Імпрегнація за методом більшовского-грос - основи гістології

Імпрегнація за методом Більшовского - Грос в модифікації Б. І. Лаврентьєва
Одним з найбільш поширених методів імпрегнації периферичної нервової системи є метод Більшовского - Грос в модифікації Б. Н. Лаврентьєва.
Матеріал фіксують відразу після смерті-можна зробити це і в більш пізні терміни, але результат буде гірше. Для фіксації використовують 12-20% нейтральний формалін або рідина АФА наступного складу: 96% спирт, 1% розчин миш`яковистої кислоти * і нейтральний формалін в рівних кількостях.
При фіксації в нейтральному формаліні в перші 2-3 дні слід змінити розчин фіксатора 2-3 рази, так як розчин мутніє від крові і жиру. Тривалість фіксації 7 днів і більше. Кількість фіксатора має в 50-100 разів перевищувати обсяг шматочків. Час перебування в фіксаторі залежить від об`єкта і цілей дослідження і підбирається досвідченим шляхом. Так, для виявлення нервових закінчень в середовищі - 2-4 діб, нервових сплетінь в гладких м`язах - 10-20 діб. Якщо матеріал після тривалого зберігання в нейтральному формаліні погано імпрегніруются, його слід перефіксіровать в свіжої порції фіксатора протягом декількох діб.

* Миш`яковисті кислота розчиняється погано, тому її розчин готують заздалегідь при температурі 37 ° С протягом 3-5 днів.

Фіксацію в рідини АФА продовжують 1 ч. Після цього матеріал переносять в 10% нейтральний формалін, кілька разів змінюють розчин, витримуючи по кілька годин на кожній порції. Потім матеріал переносять в 15% розчин нейтрального формаліну, де він може зберігатися тривалий час. Зрізи готують на заморожувати мікротоме- товщина зрізів 20-60 мкм (залежно від мети дослідження). Перед різкою матеріал переносять з формаліну в дистильовану воду, зрізи опускають також в баночку зі свіжою дистильованою водою.

підготовка посуду

Посуд, призначена для імпрегнації, повинна бути ретельно вимита. Після миття з милом її поміщають в розчин хромпика (див. С. 145) на 4-6 год. Потім посуд складають у велику посудину і промивають проточною водопровідною водою не менше 1 ч (до 24 год) і споліскують кілька разів дистильованою водою. Посуд сушать в сушильній шафі або, якщо часто використовують, зберігають в дистильованої воді в спеціальній банці. Для перенесення зрізів необхідно мати скляну із загнутим кінцем палочку- металеві палички для цього не годяться.

робочі розчини

1. З хімічно чистого кристалічного нітрату срібла готують 20% розчин нітрату срібла. Краще використовувати дистильовану воду. Такий розчин нітрату срібла можна зберігати в темній банку (або в темряві). Перед вживанням треба перевірити розчин: якщо він потемнів, працювати з ним не можна.
2. Для імпрегнації необхідно приготувати аміакати срібла. Цей розчин готують на годинному склі. Спочатку наливають 5 мл 20% розчину нітрату срібла, в який по краплях додають 25% розчин аміаку. При цьому утворюється чорний осад. Потім аміак вкрай обережно додають по краплях при безперервному помішуванні розчину на склі скляній паличкою до розчинення осаду. Краще аміачний розчин готувати невеликими порціями, змінюючи кілька разів протягом роботи.
3. Аміачну воду готують шляхом розчинення 1 частини 25% розчину аміаку в 2 частинах дистильованої води.
4. 20% розчин кислого формаліну готують на водопровідній воді. Для роботи треба мати запасний розчин в колбі (1 л). Розчин розливають в чотири-п`ять баночок або бюкси.
5. Розчин хлориду золота готують з розрахунку 1-2 краплі 1% водного розчину хлориду золота на 1 мл дистильованої води.
6. Треба приготувати кілька порцій дистильованої води.
7. Необхідна батарея для зневоднення зрізів і укладення їх в канадський бальзам.

техніка імпрегнації

З дистильованої води зрізи скляною паличкою переносять в 20% розчин нітрату срібла, де вони знаходяться 20-30 хв і довше в залежності від об`єкта (час перебування зрізів в AgNО3 визначають дослідним шляхом). Через зазначений час зрізи слід провести через три-чотири порції 20% розчину кислого формаліну. В останній порції формаліну не повинно бути каламуті від зрізу.
Зрізи виймають з формаліну і на скляній паличці підсушують шляхом промокання їх на фільтрувальної папері і переносять в аміакати срібла. Попередньо до нітрату срібла додають 1-2 краплі розчину аміаку. Годинний скло зі зрізами, зануреними в розчин аміакати срібла, ставлять на предметний столик мікроскопа для виявлення нервових елементів. При чіткому виявленні нервових волокон і закінчень імпрегнацію слід припинити і на 10-15 хв перенести зрізи в аміачну воду, де імпрегнація припиняється.
Після цього зрізи промивають в декількох працях дистильованої води до зникнення запаху аміаку. Далі слід перенести зрізи в розчин хлориду золота. Це дозволяє послабити імпрегнацію загального фону і більш контрастно виявити нервові елементи. Тут зрізи витримують до тих пір, поки вони не стануть сірими або фіолетовими, потім на кілька хвилин переносять в 5% водний розчин тіосульфату натрію. Довге перебування зрізів в цьому розчині призводить до ослаблення імпрегнації.
Промивши зрізи в декількох працях дистильованої води, їх зневоднюють в спиртах і укладають в бальзам.
Результат. Елементи нервової системи виявляються у вигляді чорних утворень на загальному світло коричневому тлі.
Успіх імпрегнації залежить від багатьох причин. Уточнити час обробки зрізів формаліном і аміакати срібла можна тільки досвідченим шляхом-для різних тканин цей час по-різному. Слід пам`ятати, що для успіху імпрегнації мають значення чистота посуду і реактивів, час фіксації матеріалу. У тих випадках, коли інтенсивно імпрегніруются елементи сполучної тканини і погано виявляються нервові елементи, треба додати 1-2 краплі (і навіть більше) аміаку на годинне скло, де знаходиться розчин аміакати срібла. Якщо зрізи швидко чорніють в аміакати срібла, необхідно скоротити тривалість обробки зрізів в 20% розчині формаліну.