Культивування краснухи - краснуха
Відео: Краснуха у дітей. Симптоми, лікування, профілактика краснухи
Відео: Вирусолог Г.П. Червонська про краснуху і дифтерію
Спектр чутливих клітин. Вірусна етіологія краснухи встановлена Hiro і Tasaka в 1938 р Щоб виділити та ідентифікувати вірус краснухи (1962) знадобилося 24 роки. Тому дивним виявилося те, що вірус краснухи може розмножуватися в багатьох системах первинних і перещеплюваних клітин різного походження (С. А. Демидова та ін., 1968 Parkman е. А., 1964а- Ingalls е. А., 1967- Sordoc, 1971 ).
Розмноження вірусу підтримують багато видів первинних і перещеплюваних культур людського, мавпячого, кролячого, бичачого, пташиного і іншого походження. Однак тільки в дуже обмеженій кількості культур проявляється видиме цитопатическое дію (ЦПД) вірусу краснухи. Навіть в тих культурах, в яких ЦПД проявляється, воно часто залежить від техніки культивування, кількості пасажів, пройдених вірусом, від штаму клітин, серій середовищ, сироваток і т. Д. З цієї причини для кількісного визначення вірусу був розроблений непрямий метод титрування з використанням феномена інтерференції. Останній заснований на властивості культур, заражених вірусом краснухи, купувати резистентність до суперінфекції багатьма гетерологічними вірусами. Зазвичай для постановки реакції використовують вірус, який надає виражене цитопатическое дію в даній системі клітин. Найчастіше це віруси ECHO 11, Коксакі В5 і вірус везикулярного стоматиту. Про наявність вірусу краснухи в культурі судять за дією, що перешкоджає розвитку ЦПД дозволяє вірусу.
З первинних культур клітин людського походження стабільні прояви ЦПД вірусу спостерігали в культурі клітин амніону і щитовидної залози. Очевидне ЦПД зазначено також в первинних культуpax, отриманих з тканин ембріона і дорослого кролика (Norrby, 1969).
Однак первинні культури клітин не знайшли широкого застосування для ідентифікації та титрування вірусу краснухи по ЦПД. Більш зручним в цьому відношенні виявилися перещеплюваних клітини. Моношар таких культур клітин більш однорідний і ЦПД проявляється більш постійно і чітко. Серед клітин мавпячого походження ЦПД вірусу краснухи постійно виявляли в перещеплюваних лініях АН1, LLC-MK2 і особливо Vero. ЦПД вірусу краснухи постійно проявляється також у перещеплюваних клітинах нирки кролика LLC-RK, RK13 і рогівки кролика SIRC (В. В. Чеботарьов, 1971- Norrby, 1969). Широке застосування отримали клітини RK13, які частіше за інших використовуються для титрування вірусу не тільки по ЦПД, а й методом бляшок (Р. Г. Десятскова, О. Г. Анджапарідзе, 1968). (Рис. 1). В даний час найкращим клітинним субстратом для отримання високих титрів вірусу, приготування ГА і КС-антигену, а також для титрування по ЦПД і методом бляшок є перещеплюваних клітини нирки дитинча хом`ячка ВНК21 і особливо клон 13S цих клітин. За допомогою цих клітин, особливо при використанні суспензійний культур, можна отримати вірус в титрах до 10 + 8 ТЦД5о / мл, тоді як в інших культурах клітин титри вірусу рідко бувають вище 106 ТЦДбо / мл. А. І. Резепова і ін. (1972) для культивування і титрування вірусу краснухи по ЦПД використовували диплоїдні клітини легкого ембріона людини. ЦПД в цій культурі клітин виявляється на 5-7-у добу після зараження.
Взаємодія вірусу і клітин in vitro. Характерними особливостями, зазначеними при культивуванні вірусу краснухи in vitro, є слабко цитопатическое дію, схильність до формування хронічної інфекції і виражена резистентність заражених культур до суперінфекції гетерологічними вірусами.
У більшості культур клітин ЦПД вірусу краснухи проявляється зазвичай у вигляді дифузного ураження моношару. Для ЦПД вірусу краснухи не характерна ні круглоклеточная дегенерація, ні формування синцития. Зазвичай клітини втрачають нормальні обриси, підвищується їх преломляемость. Частина клітин при цьому відділяється від скла. У деяких випадках цитопатична зміни прогресують, приводячи до ущільнення і зморщення ядра і подальшого розриву клітини. У деяких лініях клітин спостерігали цитоплазматичні включення базофільною або еозинофільного характеру. ЦПД вірусу краснухи, що виявляється в клітинах RK13, відрізняється від такого в інших культурах клітин. У цій клітинній системі спостерігається швидкий цитопатичної ефект (в середньому через 40-50 год), який виражається у виникненні вогнищевих уражень моношару у вигляді так званих мікрофокусов (М. Б. Корольов та ін., 1973- McCarthy, 1969). На відміну від бляшок, які спостерігаються в інших клітинних системах і представляють вогнища деструкції клітин, мікрофокуси в клітинах RK13 є проліферативні клітинні маси, мають діаметр близько 0,2 мм.
У культурах клітин, заражених вірусом краснуЗсй, легко виникає хронічна інфекція (Norrby, 1969). ЦПД вірусу краснухи ніколи не поширюється на всі клітини, і тому навіть в культурах, де велика частина моношару вражена, повторної зміни середовища буває досить для виникнення хронічної інфекції. Персистенція вірусу спостерігається також в клітинах при повній відсутності видимого ЦПД. Хронічної інфекції вірусу краснухи схильні як диплоїдні, так і тетраплоїдні клітини. Хронічно інфіковані культури клітин були отримані також з тканин інфікованого краснухою плода і від дітей з ознаками вродженої краснухи (A. Boue, J. Воіё, 1969). Отримані культури можна було підтримувати в стані хронічної інфекції місяцями. При тривалому культивуванні хронічно інфікованих вірусом краснухи клітин LLC-MK2 і диплоїдних клітин людини не спостерігалося будь-яких морфологічних змін, проте в обох випадках відзначений більш повільне зростання в порівнянні з неінфікованими культурами. Plotkin і ін. (1965а) в хронічно інфікованих диплоїдних клітинах відзначали скорочення числа генерацій. Додавання до хронічно інфікованим культурам специфічних антитіл і адамантадіна (речовина, ингибирующее розмноження вірусу краснухи) не впливало на перебіг хронічної інфекції. Очевидно, вірус тісно асоційований з кліткою і передається від однієї генерації до іншої.
Як правило, інфіковані вірусом краснухи культури клітин і особливо хронічно інфіковані проявляють резистентність до зараження іншими вірусами. При цьому спектр вірусів, по відношенню до яких виникає резистентність, досить широкий (Parkman е. А., 1964а).
Механізм виникнення резистентності до суперінфекції гетерологічними вірусами, а також природа хронічної інфекції поки неясні.
Відомо, що вірус краснухи, розмножуючись в плоді, призводить до формування різноманітних аномалій розвитку. У зв`язку з цим особливий інтерес представляє дослідження характеру розмноження вірусу в культурах клітин людського походження. Як вже говорилося, в культурах клітин, отриманих з тканин ураженого краснухою плода, як правило, виявляється хронічна інфекція. Хронічну інфекцію можна також легко викликати при зараженні вірусом краснухи диплоїдних клітин, отриманих з різних органів нормального плода людини. Такі клітини можуть довго підтримуватися в лабораторії, проте тривалість їх життя, як правило, коротше, ніж у неінфікованих культур. Відзначено також, що вірус краснухи при дії in vitro на диплоїдні клітини, отримані з деяких органів ембріона, може привести до припинення митозов (A. Воіё, J. Воіё, 1969). При цьому в «молодих» культурах розмноження клітин припинялося протягом 4-8 пасажів, тоді як «старі» припиняли розмножуватися вже протягом 1-2 пасажів після зараження. Далі Plotkin і Vaheri (1967) виявили, що в культурах диплоїдних клітин WI-38, інфікованих вірусом краснухи, утворюється специфічний білок. Будучи екстрагований з інфікованих культур, він надавав інгібуючу дію на мітотичну активність нормальних диплоїдних клітин і був названий авторами «інгибіном». «Ингибин» виявляв термолабильность і не втрачав активності після обробки специфічними противірусними антитілами.
Цитогенетичне вивчення показало, що в заражених культурах диплоїдних клітин відсоток аберацій хромосом вище, ніж в незаражених. Так, за даними (A. Boue, J. Воіё, 1969), в хронічно інфікованих диплоїдних культурах відсоток аберантних клітин становив в середньому 20-25, тоді як в нормальних - близько 10. Дослідження, проведені в нашій лабораторії Л. В. Пряничникова (1971) з використанням штаму диплоїдних клітин L-58 і різних штамів вірусу краснухи, показали, що кількість аберантних клітин в хронічно інфікованих культурах приблизно в 3 рази вище, ніж в нормальних.
Існує, однак, думка, що хромосомніаберації не є результатом прямої дії вірусу на хромосоми, а скоріше залежать від загального дегенеративного процесу.
Кінетика розмноження і морфогенез. При вивченні кінетики розмноження вірусу краснухи в культурі перещеплюваних клітин ВНК.21 (Vaheri е. А., 1967) було показано, що екліпс-фаза становила близько 12 год. Протягом ранній стадії інфекції велика частина інфекційного вірусу була пов`язана з кліткою. У більш пізніх стадіях співвідношення позаклітинного і внутрішньоклітинного вірусу змінювалося на користь першого. Титри вірусу в середовищі досягали піку до 48-72 год.
При електронномікроскопіческом вивченні інфікованих культур (М. Б. Корольов та ін., 1973- Holmes е. А., 1969) було виявлено, що позаклітинний вірус починає з`являтися &lsquo-навколо окремих клітин приблизно через добу після зараження. Вірусні частинки звільнялися з клітки виключно за допомогою брунькування і набували зовнішню оболонку, проходячи через цитоплазматичну мембрану.
Формування віріонів краснухи здійснювалося по-різному: воно відбувалося на поверхні клітини, в вакуолях комплексу Гольджі і іноді безпосередньо в цитоплазматичному матриксе. Причини переважання того чи іншого способу формування неясні. Регулярне виявлення віріонів зазвичай починалося з 2-х діб після зараження. У наступні терміни кількість вакуолей в клітці сильно збільшувалася. Формування віріонів завжди здійснювалося брунькуванням, в процесі якого нуклеоид обволікає мембраною вакуолі або цитоплазми. Нуклеоїди були тісно пов`язані з мембраною клітини або вакуолі і ніколи не спостерігалися у вигляді скупчень в цитоплазмі. Holmes і ін. (1969) в пізні стадії інфекції спостерігали також аберрантние форми, що представляють собою великі частинки, що містять два або три нуклеоида.
Таким чином, процес формування віріонів краснухи протікає виключно в цитоплазмі чутливої клітини, що підкреслює схожість вірусу краснухи з арбовирусами групи А.
