Бактеріологічні та серологічні методи дослідження при інфекційних хворобах

Відео: АБУЛЬФАТ АЛИЕВ, b lf t Al yev - ВДОСКОНАЛЕННЯ ДІАГНОСТИКИ бруцельоз

Встановлення етіології захворювання полегшує і уточнює постановку діагнозу. Лабораторне дослідження є одним з багатьох об`єктивних методів, і користуватися ним слід раціонально. Неправильна оцінка даних лабораторного дослідження може привести до діагностичних помилок. Так, отримання негативного результату - ще не підстава для виключення можливого діагнозу. Негативний результат може бути наслідком неправильного забору матеріалу, несвоєчасної доставки його в лабораторію, недосконалу методику бактеріологічного дослідження. Якщо матеріал береться не в перші дні захворювання, а вже на тлі етіотропної терапії, збудник може бути не виділено через пригнічення його життєздатності або загибелі під дією проведеного лікування. Тому низький питома вага підтверджених бактеріологічно менінгококової менінгоенцефаліту, так як навіть одноразове введення пеніциліну зазвичай робить непотрібним подальше бактеріологічне дослідження. Позитивні результати бактеріологічних досліджень можуть бути визначальними для постановки діагнозу, наприклад при виділенні гемокультури палички черевного тифу, паратифів А і В, при виявленні менінгококів, пневмококів, палички інфлюенци в спинномозковій рідині. Однак знаходження мікробів у інших субстратах не завжди дозволяє точно встановити діагноз. Так, якщо дифтерійна паличка, менінгококи, пневмококи і паличка інфлюенци виділяються з носової частини глотки, слизу із зіву і носа, а сальмонели - з калу, то це може бути захворювання іншої етіології у бактеріоносіїв названих мікробів. Найбільші труднощі для інтерпретації позитивних знахідок при бактеріологічному дослідженні представляє виділення умовно-патогенних видів бактерій, широко поширених серед родин Micrococсаеае і Enterobacteriaceae. Тому при постановці діагнозу захворювань, викликаних умовно-патогенними збудниками, треба проявляти обережність і виходити з 4 критеріїв: многократности виявлення даних видів, масивності їх зростання в посівах на щільні поживні середовища, антигенну та фаговаровой однорідності виділених субкультур і діагностичного наростання титрів гомологічних антитіл при серологічних дослідженнях.
Мікробіологічні методи дослідження поділяються на методи прямого виявлення збудника в організмі хворого - бактеріоскопічне і бактеріологічне дослідження-методи непрямого докази наявності збудника в організмі хворого - серологічні дослідження, спрямовані на виявлення специфічних антигенів в інфікованому матеріалі або антитіл в сироватці крові і секретах організму хворого.
Бактеріоскопічне дослідження крові, сечі, спинномозкової рідини, слизу із зіву і носа, калу і різних патологічних субстратів на присутність збудника застосовують при багатьох інфекційних хворобах. Цей метод має досить обмежене застосування, хоча і дуже важливий. Він використовується, зокрема, для виявлення в крові збудників малярії, поворотного тифу, лептоспірозу. Спинномозкову рідину досліджують при гнійному і туберкульозному менінгіті, слиз із зіву і носа - при дифтерії, ангіні Венсана, кал - при амебіазі, балантідіазі, лямбліозе- сечу - при лептоспірозі. Палички чуми, сибірської виразки можна побачити в пунктаті чумного бубону і мазках-відбитках, взятих з сибиреязвенного карбункула- при мікроскопії мазка пунктату з кісткового мозку і селезінки, грануляцій з виразки можна виявити лейшманіі- в мокроті - мікобактерії туберкульозу. Перевага бактериоскопического методу полягає в його швидкості. Результати аналізу можуть бути отримані через кілька годин. При деяких захворюваннях (малярія, епідемічний цереброспінальної менінгіт та ін.) Збудники можуть бути виявлені в організмі хворого вже в 1-й день хвороби, що дуже важливо для своєчасної діагностики та лікування. Значно розширилися можливості, бактеріоскопічної діагностики завдяки обробці препаратів специфічними сироватками, що містять антитіла до даного збудника, мічені флуорохромами (імунофлуоресцентний метод) або ферментами (імуноферментний метод). При цьому мічені антитіла з`єднуються з антигеном, який виявляється при імунофлуоресцентний методі під люмінесцентним мікроскопом, а при иммуноферментном методі - по фарбуванню продукту ферментативної реакції після введення субстратної-індикаторного суміші.
Бактеріологічний метод діагностики заснований на виділенні збудника з крові, спинномозковій рідині, мокротиння, слизу із зіву і носа, калу, сечі, жовчі хворого, а при летальні випадки - зі шматочків органів, які засівають на спеціальні живильні середовища. Бактеріологічна діагностика широко використовується для дослідження слизу із зіву і носа на дифтерійні бактерії, для виділення збудників кишкових інфекцій (наприклад, холери, дизентерії, сальмонельозів, ешеріхіозов) з калу хворого, збудників пневмонії - з мокротиння і в інших випадках. При цьому враховують особливості передбачуваної інфекції, місце виборчої локалізації збудника та шляхи його виділення в навколишнє середовище. Дослідження дає позитивні результати вже в перші години або дні хвороби. Однак остаточну відповідь лабораторія при більшості інфекційних хвороб повідомляє лише через 2-4 дня, а при бруцельозі, туберкульозі - через 3-4 тижнів. Це залежить від термінів, потрібних для росту мікроорганізмів і їх ідентифікації (біохімічної і серологічної). Кожен мікроб для свого зростання вимагає відповідної живильного середовища. Залежно від того, який мікроб припускають виділити (що визначається при клінічному і епідеміологічному обстеженні хворого), вибирають відповідну живильне середовище. Іноді посів проводять одночасно на кілька поживних середовищ. Цінність результатів бактеріологічних досліджень багато в чому залежить від того, чи правильно взято матеріал у хворого і чи правильно він доставлений в лабораторію. Інфекційний матеріал збирають в стерильний посуд, дотримуючись правил асептики.
У табл. 1 наведені основні дані про терміни взяття матеріалу для дослідження і середовищах для первинного посіву.
Матеріал для дослідження в найкоротші терміни повинен бути доставлений в лабораторію. Якщо такої можливості немає, його потрібно зберігати в холодильнику при +4 ° С або додавати консервант. У деяких випадках посів необхідно виробляти ex tempore (при кашлюку, менінгококової інфекції, гонореї). Після виділення та ідентифікації збудників, як правило, визначають їх чутливість до антибіотиків та інших хіміопрепаратів. Це багато в чому допомагає скорегувати терапію і підібрати ефективне етіотропне засіб.
При інфекціях, що викликаються умовно-патогенними бактеріями, виділення їх з субстратів, в нормі не є стерильними (кал, сеча, харкотиння та ін.), Не розглядається як безумовний доказ етіологічної ролі цих мікроорганізмів в генезі захворювання. Обсемененность ендогенної мікрофлорою у хворих значно вище, ніж у бактеріоносіїв. Тому тільки кількісний облік висіяних мікроорганізмів тварин заражають підозрілим матеріалом (биопроба на мишах при пневмококової інфекції).

Таблиця 1 Терміни взяття матеріалу при бактеріальних інфекціях

Серологічні дослідження. Реакції імунітету широко використовують для діагностики інфекційних захворювань у людини. Розрізняють реакції, в яких по відомим антитіл визначають невідомі антигени, і реакції, спрямовані на пошук невідомих антитіл по відомим антигенів. Перспективні методи, засновані на виявленні в ранній період хвороби мікробних антигенів в різних субстратах. Це завдання лише частково може вирішити реакція зв`язування комплементу (РСК). Більш чутливим методом виявилася реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РИГА) з анти еритроцитарних діагностикумів, яка застосовується для діагностики дизентерії та деяких інших інфекцій. При цій реакції знаходиться на поверхні танізірованних еритроцитів специфічний імуноглобулін зв`язується з гомологічним антигеном. Еритроцити людини і тварин (нативні і формалінізірованную), попередньо оброблені таніном, набувають підвищену здатність адсорбувати на своїй поверхні білкові субстанції. Як адсорбенти крім еритроцитів використовуються латекс, колодій, бентоніт і ін. Реакція латекс-аглютинації застосовується для виявлення антигенів пневмококів, палички інфлюенци, менінгококів. При позитивній реакції частки латексу випадають в осад. Практичне значення набуває такий високо чутливий і специфічний метод визначення бактеріальних антигенів, як зустрічний іммуноелектрофорез (ВІЕФ). В останні роки для діагностики різних інфекцій стала застосовуватися реакція коагглютинации. Це реакція між антигеном і антитілами, фіксованими на поверхні золотистих стафілококів, що містять протеїн А (компонент клітинної стінки більшості штамів золотистих стафілококів). Останній має здатність з`єднуватися з Fc-фрагментом Ig G. У результаті утворюється імуносорбент за типом антительного диагностикума, який вступає в реакцію з гомологічним антигеном за рахунок вільних Fab-фрагментів імуноглобуліну. Візуально це виражається феноменом аглютинації стафілокока. Застосування реакції коагглютинации перспективно для швидкого виявлення бактеріальних антигенів в крові, спинномозковій рідині, мокротинні і іншому матеріалі.
У лабораторній практиці застосовують також імунофлуоресцентний метод Кунса, коли за допомогою флуоресцентного барвника, приєднаного до молекули антитіла, реакція антиген-антитіло стає видимою в люмінесцентний мікроскоп. На відміну від інших серологічних реакцій, коли про з`єднання антигену з антитілом судять по якій Ви їм вторинному ефекту (аглютинації, преципітації та ін.), Імунофлуоресцентний метод дозволяє безпосередньо спостерігати що відбувається реакцію і, отже, судити про наявність і локалізації антигену.
В даний час великого поширення набуває імуно-ферментний метод, що володіє високою чутливістю і універсальністю. Цей метод заснований на визначенні антигенів за допомогою імуно
сорбенту, пов`язаного з ферментом. Така реакція між антигеном і антитілом отримала назву ELISA (enzymelinked immunosorbent assay). Наприклад, якщо треба виявити антиген в клітці при наявності відповідного гомологичного антитіла, можна з`єднати фермент ковалентно з антитілом і потім цим антитілом, міченим ферментом, прореагувати з антигеном.
Найчутливіший, що дозволяє виявити малий вміст антигенів (0,5 нг / мл), - радіоімунний метод, однак він вимагає спеціального обладнання.
Перераховані методи мають ряд переваг перед бактеріологічним. Це методи експрес-діагностики, що дозволяють визначити антигени збудників протягом декількох хвилин або годин. Незважаючи на загибель бактерій після проведеної етіотропної терапії, антигени збудників можуть персистувати в організмі від 3 до 4 тижнів і виявлятися даними методами. Проте слід враховувати, що існує широке антигенну спорідненість між пологами і видами всередині кожного сімейства бактерій і навіть серед різних сімейств. Це може привести до отримання хибнопозитивних результатів. Визначення антигенів бактерій не дозволяє встановити чутливість збудників до антибіотиків, що також знижує значимість цих методів.
Серологічні реакції, спрямовані на пошук специфічних антитіл в сироватці крові хворих бактеріальними інфекціями, використовуються для постановки ретроспективного діагнозу, так як вони стають позитивними до кінця 1-2-го тижня хвороби. Надалі їх титр зазвичай наростає, що є в діагностичному відношенні дуже важливим показником. Тому серологічні реакції рекомендується повторювати з інтервалом в 5-10 днів. Реакції вважаються позитивними в тому випадку, якщо титр їх підвищується при повторному дослідженні в 4 рази і більше. Однак при тривалому захворюванні (бруцельоз, туляремія, хронічна пневмонія) динаміка серологічних реакцій менш виразна, тому доводиться орієнтуватися на висоту титру антитіл. Діагностичну цінність мають лише певні рівні антитіл. Наприклад, для діагностики кишкових інфекцій в РИГА значення має титр 1: 320-1: 640 і вище (сальмонельози, дизентерія). При цьому необхідно враховувати епідемічну обстановку в даній місцевості і брати до уваги «нормальний» рівень антитіл у здорового населення. У РНГА, яка використовується для пошуку антитіл, при адсорбції на еритроцитах застосовуються не імуноглобуліни, а полісахаридні або білкові антигенні субстанції. Такі еритроцитарні діагностикуми називають антигенними. Крім реакцій аглютинації в діагностиці бактеріальних інфекцій використовують РСК, реакцію непрямої гемолізу, реакцію непрямої імунофлуоресценції, непрямої імуноферментний метод, реакцію нейтралізації та інші серологічні методи.
Серологічні реакції мають лише відносну достовірність, так як можуть бути неспецифічними або позитивними у осіб, які перенесли відповідну інфекцію в минулому (анамнестична реакція), а також у отримали профілактичні щеплення (зі щеплення реакція). Для більш об`єктивної оцінки результатів серологічних досліджень використовують диференційоване дослідження антитіл різної фізико-хімічної природи. Антитіла однієї і тієї ж імунологічної специфічності можуть належати до різних класів імуноглобулінів і внаслідок цього якісно відрізнятися по функціональної активності. Саме фізико-хімічний тип антитіл визначає характер і інтенсивність спричинених ними таких імунологічних реакцій, як лізис, аглютинація, нейтралізація антигенних і токсичних властивостей, в яких полягає біологічний сенс реакції антиген - антитіло. В даний час розрізняють 5 основних класів імуноглобулінів людини: Ig G, Ig M, Ig A, Ig D і Ig E. В реакціях гуморального імунітету основна роль належить першим 3 класами. При гострому інфекційному захворюванні на ранніх стадіях імунної відповіді в сироватці крові починають визначатися спочатку макроглобуліновие Ig M з константою седиментації 19S, а потім в більш пізні терміни з`являються гамма-глобуліновие антитіла класу G з константою седиментації 7S. Надалі 78-антитіла переважають, а синтез 198-антитіл виявляється короткочасним. Обробка сироваток крові редукуючими речовинами (2-меркаптоетанолом, цистеїном і ін.) Призводить до виборчої інактивації Ig M, не впливаючи на Ig G. Титр антитіл, який визначається в сироватці після обробки її редуцирующим речовиною, відповідає кількості 78-антитіл. Визначення антитіл різної фізико-хімічної природи допомагає встановити етап хвороби, відрізнити інфекційне захворювання від анамнестичних реакцій, при яких в основному визначаються 198-антитіла, виявити хронічних бактеріоносіїв черевного тифу, коли порушується синтез 198-антитіл і переважають 78-антитіла.
Перехресні реакції, пов`язані з наявністю загальних антигенів серед різних бактерій, звичайно, ускладнюють правильне тлумачення результатів серологічних досліджень. Однак завдяки вивченню динаміки циркулюючих антитіл і визначення імуноглобулінів різних класів вдається встановити справжню природу захворювання. Серологічні дослідження допомагають уточнити клінічний діагноз, а при інфекціях, що викликаються умовно-патогенними бактеріями, підтвердити їх роль в етіології захворювання при позитивних бактеріологічних знахідки, особливо в тих випадках, коли дослідження проводяться на тлі антимікробної терапії. Серологічні методи в лабораторної практиці мають допоміжне значення і не можуть замінити бактеріологічне дослідження. Комплекс мікробіологічних досліджень дозволяє конкретизувати синдромологический клінічний діагноз і встановити причину тих захворювань, які мають поліетіологічним природу. Необхідність таких досліджень обумовлена їх важливою роллю в диференціальної діагностики інфекційних хвороб та виборі цілеспрямованої етіотропної терапії.