу у тварин ліній BALB / c, A, CBA і безпородних чутливість виявилася найбільшою, така ж закономірність встановлена і в випадках інтраназального введення досліджуваного матеріалу. Суттєве значення для кінцевих результатів роботи по виділенню вірусів має попереднє обстеження тварин, курячих ембріонів, культур клітин і тканин на предмет латентноговирусоносительства. Вельми широко використовуються в лабораторній практиці курячі ембріони можуть бути заражені вірусами лейкозу птахів, пташиного енцефаломієліту, інфекційного синуситу, пситтакоза, хвороби Ньюкасла, збудниками деяких бактеріальних інфекцій (паратифи та ін.), А також мікоплазмою. Ще більша кількість бактеріальних і особливо вірусних агентів здатне спонтанно заражати культуру клітин і тканин і переживати в них. Їх присутність суттєво впливає на оцінку досліджуваного матеріалу. Деякі види мікоплазм в культурі клітин
можуть обумовлювати гемаглютинацію і гемадсорбції і навіть утворювати під агаровим покриттям бляшки, подібні до утвореними вірусами. Важливе значення має також забруднення клітинних культур одного типу іншими, найбільш часто це буває пов`язано з клітинами HeLa і спостерігається при роботі з різними типами культур в одній кімнаті, при поганій обробці лабораторного посуду та ін. Наявність контамінації клітинних культур або зараження тварин бактеріальними агентами, як правило, проявляється досить чітко (зміна характеру росту моношару клітин, культуральної середовища, загибель курячих ембріонів або тварин з певною симптоматикою і т. д.) і особливих труднощів при оцінці результатів не представляє. Складніше йде питання з латентними формами інфекції, де потрібне застосування серологічних та інших методів. Ці вказівки повинні враховуватися в роботі лікаря-вірусолога, особливо при проведенні етіологічноїдіагностики неясних випадків захворювання.
