Гистохимія ферментів - основи гістології

загальні зауваження

Ферменти - білкові речовини, що виконують роль біологічних каталізаторів. Надзвичайно важливі для забезпечення обмінних процесів в живих організмах. Вони відіграють основну роль в забезпеченні і регулюванню біохімічних реакцій в живих структурах, в силу чого найбільш ранні етапи порушення обміну, які призводять надалі до морфологічних змін мікроструктур, які виявляються звичайними гістологічними методами, відбуваються переважно в сфері діяльності ферментів. Тому природно то велику увагу, яку приділяють дослідники вивчення стану окремих ферментів і ферментних систем при нормальних і патологічних процесах в організмі.
Ферменти мають сувору специфічністю до речовин, на які вони впливають (субстрат), і проявляють активність при певних умовах температури і реакції (pH) середовища (нейтральна, кисла, лужна).
Гистохимическое дослідження ферментів має свої специфічні особливості: а) в ході гистохимической реакції виявляється який сам фермент, а продукт, що утворюється в результаті взаємодії ферменту з субстратом (речовиною, на яке впливає даний фермент) - б) для визначення істинної локалізації ферменту в мікроструктурах необхідно, щоб продукт його діяльності був тут же обложений у вигляді нерозчинного з`єднання, інакше в результаті дифузії буде отримана помилкова локалізація. У тих випадках, коли осад безбарвний, його необхідно перетворити в забарвлений продукт, видимий в мікроскоп. Схематично всю реакцію можна представити в наступному вигляді:
Фермент в клітці + субстрат -gt; незабарвлений продукт реакції Осадітель + проявник -gt;
- окрашенний нерозчинний продукт реакції
наприклад:
Лужна фосфатаза в тканинах зрізу 4 а-гліцерофосфат +
(Фермент) (субстрат)
+ біологічні активатори (наприклад, MgCl2) - "Звільнений фосфат + СаС12 (осадитель) -
Са3 (РО4) 2 + Co (NО3) 2 - нерозчинний, незабарвлений продукт - С3 (РО4), + (NH4) 2S -
незабарвлений жовтий сульпродукт фамід амонію
- CoS (забарвлений нерозчинний продукт реакції)
В кінцевому підсумку ми отримуємо характеристику активності досліджуваного ферменту. Чим більша кількість продукту утворюється в результаті взаємодії ферменту і субстрату, тим менше забарвлення структур і, отже, вище активність ферменту. Навпаки, чим слабкіша забарвлення, тим активність ферменту нижче.
Зі сказаного видно, наскільки складний процес гистохимического визначення активності ферментів. Це знаходить своє відображення і в методичних прийомах, принципи яких необхідно знати і постійно пам`ятати в процесі роботи.
Так, чутливість ферментів до змін температури і pH середовища призводить до значної втрати їх активності при підготовці тканин до заливання в парафін. Хоча в ряді посібників є рекомендації щодо виявлення деяких ферментів в парафінових зрізах, ці методи не знаходять широкого застосування, так як не є надійними, особливо для органів і тканин, в яких активність досліджуваних ферментів невисока. Найкращі результати можуть бути досягнуті при вивченні зрізів нефіксованим тканини, отриманих в спеціальному приладі - криостате (див. С.197), а для ряду ферментів - і зрізів, приготованих за допомогою звичайного заморожує мікротома з тканин, попередньо фіксованих охолодженими фіксують рідинами (формалін, ацетон). Існують і більш складні способи підготовки блоків з нефіксованим тканини із застосуванням спеціальної апаратури.
Специфічні особливості та властивості ферментів висувають високі вимоги до умов проведення гистохимической реакції, в першу чергу до складання середовища для інкубації зрізів. Обов`язковими інгредієнтами останньої є субстрат (специфічний для даного ферменту), буферний розчин (що забезпечує певну реакцію середовища), речовини, що перешкоджають дифузії продукту реакції. При необхідності в інкубаційного середовища вводять і інші компоненти, що стимулюють хід реакції (активують діяльність ферменту, що блокують окремі ланки хімічних процесів і ін.).
В даний час розроблені методи виявлення досить великої кількості ферментів, перерахувати які в цьому посібнику не представляється можливим. Зупинимося лише на деяких, найбільш часто вживаних в гістологічних лабораторіях. До них слід віднести методи виявлення активності ряду гідролітичних і окислювальних ферментів.

виявлення гидролаз

З групи гидролитических ферментів розглянемо способи виявлення лужної і кислої фосфатаз і аденозінтріфосфатази. Перші два ферменти неспецифічні. Вони каталізують реакції перенесення фосфатних груп (Трансфосфорілірованіє) з одних органічних сполук на інші, а також беруть участь в гідролізі ефірів фосфорної кислоти.
Аденозінтріфосфатаза здійснює гідроліз аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ), що є основним постачальником енергії для обмінних процесів в органах і тканинах, в силу чого вивчення активності цього ферменту допомагає скласти уявлення про рівень енергетичних процесів в досліджуваних біологічних об`єктах.
Принцип виявлення фосфатаз схожий. Фермент, що знаходиться в досліджуваній тканині, при відповідних умовах (pH середовища, температура) отщепляет іони фосфату від знаходиться в розчині субстрату (органічне фосфоровмісних з`єднання, специфічне для даного ферменту). Наявні в розчині іони металу (кальцію або свинцю) тут же пов`язують фосфат, утворюючи нерозчинний безбарвний осад, який випадає в місці локалізації ферменту. При обробці зрізів сульфідом амонію [(NH4) 2S] осад набуває коричнево-чорне забарвлення. Сульфід амонію можна замінити сульфідом натрію (Na2S).

Виявлення кислої фосфатази по Гоморі

Застосовують заморожені зрізи товщиною 10-15 мкм з нефіксованим, фіксованої в охолодженому розчині ацетону або 10% нейтрального формаліну (4-24 год при 0-4 ° С) тканини, наклеєні на предметні скельця або свободноплавающие.
Приготування 0,05 М ацетатного буфера pH 5,0. Вихідні розчини: А - розчинити 1,36 г ацетату натрію (CH3COONa) в 200 мл дистильованої води-Б - до 1,5 мл крижаної оцтової кислоти долити дистильованої води до 500 мл.
Розчини можуть зберігатися тривалий час. Для отримання 50 мл ацетатного буфера pH 5,0 необхідно злити 15 мл розчину А з 35 мл розчину Б.
Інкубаційна середу. Розчинити 1 г (3-гліцерофосфату натрію в 50 мл ацетатного буфера (0,05 М з pH 5,0) і потім додати 660 мг нітрату свинцю [Pb (NО3) 2]. Отриману каламутну суміш відфільтрувати.
Приготування сульфіду амонію. [(NH4) 2S]. Пропускати сірководень (H2S) через 200 мл концентрованого NH4 ОН до припинення поглинання газу. Потім додати ще 200 мл концентрованого NH4OH і розбавити водою до 1 л. Насичення аміачного розчину виробляють в витяжній шафі в добре провітрюваному приміщенні, так як обидва речовини мають сильний і неприємний запах. Посудина з сульфідом амонію необхідно добре закрити. Розчин зберігається тривалий час.
Сульфід амонію можна замінити 5-15% розчином сульфіду натрію. Безбарвні кристали солі легко поглинають воду (Na2S • 9Н2О), тому в процесі зберігання стають вологими і кілька ослизнении. Для приготування робочого розчину беруть потрібну кількість кристалів солі, відмивають в проточній воді до появи неприємного сірчистого запаху і розчиняють в дистильованої воді (5-15 г на 100 мл води). Посудина слід щільно закрити.
Метод. Помістити зрізи в інкубаційного середовища і поставити в термостат при 37 ° С на час від 30 хв до 6 год (в залежності від досліджуваних органів). Обполоснути в дистильованої воді. Обробити сульфідом амонію протягом 0,5 -1 хв (зріз приймає темно-коричневе забарвлення). Промити в дистильованої воді (якщо потрібно, докрасіть) і укласти в гліцерин-желатин.
Результат. Наявність чорно-коричневого осаду сульфіду свинцю вказує на присутність в тканинах ферменту.

Виявлення лужноїфосфатази по Гоморі

(Фіксація і приготування зрізів, як і для кислої фосфатази)
Інкубаційна середу. До 10 мл 3% розчину в-гліцеро- фосфату натрію додати 10 мл 2% розчину мединал натрію, 20 мл 2% розчину хлориду кальцію (СаС12), 1 мл 5% розчину сульфату магнію (MgSО4) і 5 мл дистильованої води. Якщо при зливанні спостерігається помутніння, відфільтрувати. Отриманий розчин повинен мати pH 9,4. Зберігається в холодильнику до декількох тижнів.
Метод. Помістити зрізи в інкубаційного середовища і поставити в термостат при 37 ° С на 0,5 -4 ч. Промити у водопровідній воді і протягом 3-5 хв обробити в 2% розчині хлориду кобальту (СоС12). Обполоснути в дистильованої воді і обробити з сульфідом амонію (до почорніння зрізу). Промити в декількох працях дистильованої води (якщо потрібно докрасіть), збезводнити, просветлить і укласти в бальзам.
Результат. Чорні відкладення сульфіду кобальту вказують локалізацію ферментативної активності.
Наведені методи тривалий час вважалися
найкращими. Однак в останні роки вони витісняються методами, заснованими на застосуванні азобарвників (методом азосочетанія), оскільки методи Гомори недостатньо специфічні, осад грубий, що спотворює реальну картину, особливо при виявленні лужноїфосфатази.

Виявлення лужноїфосфатази по Берстон

[Заморожені середовища зі свіжого матеріалу, фіксовані 5-10 хв в охолодженому (0-4 ° С) ацетоні або протягом 1-2 ч в холодному нейтральному 10% формаліне- товщина 15 мкм]
Основний робочий розчин: в 025 мл ацетону розчинити 5 мг субстрату (нафтол-А-ТК-фосфату) - додати 25 мл дистильованої води, 25 мл 0,2 М трис-буфера (pH 8,5) і 30 мг солі діазонію (синій міцний ББ). Профільтрувати.
Метод. 1. Висушування зрізів, наклеєних на склі з білком, на повітрі (10-15 хв).

1. Інкубація в основному робочому розчині.
2. Промивання в дистильованої воді (обережно!).
3. Докрашіваніе розведеним гематоксилином.
4. Висновок в гліцерин-желатин.

Результат: забарвлення структур синього кольору, інтенсивність якого залежить від активності ферменту.

Виявлення АТФ-ази за методом Вахштейна - Мейзеля

(Фіксація і приготування зрізів ті ж, що і при виявленні фосфатаз по Гоморі *)

* Приготування 0,2 M трис-буфера (pH 7,2).

Інкубаційна середу. Розчинити 25 мг двонатрієва солі АТФ в 20 мл дистильованої води, додати 20 мл 0,2 М трис-буфера (pH 7,2), 1-3 мл 2% розчину нітрату свинцю [Pb (NО3) 2], 5 мл 0,1 розчину сульфату магнію (MgSО4) і долити 2 мл дистильованої води. Якщо потрібно, відфільтрувати, довести pH до 7,2 (інкубаційного середовища готувати перед вживанням і додавати інгредієнти в зазначеному порядку).
Метод: 1. Помістити приготовані зрізи в інкубаційного середовища на 10-60 хв при 37 ° С.

1. Ретельно промити в декількох працях дистильованої води.

1. Обробити розчином жовтого сульфіду амонію протягом 1 хв (з`являється темно-коричневе забарвлення зрізу).
2. Швидко обполоснути в дистильованої воді.
3. Укласти в гліцерин-желатин або після зневоднення в бальзам.

Результат. Місця АТФ-азной активності пофарбовані в коричнево-чорний колір.
Загальна примітка до виявлення фосфату з. Перетримка в сульфіді амонію може призвести до руйнування тканин зрізу. Якщо промивання після обробки сульфідом амонію викликає зморщування і відклеювання зрізів, рекомендуємо поміщати їх на 5-10 хв в 6% нейтральний розчин формаліну і лише потім, сполоснувши у воді, укласти в відповідне середовище.

Виявлення окислювально-відновних ферментів

Цей клас ферментів здійснює найважливіший етап обмінних процесів в живих організмах - біологічне окислення різних речовин, що утворюються в процесі обміну білків, жирів і вуглеводів.
В ході біологічного окислення відбуваються вироблення і накопичення енергетичних ресурсів клітини, які використовуються нею для здійснення своїх життєвих функцій. Цей складний багатоступінчастий процес відбувається послідовно за допомогою цілого ланцюга, що складається з ферментів і допоміжних з`єднань. Суть його полягає в відщепленні від окисляемого субстрату атома водню і перенесення його електрона до кисню. При цьому атомарний кисень, що надходить в тканини з крові, активується і, з`єднуючись з протоном водню, утворює молекулу води.
Настільки важлива роль окислювальних ферментів у забезпеченні обміну в органах і тканинах визначає великий інтерес до їх вивчення. Розрізняють три основні групи окисних ферментів: 1) дегідрогенази, що каталізують перший етап окислення - відібрання водню від субстрату і перенесення на проміжне з`єднання окислювальному ланцюги-2) оксидази, що каталізують перенесення електрона від проміжного з`єднання до кіслороду- 3) пероксидази, що забезпечують перенесення електрона до перекису . Найбільше застосування в гистохимии окислювальних ферментів отримали методи виявлення дегидрогеназ. Вони засновані на властивості солей тетразолия легко відновлюватися (приєднуючи електрон водню), переходячи при цьому з безбарвною розчиненої у воді солі в нерозчинні забарвлені в темно-синій колір найдрібніші кристали формазану.
Необхідно знати, що якщо тканини містять велику кількість ліпідів, то вони спотворюють хід гистохимической реакції за рахунок власного окислення, в результаті випадають грубі, неправильної форми, темні, великі кристали. У цих випадках слід попередньо, помістити зрізи на 1-2 хв в охолоджений (-5 °, -10 ° С) ацетон.

Виявлення сукцінатдегідросенази по Нахласу

(Зрізи з свіжозамороженої тканини, приготовані в криостате і накленние на предметні скельця)
Приготування вихідних розчинів. А - 0,2 М розчин сукцината натрію (27 г солі розчинити в 100 мл дистильованої води) - Б - 0,2 М фосфатний буфер (pH 7,6) - 100 мл (приготування див. С.265) - В - 30 мг нітросинім тетразолия (нітро СТ) розчинити в 30 мл дистильованої води.
Інкубаційна середу. Злити рівні кількості розчинів А і Б і додати розчин В в кількості, що дорівнює сумі перших двох.
Метод. 1. Приготовлені в криостате і підсушені на повітрі зрізи інкубувати в термостаті при 37 ° С 10-30 хв.

Відео: Травлення в ротовій порожнині

1. Обполоснути в фізіологічному розчині хлориду натрію.
2. Помістити на 10 хв в 10% розчин формаліну, приготований на фізіологічному розчині хлориду натрію.
3. Промити в 15% етиловому спирті протягом 45 хв.
4. Збезводнити в спиртах і укласти в бальзам. Результат. Темно-синій осад локалізується в структурах, що володіють ферментативною активністю.

Подібним чином виявляється активність інших дегидрогеназ, змінюються тільки середовище інкубації і способи укладення препаратів.

Відео: Гістопатологія хронічного простатиту