Лабораторна техніка - краснуха
Відео: НЕЙМОВІРНІ ВИПАДКОВІ ВИНАХОДИ. ЕКСПЕРИМЕНТИ, НАУКА І ТЕХНІКА, ХІМІЯ, ВИАГРА, ТОП ВИНАХОДІВ 18+
Відео: Хімічна посуд з Китаю
Отримання антисироваток. Техніка отримання антисироваток до вірусних антигенів докладно описана Habel і Salzman (1972). Найбільш зручним тваринам для отримання імунної сироватки проти вірусу краснухи, як і проти більшості вірусів, є кролик. Найпоширеніша схема іммунізаціі- триразове введення в вушну вену по 5 мл віруссодержащей рідини з інтервалами 2-3 тижнів. Кроликів знекровлюють через тиждень після останнього введення. Культуральна рідина, що застосовується для імунізації, не повинна містити велику кількість білка. Для приготування такої рідини моношар заражених клітин ретельно відмивають від попередньої середовища і потім вносять підтримуючу середу, що не містить сироватки, яка і використовується для імунізації.
У нашій лабораторії для отримання великих кількостей сироватки успішно використовували овець (Р. Г. Десятскова, Е. Ф. Опочинська, 1973). Імунізацію проводили триразово, використовуючи штам вірусу краснухи Sp-2. При першій і другій імунізації вірус вводили одночасно в вену і внутрішньом`язово в дозі 3,3- 8,1Х108 БОЮ, а при третій - тільки внутрішньовенно в дозі 4,2Х108 БОЮ. Інтервали між першим і другим введенням вірусу становили 3 тижнів, а між другим і третім - 1 тиждень. Тварина знекровлювали через 7 днів після останнього введення. Титри антігенагглютінінов в сироватці становили 512-1024.
Виділення та ідентифікація вірусу краснухи. У практичній діяльності вірусолог може зіткнутися з необхідністю виділення вірусу з носоглотки або крові хворого на краснуху. У нашій лабораторії використовували техніку виділення і подальшої ідентифікації вірусу краснухи, відпрацьовану Р. Г. Десятсковой.
Тампони з носоглотковим виділенням поміщали в стерильні пробірки з 3 мл розчину Хенкса, що містить 0,5% желатину, 1000 ОД / мл пеніциліну, 500 ОД / мл стрептоміцину і 20 ОД / мл нистатина. Маніпуляцію взяття слизу з носоглотки слід проводити енергічно- бажано також взяття слизу з носа, для чого в кожну ніздрю вставляють на кілька хвилин ватний тампон. Кров брали з пальця або з вени в пробірки з сухим гепарином. Проби доставляли в лабораторію в льоду і в разі необхідності до дослідження зберігали при температурі -40 °.
Посів випробовуваних проб виробляли на пробирочную культуру клітин RK13. Посівна доза клітин на кожну пробірку становила 120 000-150 000 клітин в 1 мл середовища 199, що містить 10% сироватки великої рогатої худоби. Інокуляцію здійснювали після формування моношару, зазвичай через 3-4 дня. У кожну пробірку вносили по 0,5 мл матеріалу з носоглотки і по 0,1 мл крові. На кожну пробу брали 3-4 пробірки. Після години контакту при кімнатній температурі в пробірки додавали по 1 мл середовища 199 з 6% Гретою обробленої каоліном сироватки великої рогатої худоби і інкубували при температурі 35 °. Для адаптації та накопичення вірусу інокулював культури піддавали 3-4 сліпим пасажем через кожні 8- 10 днів.
Індикацію та ідентифікацію вірусу краснухи проводили по інтерференції з вірусом везикулярного стоматиту (ВВС) у тій же культурі клітин. Дозволяє вірус ВВС в дозі 100-320 ТЦД50 вносили через 7-9 днів після зараження досліджуваним агентом. Результати реакції враховували через 48-96 год, коли в контрольних пробірках дозволяє вірус викликав чітку дегенерацію. У культурах, що виявляють резистентність до дії ВПС, можна було припускати наявність интерферирующего вірусного агента. .
Для ідентифікації виділених вірусних штамів використовували гипериммунную сироватку вівці, імунізованих вірусом краснухи (див. Вище). Можна користуватися також антисироваткою будь-якого походження. Сироватку в розведенні 1: 8 змішували з рівним об`ємом випробуваного вірусу в розведенні 1: 10 і витримували 2 год при кімнатній температурі. Середовищем розведення служив 0,5% розчин лактальбумина в розчині Ерла. У кожну пробірку з культурою клітин RK13 вносили по 0,2 мл суміші сироватки і вірусу і інкубували протягом години при кімнатній температурі (культуральну рідину перед цим видаляли). Потім в пробірки додавали середу 199 з 2% обробленої каоліном сироватки великої рогатої худоби і інкубували культуру при температурі 35 °. Після 7 днів інкубації культуральну рідину видаляли і в пробірки вносили по мл дозволяє вірусу в дозі 100-320 ТЦД50, розведеного тієї ж середовищем. Реакцію враховували після появи дегенерації в контрольній культурі клітин. Наявність цитопатичної дії в дослідній культурі свідчило про нейтралізацію вірусу специфічною сироваткою. Одночасно відчували сироватку на токсичність і проводили контроль робочої дози дозволяє вірусу.
У нашій лабораторії був успішно застосований «класичний» спосіб індикації та ідентифікації вірусу краснухи з використанням первинної культури нирки зеленої мавпи і як дозволяє вірусу ECHO і (Parkman е. A., 1964b), проте, на наш погляд, цей спосіб мало придатний для звичайної вірусологічної практики.
Методи ідентифікації, засновані на спостереженні безпосереднього цитопатичної дії вірусу краснухи, рідко використовуються для виявлення циркулюючих штамів вірусу, так як «дикі» штами без попередньої адаптації зазвичай не надають цитопатического ефекту на культуру. Прояви ЦПД вірусу краснухи взагалі досить примхливі і часто залежать від штамів клітин, серій середовищ, сироваток і т. Д., Що дало нам підставу рекомендувати для виділення вірусу непрямий метод.
Титрування вірусу. Вірус краснухи титрують як непрямим методом, заснованим на інтерференції, так і прямим, в основі якого лежить безпосередньо спостерігається цитопатическое дію. При непрямому методі титрування можна користуватися методикою, наведеною вище при описі індикації вірусу. Потрібно тільки включити етап приготування десятикратних розведень вірусу. В якості підтримуючої середовища після інокуляції культур клітин різними розведеннями вірусу вживається середовищі 199 з 2% обробленої каоліном сироватки великої рогатої худоби. За титр приймають найбільше розведення, яке охороняє 50% заражених культур від дегенерації, спричиненої що дозволяє вірусом. Титри вірусу висловлюють в InDso / мл (интерферирующие дози).
Для титрування вірусу прямим методом використовують культури клітин, схильні до ЦПД вірусу краснухи. Найчастіше це RK13 (Hopps е. А., 1969), рідше-SIRK і ВНК21. Зазвичай в пробірку з культурою вносять по 0,2 мл відповідного десятикратного розведення вірусу і після контакту протягом години при кімнатній температурі додають підтримуючу середу. За титр приймають найбільше розведення вірусу, що надає цитопатическое дію на 50% інокульованої культур (ТЦД50).
У дослідних лабораторіях для титрування вірусу краснухи широко користуються методом бляшок. Найчастіше для цих цілей використовують клітини RK13. Для практичних лабораторій цей метод настільки складним, тому ми не наводимо його докладну розповідь, а обмежуємося відповідними посиланнями (Р. Г. Десятскова, О. Г. Анджапарідзе, 1968 Hopps е. А., 1969).
Серологічні дослідження. Виділення вірусу краснухи - вельми трудомістка процедура і навряд чи може знайти широке поширення. Для практичних цілей набагато більшу цінність представляють серологічні реакції. З їх допомогою можна протягом декількох днів підтвердити діагноз краснухи, досліджувати стан імунітету тієї Або іншої групи населення, встановити ефективність вакцинації і т. Д. Антитіла до вірусу краснухи виявляються в реакціях нейтралізації (PH), гальмування гемаглютинації (РГГА), зв`язування комплементу ( РСК) і иммунофлуоресценции (РІФ). На практиці найбільшого поширення набула РГГА в силу її простоти, специфічності і швидкості отримання результатів. Наводимо докладний опис цієї реакції.
Реакція гальмування гемаглютинації. РГГА вірусу краснухи вперше описали Stewart і ін. В 1967 р Автори знайшли спосіб видалення з сироваток термостабільних інгібіторів гемаглютинації вірусу краснухи, що представляють собою | 3-ліпопротеїни. З цією метою сироватки, використовувані в реакції, обробляють 25% суспензією каоліну. У нашій лабораторії в основному застосовують кілька модифіковану методику цих авторів. Дослідивши більше 10 000 сироваток, ми можемо рекомендувати цей метод як досить точний і найбільш доступний для вірусологічних лабораторій нашої країни.
Як розчинник використовують глюкози-желатино-вероналовий буферний розчин (ДЖВ).
Каолін. 25% суспензію каоліну готують за методом Clarke і Casals (1958) шляхом чотириразового відмивання в фосфатному буферному розчині pH 7,2. Наважку каоліну 250 г змішують з 750 мл буферного розчину, енергійно струшують і дають відстоятися. Після заміни надосадової рідини свіжим розчином процедуру повторюють. Остаточну суспензію автоклавують протягом 30 хв при 115 атм. і потім зберігають при температурі 4 °. Перед вживанням фосфатний буферний розчин замінюють рівною кількістю ДЖВ.
Еритроцити. Ми віддаємо перевагу еритроцитів дорослих голубів, хоча користуємося також еритроцитами одноденних курчат. У курчат беруть кров шляхом декапитации, а у голубів-донорів - з серця. При цьому одномоментно у голуба беруть 5 мл крові в шприц з 5 мл розчину Альсевера. Кров до використання (зазвичай протягом тижня) зберігають в розчині Альсевера в співвідношенні 1: 10, 1: 20. Перед використанням еритроцити фільтрують і тричі відмивають в десятикратному кількості ДЖВ шляхом послідовного центрифугування протягом 10 хв при 1200 об / хв. З осаду готують 0,25% суспензію еритроцитів для реакції і 50% суспензію для обробки сироваток.
Обробка сироваток. Досліджувані сироватки для видалення неспецифічних інгібіторів і запобігання спонтанної аглютинації прогрівають при температурі 56 ° протягом 30 хв і обробляють каоліном і еритроцитами. До 0,1 мл прогрітій сироватки додають 0,3 мл 25% суспензії каоліну і витримують суміш при кімнатній температурі протягом 20 хв, кілька разів енергійно струшуючи. Після цього суміш центрифугують протягом 15 хв при 2000 об / хв і, не відсмоктуючи надосадову рідину, додають 0,05 мл 50% суспензії еритроцитів. Після години контакту при 4 °, протягом якого еритроцити необхідно 2-3 рази злегка збовтувати, суміш знову центрифугують при 1500 об / хв протягом 10 хв. Процедуру центрифугування можна замінити инкубацией при 4 ° С протягом ночі. Надосадова рідина є сироватку в розведенні 1: 4.
Постановка РГГА. Реакцію проводять в макро- і мікромодіфікаціі. При постановці реакції макрометодом користуються пластмасовими панелями з ємністю лунок 1,5 мл. Мікрометодіку здійснюють за допомогою мікротитратор Такач фірми «Метрімпекс» (Угорщина). При титруванні антигену, приготуванні робочої суспензії еритроцитів і розведень досліджуваних сироваток використовують ДЖВ, що містить 0,2% альбуміну великої рогатої худоби, який додається для стабілізації реакції. При відсутності альбуміну великої рогатої худоби можна користуватися людським плазмовим альбуміном, одержуваних з відходів глобулинового виробництва, або розчином плазмового альбуміну для внутрішньовенного введення (Р. Г. Десятскова і ін., 1971).
Оскільки макро- і микрореакции проводять ідентичним чином, наводимо опис макрореакціі, а обсяг інгредієнтів, що вносяться при микрореакции, поміщаємо в круглих дужках. При титруванні антигену для визначення робочої дози дворазові розведення роблять у обсязі 0,4 (0,05) мл-0,25% суспензію еритроцитів вносять в обсязі 0,2 (0,025) мл. Всі інгредієнти охолоджуючої
Дають до 0 гр. в крижаній бані. Результати враховують через 1,5-2 год інкубації при температурі 4 °. При розведенні антигену в микрореакции краще користуватися мікропіпеткою. За титр антигену приймають найбільше розведення, що викликає виразну агглютинацию. Робоча доза антигену при постановці РГГА містить 4 одиниці.
Дворазові розведення досліджуваних сироваток виконують в обсязі 0,2 (0,025) мл. До кожного розведення сироватки додають 0,2 (0,025) мл робочого розведення антигену, витримують суміш протягом години при кімнатній температурі і потім додають 0,2 (0,025) мл 0,25% суспензії еритроцитів, охолодженої в льоду. Реакцію враховують через 2-3 год інкубації при температурі 4 °.
При постановці реакції мікрометодом контакт сироватки та антигену краще проводити при температурі 4 ° С протягом 2 год, так як результати реакції, що проводиться цим методом, в більшій мірі залежать від дотримання режиму охолодження.
Титром сироватки вважають найбільше розведення, повністю переважна гемаглютинацію. Сироватку вважають негативною в тому випадку, коли придушення аглютинації не спостерігають в розведенні 1: 8.
Кожну серію титрування супроводжують відповідними контролями: титруванням імунної сироватки з відомим титром антитіл, негативної сироватки, контролем сироватки і еритроцитів на наявність спонтанної аглютинації. При проведенні двох останніх контролів відсутність відповідних компонентів компенсують відповідним обсягом ДЖВ. Бажано використовувати бідистильовану воду.
В даний час не існує стандартної методики постановки РГГА вірусу краснухи, яка нівелювала б результати, одержувані в різних лабораторіях. Відомо кілька модифікацій цієї реакції, суть яких полягає в основному у використанні різних способів обробки сироваток для видалення неспецифічних інгібіторів, а також в застосуванні різних буферних розчинів і еритроцитів.
Крім видалення інгібіторів за допомогою адсорбції на каоліні, широко застосовується преципитация сироваток сумішшю гепарину і хлористого марганцю (Cooper е. А., 1969а), а останнім часом знаходить застосування обробка сироваток сумішшю сірчанокислого декстрану і хлористого кальцію (DS-C) (Haukenes, Aasen, 1971).
Як буферних розчинів, крім ДЖВ, використовують боратний буферний розчин з 0,4% альбуміну (BABS) - цей же розчин в суміші з фосфатним буферним розчином (BABS + PBS) (Halonen е. А., 1967), а останнім часом також HEPES буфер або HEPES з альбуміном і желатином (HSAG) (Schmidt е. а., 1971).
Заслуговують уваги деякі знову запропоновану поправку РГГА. Так, Gupta і Peterson (1971) розробили методику застосування формалінізірованних еритроцитів з використанням нової буферної системи-Schmidt і Dennis (1972) використовували людські еритроцити групи 0, що володіють рядом переваг при практичному прімененіі- Quinn і ін. (1972) запропонували обробку людських еритроцитів трипсином , що підвищує їх чутливість і відкриває нові можливості для стандартизації реакції.
Все більш широке застосування отримує тест на наявність в сироватці макроглобуліном (IgM, антитіла 19S). За допомогою цього тесту можна підтвердити діагноз краснухи протягом одного дня, так як наявність в сироватці специфічних IgM є показником поточного інфекційного процесу. Найбільш простим методом визначення IgM, хоча і найменш точним, є обробка сироваток 2-меркаптоетанолом (2-МЕ) (Р. Г. Десятскова, Е. Ф. Опочинська, 1973- Banatvala е. А., 1967).
Сироватку обробляють 2-МЕ (кінцева концентрація 2-МЕ - ОДМ) протягом однієї години при 37 ° і потім відчувають в РГГА, що проводиться за звичайною методикою. Паралельно титрують ту ж сироватку, але не оброблену 2-МЕ. 2-МЕ руйнує IgM і тому за різницею в титрах антитіл, які визначаються в сироватках, взятих до і після обробки 2-МЕ, можна судити
про наявність IgM. Достовірної вважається не менш ніж чотириразова різниця в титрах.
Більш досконалими методами виявлення макроглобуліном є центрифугування в градієнті сахарози (Field, Murphy, 1972), фільтрація в гелі (Burgin-Wolff е. А., 1971) і непряма імунофлуоресценція (Haire, Hadden, 1972), проте ці методи мало застосовні в широкій практиці через їх технічну складність. З цієї ж причини ми не наводимо докладного опису, а обмежуємося лише посиланнями щодо виявлення антитіл за допомогою реакції нейтралізації (Parkman е. А., 1964- Furesz е. А., 1969- Kobayashi е. А., 1973), зв`язування комплементу ( Sever е. а., 1965) і методом імунофлуоресценції (Brown е. а., 1964).
В даний час чітко відчувається необхідність в розробці стандартної методики постановки серологічних реакцій (принаймні РГГА) і у випуску стандартних інгредієнтів для їх постановки, що підвищило б точність одержуваних результатів і значно спростило б проведення масових серологічних обстежень.
