Додаток 2 - криптоспоридіоз і віл-інфекція
4. Метод флюоресцентного фарбування.
Товсті мазки свіжих фекалій висушити на повітрі, провести через розчин аурамін з фенолом, промити водою і швидко пофарбувати (5-10 хв) в розчині карболового фуксину. Після промивання водою висушити на повітрі і досліджувати за допомогою люмінесцентного мікроскопа (краще з иммерсионной системою).
Результати: Ооцисти криптоспоридий мають вигляд яскраво флуоресціюючих дисків, чітко помітних на темно-червоному тлі.
IV. Методи збагачення: флотація і седиментация.
Як флотаційних рідин використовують насичені розчини хлориду натрію або сахарози, насичений розчин сульфату цинку (331 г nSО4.7H2Про розчинити в 1 л водопровідної води). Для флотації використовують також середу Бреза (суміш насичених розчинів сульфату магнію і тіосульфату натрію і водопровідної води в співвідношенні 3: 3: 1), суміш Павлесека (хлорид цинку - 220 г, хлорид натрію - 210 г, водопровідна вода-800 мл) та ін .
1. Флотация з центрифугуванням.
Центрифугування прискорює процес флотації ооцист, а також дозволяє відмивати фекалії, зводячи до мінімуму забруднення препарату жиром або детритом. При відмиванні фекалій їх розбавляють водою, а не флотаційного рідиною, і проціджують в центрифужную пробірку об`ємом 15 мл. Досліджуваний матеріал необхідно центрифугувати протягом 1-2 хв при 2-3 тис. Об / хв або 3-4 хв при 1500 об / хв. Після першого (отмивочного) центрифугування супернатант видалити, при цьому обсяг, що залишився осаду не повинен перевищувати 1 мл. Додати в пробірку флотационную рідина на половину її обсягу і ресуспендувати в ній осад за допомогою піпеток з гумовим балоном або скляної палички. Потім долити флотационную рідина до верхнього краю пробірки і центрифугувати повторно в тому самому режіме- в результаті ооцисти сконцентруються в поверхневій плівці рідини. Матеріал з цієї плівки зібрати металевою петлею або скляним капіляром, нанести на предметне скло, фіксувати сумішшю Никифорова і пофарбувати відповідним методом, після чого піддати мікроскопії.
2. Методи седиментації.
Зазвичай застосовують седиментацію ефіром, для чого 0,5-1,0 г фекалій необхідно змішати з 10-12 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. Ретельно перемішану суспензію процідити через 2 шари марлі в центрифужную пробірку об`ємом 15 мл. Осад двічі промити фізіологічним розчином при центрифугуванні, потім ретельно ресуспендувати в 10 мл 10% розчину формаліну, додати 3 мл ефіру і ретельно перемешать- попередньо закривши пробірку пробкою. Отриману суміш центрифугувати протягом 2 хв при 1 тис. Об / хв. Ефір, поверхневий детрит і формалін злити, а з залишився на дні пробірки осаду зробити мазки і пофарбувати одним з описаних раніше методів.
Відео: Сіфіліада.Пріложеніе2.Больная (В.Гаухман) Ісп.Н.Вербенко
При модифікованому методі ефірної седиментации 0,5 мл рідких фекалій змішати з 3 мл 10% розчину формаліну і розмішати до отримання гомогенної суспензії. Додати 30 мл етилового ефіру і ретельно переміщати шляхом струшування, потім додати 15 мл 10% розчину формаліну, перемішати і процідити отриману суміш через марлю в центрифужную пробірку. Кінець піпетки з гумовим балоном обережно (у цілому стінок пробірки) опустити нижче шарів ефіру і детриту, відсмоктати нижній стовпчик рідини і перенести його в іншу пробірку. Нову пробірку долити 10% розчином формаліну і центрифугувати протягом 10-15 хв. при 3 тис. об / хв (тривалість центрифугування пропорційна в`язкості розчину), з осаду приготувати мазки і пофарбувати їх одним із звичайних способів.
V. біопроб на мишах
Відео: Як працює Московський центр профілактики і боротьби зі СНІДом
Для постановки біопроб необхідно згодувати невеликі порції фекалій новонародженим або 2-5-денним білим мишам. При наявності в пробах ооцист криптоспоридий в фекаліях мишей через 5-8 днів будуть виявлятися ооцисти. При розтині мишей в більш ранній період (оптимально на 3-7-й дні) в гістологічних препаратах кишечника (переважно, в препаратах клубової кишки) будуть виявлятися ендогенні стадії розвитку криптоспоридий, що локалізуються в зоні щіткової облямівки.
При постановці біопроб на тварин можна до гомогенату фекалій додавати антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин, гентаміцин), які пригнічують супутню мікрофлору, але не впливають на інвазивність ооцист криптоспоридий.
Відео: Plague Inc Evolved - # 2 - Смерть приходить з півночі
Кількість ооцист криптоспоридий підраховують за допомогою камери Горяєва, використовуваної в гематологічної практиці. Після інкубації, стимулюючої Ексцістірованіе ооцист, можна таким же способом підрахувати і кількість спорозоїтів.
Для кількісних визначень можна також підраховувати загальна кількість ооцист в пофарбованому мазку, приготовленому з певної кількості фекалій (наприклад, з 0,2 г).
За редакцією професора Фролова В. М.
Доктор медичних наук Пересадін Н. А., професор Федченко С. Н., асистентом Бакланова А. В.
