Вивчення ембріотоксичної і тератогенної дії - токсикологія полімерних матеріалів

Вивчення ембріотоксичної і тератогенної дії полімерних матеріалів і їх компонентів. В якості експериментальних тварин використовують зазвичай дрібних ссавців - мишей, щурів, хом`яків або кроликів (табл. 16). Курячі ембріони, морські їжаки та інші тварини практично не застосовуються в дослідженнях з гігієнічної регламентації внаслідок неможливості екстраполяції отриманих даних на людину в зв`язку з істотними відмінностями в метаболізмі і механізмах детоксикації.
Відомо, що виявлення ембріотоксичної ефекту можливо не на всіх видах тварин. Тому ВООЗ рекомендує проводити тестування на тератогенність на 3 видах ссавців - щурах, мишах і кроликах. Оскільки число спонтанних вад у безпородних білих мишей і щурів незначно, вони є найбільш придатною біологічною моделлю для вивчення впливу хімічних речовин на репродуктивну функцію ссавців.
При дослідженні ембріотоксичних властивостей хімічних речовин велике значення надають режиму їх надходження в організм. Л. С. Сальникова і співавтори (1972) вважають, що раніше широко рекомендовані критичні періоди ембріогенезу не можуть використовуватися в повній мірі, так як на протязі всієї вагітності, в кожен день і годину відбувається закладка і диференціювання тканин і органів, пошкодження яких може призвести до серйозних наслідками для плода. У той же час, згідно з думкою експертів ВООЗ (1968), хоча тривале введення препаратів протягом всієї вагітності представляється логічним, такий режим може змінити його метаболізм в організмі матері і замаскувати тератогенну дію.

Рівень впливу речовини на вагітних тварин повинен наближатися до пороговим дозам і концентрацій по Загальнотоксичної ефекту, в іншому випадку щодо змін, які виникли протягом ембріогенезу, не можна судити про специфіку дії досліджуваного речовини.
Таблиця 18. Величина маси плодів у різних лабораторних тварин, г

Таблиця 17. Деякі показники генеративної функції білих щурів

Для дослідження впливу хімічних речовин на ембріональний розвиток формують групи з таким розрахунком, щоб на кожну дозу (концентрацію) доводилося на початку експерименту по 20 самок. Стільки ж тварин має бути в контрольній групі. Для отримання ембріонального матеріалу самок забивають перед пологами (на 19-20-й день вагітності), так як нежиттєздатні дитинчата можуть з`їдатися самками, що ускладнює облік результатів експерименту. Половину самок доводять до пологів, щоб мати можливість простежити за розвитком потомства.
При огляді плодів відзначають наявність видимих аномалій, яким дають якісну і кількісну характеристику. Результати вивчення ембріотоксичної і тератогенної дії хімічних речовин оцінюються на підставі макроскопічного дослідження плодів і обліку показників, що характеризують репродуктивну функцію тварин: індекс запліднення (кількість завагітніли самок / кількість запліднених X 100%), кількість жовтих тіл, кількість живих плодів на 1 самку, кількість плодів , загиблих до і після імплантації, відсоток доімплантаційної і постімплантаціонних загибелі в групі, крани-каудальний розмір плодів, маса плодів, наявність грубих аномалій розвитку, співвідношення самців і самок в калі (табл. 17, 18).
Згідно «Методичних вказівок по вивченню ембріотоксичної дії хімічних речовин при гігієнічному обгрунтуванні їх ГДК в воді водних об`єктів» (1984 г.), ембріотоксичну дію необхідно вивчати при наявності відомостей про ембріотоксичності речовини при будь-якому шляху його надходження в організм, для речовин, що характеризуються швидким проникненням через плаценту, що впливають на функцію гонад, для мутагенів, канцерогенів і близьких до них за хімічною будовою і властивостями речовин, для нових або недостатньо вивчених класів хімічних сполук. При дослідженні впливу хімічних речовин на ембріональний розвиток ссавців керуються також «Методичних вказівок з тестування тератогенну і ембріотоксичну активності нових лікарських речовин» (1972 р), «Методами експериментального дослідження щодо встановлення порогів дії промислових отрут на генеративну функцію з метою гігієнічного нормування» (1978 м). Використовують метод Вільсона, який вимагає попередньої фіксації плодів в рідини Буена, після чого бритвою виробляються поперечні їх зрізи.
Staples (1974) запропонував метод вісцерального дослідження плодів. При цьому внутрішні органи плода вивчаються in situ протягом 3 хв. При вісцеральному дослідженні органів плодів матку розрізають по всій довжині, з кожного плода видаляють плодові оболонки. Для попередження внутрішньоутробних геморрагий пінцетом на 30 з перетискають пуповину біля основи, потім над ним перерізають її пінцетом. На відміну від методу Вільсона відпадає необхідність в двотижневої попередньої фіксації плодів і дослідженні кісткової системи. Перевагою описуваного методу, як підкреслює Л. В. Марцонь (1979), є можливість виявлення аномалій розвитку, невиявлених методом Вільсона, т. Е. При скороченні термінів підвищується ефективність досліджень.
Результати експерименту оцінюються з урахуванням зазначених вище показників, а також даних вісцерального дослідження, дослідження голови (по Вільсону) і скелета (по Даусон). Послідовність операцій при вісцеральному дослідженні органів плода викладена в «Методиці вісцерального дослідження плодів лабораторних тварин при експериментах з оцінки тератогенної активності хімічних речовин» (1980 г.). Отримані дані оцінюються на підставі статистично значущих (або незначущих) відмінностей у піддослідних тварин в порівнянні з контролем і якісного аналізу спостережуваних ефектів.
При цьому, згідно з Л. В. Марцонь (1979), необхідно керуватися наступними критеріями.

1. Сильним тератогеном є речовина, що викликає поодинокі або множинні морфологічні зміни органів у статистично значущої кількості плодів (по відношенню до контролю) у дозах, нетоксичних або близьких до токсичних для материнського організму.

1. Тератогенний ефект, обумовлений дозами речовини, токсичними для материнського організму, свідчить про відсутність вибірковості зазначеного дії, а викликали його сполуки відносять до слабких тератогенні.
2. Речовина не є тератогеном, якщо структурні зміни у плода не виявлено при впливі доз, токсичних для материнського організму.

При наявності в складі полімерних матеріалів речовин, що володіють виборчим тератогенна дія, сфера застосування їх має бути строго обмежена. Кращим є заміна небезпечних інгредієнтів в матеріалі. Міграція з пластмас речовин, що не володіють виборчим тератогенна дія, регламентується за допомогою дистанційного керування та ДКМ.
Інтегральна оцінка впливу на репродуктивну функцію - «тест декількох поколінь» (P. L. Wright, 1978). Даний методичний підхід дозволяє отримати інтегральну оцінку гонадо- і ембріотоксичної, тератогенної і мутагенного дії одночасно. Безперервна запал охоплює періоди спермато-, ово- і ембріогенезу, спарювання і лактації упродовж життя кількох поколінь. Основний методичний прийом - серійне спарювання тварин і спостереження за вагітними самками і їх потомством.
В якості експериментальних тварин використовують гризунів. Батьківське покоління (F0) складають 10 самців і 20 самок. Парування здійснюють за принципом 1 самець + 2 самки. Початок вагітності у щурів і хом`яків визначають наявністю сперматозоїдів у вагінальному мазку під час стадії еструс, у мишей-за вагінальної пробці. З цього дня починають приманку батьківського покоління (F0) і продовжують до закінчення вигодовування дитинчат другого покоління. Тим самим забезпечується вплив шкідливого чинника на гонади, починаючи зі стадії внутрішньоутробного розвитку гамет.
Після досягнення статевої зрілості тваринами другого покоління (F1a) їх спаривают (15 самців і 30 самок) і отримують третє покоління тварин (F2a). 10 вагітних самок умертвляють на 20-й день вагітності. Враховують кількість живих плодів, наявність аномалій розвитку, а також плодів, загиблих до і після імплантації. 20 самок залишають до природних пологів, після чого визначають кількість живих і мертвонароджених, масу їх тіла, виживаність молодняка на 4-й і 21-й дні після народження.
Схема проведення експерименту:
Через 10 днів після закінчення вигодовування F2a потомства F1a батьківське покоління (20 самок і 10 самців) знову спаривают для отримання ще одного посліду (F2в), у якого враховують ті ж самі показники. Результати піддають статистичній обробці.
«Тест декількох поколінь» передбачає значний обсяг досліджень, що обмежує його широке використання. Інтегральну оцінку гонадо- і ембріотоксичної, а також тератогенного дії можна отримати в більш стислі терміни, якщо прийняти таку схему експерименту, максимально адекватну реальним умовам впливу на населення шкідливих факторів навколишнього середовища.
Порогову дозу впливу на репродуктивну функцію встановлюють в результаті 3-місячного впливу речовини (чинника) на самців і самок щурів, після чого тварин спаривают. Затравки самок продовжують також під час вагітності. При цьому інтегральний результат, отриманий в експерименті, буде відображати можливість комбінованої дії речовини на потомство (на статеві залози самців і самок і на розвиток плода). Неефективна доза буде істинно такий, на відміну від недіючої дози, отриманої в дослідах, де використовуються інтактні самці або самки, спарені з зазнали впливу тваринами. Така модель досвіду відповідає завданням гігієнічної регламентації і не виключає можливості проведення додаткових експериментів за іншими схемами, які мають на меті встановити точку прикладання пошкоджуючого агента (чоловічі та жіночі статеві залози або плід). Вона вигідно наближає до реальності методику вивчення ембріотоксичної дії, згідно з якою вплив на самок починається тільки з моменту зачаття, а можливість попереднього отруєння не враховується.