Біохімічні та фізіологічні методики - токсикологія полімерних матеріалів

В даний час в токсикологічних дослідженнях використовується близько 400 біохімічних і фізіологічних методик. Постійно розширюється і швидко удосконалюється набір методик в токсикологічних експериментах сприяє найбільш раннього виявлення зрушень в фізіологічному і біохімічному статусі організму (М. Л. Рилова, 1964- І. М. Трахтенберг та співавт., 1968 І. В. Саноцкий і співавт., 1970 О. М. Єлізарова, 1971- А. П. Шіцкова і співавт., 1977).
Для оцінки стану деяких органів і систем організму використовують комплекс показників і методик, рекомендованих «Методичних вказівок по гігієнічній оцінці нових пестицидів».
Для характеристики функціонального стану печінки застосовують такі основні проби:

1. Знешкоджує функція: проба Квик-Пителя- тривалість гексеналового сна- активність мікросомальних оксігенез (по деметилюванню амидопирина, гидроксилированию аніліну, по динаміці виведення з сечею метаболітів амідопірину, за змістом цитохрома Р-450).
2. Екскреторнафункція: БСФ-проба.
3. Вуглеводна функція: рівень цукру в крові-характер глікемічних кривих при навантаженні галактозой- зміст глікогену в печінці.
4. Білкова функція: кількість загального білка і співвідношення білкових фракцій в сироватці крові.
5. Пігментна функція: кількість білірубіну в сироватці крові.
6. Активність печінкових ферментів і ферментів сироватки крові: амінотрансферази, сорбітдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатази, урокінінази, лужноїфосфатази, изофермента ЛДГ5- холінестерази.

Морфологічними критеріями гепатотоксичности хімічних речовин є (P. S. Guzelian, 1983): гострий і підгострий некроз печінки, холестаз, жирове переродження, гіпертрофія ЕПР, оклюзійні ураження судин печінки, грануломи, гепатопортальний фіброз, цироз, гепато- целлюлярная карцинома, ангіосаркома і ін.
Для оцінки функціонального стану нирок враховують добовий діурез, вміст хлоридів в сечі, а також визначають кліренс сечовини і креатиніну, пробу з фенолрот і ін.
Для судження про стан симпатоадреналової системи і обміну серотоніну визначають величину екскреції з сечею адреналіну, норадреналіну, дофаміну, вініл-мигдальної кислоти-метаболіти катехоламінів і 5-ОІУК. - Метаболіту серотоніну.
Функціональний стан щитовидної залози оцінюють за допомогою проби з радіоактивним йодом, функцію коркового речовини надниркових залоз - по визначенню в сечі вмісту 17- кетостероїдів, 17-оксикортикостероїдів, а в крові-11-оксикортикостероїдів.
Про характер протікання окислювальних процесів свідчать результати визначення споживання кисню, активності цитохромоксидази, сукцінат-, лактат, малатдегідрогеназа, пероксидази, каталази, змісту окислених і відновлених форм нікотинамідних коферментів, глютатиона, рівня молочної і піровиноградної кислот, окси-, карбокси- і метгемоглобіну.
С. Н. Голиков (1980) вказує на необхідність вивчення проблем хімічної патології на основі єдиної общебиологической концепції, якою є вчення про гомеостазі. Вчення про гомеостазі широко використовується в загальній патології, але поки ще не знайшло систематичного розвитку в токсикології.
Як відзначають Л. А. Тиунов і співавтори (1980), адекватні біохімічні показники по своїй інформативності відповідають, а в ряді випадків перевершують звичайні інтегральні методи. Автори вважають найкращим використання біохімічних показників, що мають відносно неспецифічний характер і відображають стан конкретного метаболічного циклу, органу. До числа таких показників відносять, наприклад, цитохром Р-450, В5, НАД і НАДФ - оксидазні системи мікросом, зміна активності яких під впливом хімічних речовин призводить до порушення функціонування редокс-ланцюгів мембран ЕПР. Як підкреслює Ю. С. Каган (1981), біологічна значущість стану цих систем і правомірність використання цих показників для цілей гігієнічного нормування підтверджуються також виявленої в експерименті односпрямованістю змін, що виявляються на різних рівнях структурної організації (субклітинному, органному, організмовому). Іншим неспецифічним показником є окислювальне фосфорилювання в мітохондріях, порушення якого спостерігається не тільки при дії специфічних «роз`єднують» отрут, а й найрізноманітніших речовин, таких, як мономери - стирол, фенол, Епіхлоргідрин. До числа таких показників Л. А. Тиунов і співавтори (1980) відносять також сироваткові ферменти - аміноферази, сорбітол- дегідрогеназу, холіноестеразу. Специфічні показники доречно застосовувати при добре вивченому метаболізмі тестованого сполуки.
При дослідженні механізмів метаболічних реакцій у відповідь організму універсальним і найбільш раннім проявом, як вважають Г. І. Сидоренко та Р. В. Меркур`єва (1983), є мембраноповреждающій ефект, інтенсивність якого залежить від інтенсивності і часу впливу факторів.
Незважаючи на велику кількість сучасних біохімічних методів, використовуваних експериментальної гігієною, науково-обгрунтована їх класифікація по пріоритетності відсутня. Р. В. Меркур`єва (1982) запропонована така класифікація на основі узагальнених результатів досліджень метаболічних механізмів мембраноповреждающего впливу, пошуку універсальних закономірностей і критеріїв оцінки захисних реакцій організму і переходу адаптаційно-пристосувальних проявів в початкові етапи несприятливого впливу. Автор рекомендує біохімічні, цитологічні та цитохімічні методи дослідження функціонального стану внутрішньоклітинних органел (ендоплазматичної мережі, мітохондрій, лізосом), обміну глікокон`югатов в тканинах різних органів і систем (печінка, нирки, головний мозок, плацента, гонади, альвеолярнімакрофаги і ін.), А також в біологічних рідинах (сироватка крові, сеча, амніотична, насіннєва) для оцінки біоеффектов як в експерименті, так і при обстеженні людей (табл. 5, 6, 7).
Нервова система є найбільш вірогідною мішенню необоротних впливів хімічних агентів. Ця дія не можна пояснити єдиним механізмом через складні функціональних властивостей головного і спинного мозку. Одним з механізмів хімічної нейротоксичности є здатність знизити споживання кисню клітиною внаслідок інгібування дихання мітохондрій. Токсичні впливу на ЦНС кумулюються, особливо при дії металів.
При дослідженні шкідливого впливу на організм малих концентрацій і доз хімічних речовин велике значення надають вивченню тонких функціональних змін у центральній нервовій системі і поведінкових реакціях. Такий підхід заснований на припущенні І. П. Павлова про те, що ЦНС є функціонально інтегрує системою організму, і вивчається вона за допомогою методу умовних рефлексів. Метод умовних рефлексів тривалий час був одним з основних в дослідженнях по гігієнічному нормуванню вмісту шкідливих речовин у воді водойм. Майже всі ГДК, встановлені за санітарно-токсикологічному ознакою шкідливості, ще 15 років тому виявляли на підставі вивчення умовно-рефлекторної діяльності піддослідних тварин.
Таблиця 5. Класифікація біохімічних методів (за пріоритетністю) для дослідження функціонального стану ЕПР при оцінці впливу на організм хімічних речовин (за Р. В. Меркур`єва, 1982)

Для оцінки токсичного ефекту придатний також простий, але чутливий метод визначення латентного періоду реакції на електричний подразник.
Останнім часом в токсикології широко використовуються поведінкові реакції, які мають більшу чутливість до токсичного впливу, ніж інші методи. Висока інформативність цього методу пояснюється тим, що поведінка є функціональним індикатором як чисто сенсорних і рухових, так і інтеграційних процесів в центральній і периферичної нервової системи. Як відзначають С. L. Mitchel і Н. A. Tilson (1982), труднощі використання поведінкових методів в токсикології обумовлені пошуком залежностей між суб`єктивними відчуттями (скаргами) людини і змінами в поведінці лабораторних тварин-виявленням змін нервової системи-статистичними проблемами в зв`язку з варіабельністю, притаманної багатьом поведінковим реакціям- вибором адекватних поведінкових методів для конкретних токсикологічних досліджень.
Таблиця 6. Класифікація біохімічних методів (за пріоритетністю) для дослідження функціонального стану мітохондрій і процесів енергозабезпечення при оцінці впливу на організм хімічних речовин (за Р. В. Меркур`єва, 1982)

Існує думка, що зміни в макро- і мікроструктурі органів і тканин-більш серйозна патологія, ніж зміни функціональні. Хоча це і не завжди так, морфологічні дослідження часто є найбільш важливим, а іноді і єдиним встановленим в токсикологічному експерименті показником ураження тканин і органів. В експериментах використовуються різноманітні методи - від рутинної якісної оцінки токсичності до тонких гистохимических методик, авторадиографии, електронної мікроскопії, імунофлуоресцентний і імуноферментних методів.
Тварин вбивають знекровленням (пункція серця або черевної аорти), декапітація, за допомогою наркозу (ефіром, барбітуратами). Загиблі тварини також піддаються розтину (починають з зовнішнього огляду).
Таблиця 7. Класифікація біохімічних методів для дослідження функціонального стану лізосом і обміну глікокон`югатов при оцінці впливу хімічних речовин на організм (по пріорітетності- Р. В. Меркур`єва, 1982)

При дослідженнях на пероральну токсичність відбирають наступні органи і тканини: мозок, гіпофіз, щитовидну, вилочкової залози, легені, серце, грудину, слинні залози, печінку, стравохід, шлунок, дванадцятипалу кишку, худу кишку, клубову, сліпу, товсту, пряму кишки, селезінку, нирку, наднирники, підшлункову залозу, статеві залози, зовнішні статеві органи, аорту, жовчний міхур, сечовий міхур, лімфатичні вузли, молочні залози, м`язи, периферичні нерви, спинний мозок.  
Крім того, фіксують все тканини з видимими ураженнями. При оцінці інгаляційної токсичності вивчають органи дихальної системи, при дослідженні шкірної токсичності - ділянки шкіри, що зазнала впливу.
Мікроскопічна, гістологічна методики, а також авторадіографія і електронна мікроскопія докладно описані в спеціальних інструкціях.
Дані макроскопічних спостережень повинні корелювати з результатами мікроскопічних досліджень. Однак інформація про функціональні порушення, зазначених в ході експерименту, не повинна впливати на об`єктивність судження патоморфолога.
Використання розрахункових методів для визначення токсичності речовин в нашій країні було запропоновано Н. В. Лазарєвим (1944), який вважав за доцільне вирішувати це питання, не застосовуючи експерименту там, де можна обійтися розрахунком або зіставленням аналогічних даних. Автор розробив проблему зв`язку хімічних властивостей і будови органічних сполук з силою і характером їх біологічної дії.
В останнє десятиліття в нашій країні проведена велика робота по виявленню кореляційних залежностей менаду величинами гігієнічних нормативів і фізико-хімічними та біологічними параметрами речовин (Г. Н. Заева, 1964- Ю. С. Каган, Л. М. Сасіновіч, 1970 Е. І. Спину, Л. Н. Іванова, 1974 Е. Н. Любліна, А. А. Голубєв, В. А. Філов, 1976- С. Д. Заугольніков і співавт., 1978- Г. Н. Красовський, З . І. Жолдакова, С. А. шига, Єгорова, 1978- Т. А. Пінігін і співавт., 1978- Б. М. Штабскій, 1978- С. М. Новіков, 1984). Розвиток досліджень в цій області якісно змінило підходи до гігієнічної регламентації вмісту хімічних забруднень в різних об`єктах навколишнього середовища. Використання цих прийомів правомірно для обґрунтування нових ДУ і ДКМ.
Як відзначають Б. М. Штабскій і співавтори (1981), експрес-експериментальні методи радикально змінили роль хронічного досвіду, звівши її до перевірки правильності оцінок, отриманих перед початком експерименту.
Експресні і розрахункові методи встановлення гігієнічних нормативів можна розділити на три групи.

1. Обгрунтування розрахункових нормативів по фізико-хімічної характеристики речовин.
2. Експрес-експериментальне обгрунтування безпечних рівнів впливів (взуття) за результатами короткострокових токсикологічних експериментів.
3. Розрахункова нормування речовин в якому-небудь середовищі по вже встановленим нормативам і ін.

Для розрахунку токсиколого-гігієнічних параметрів застосовується кілька сот математичних рівнянь. Більшість рівнянь створено на основі застосування кореляційного і регресійного аналізу.
Надійність методів прискореного нормування визначається рівнем достовірності формул (величини коефіцієнта кореляції) і характером використовуваних в них параметрів, значення яких зростає в ряду: фізико-хімічні константи-показники гострої токсичності-величини ГДК в інших об`єктах навколишнього середовища. Прогнозування токсичності хімічних речовин на основі їх фізико-хімічної характеристики, зокрема таких констант, як Тпл, Ткип, щільність або молекулярна маса, пов`язане зі значними неточностями, оскільки наведені показники не відображають особливостей взаємодії шкідливих речовин і організму.
У 1977 р представниками різних наукових організацій нашої країни були всебічно обговорені поняття, принципи та критерії прискореного гігієнічного регламентування факторів навколишнього середовища, що дозволило узгодити уніфіковане поняття «орієнтовний безпечний рівень впливу» (взуття) та юридичний статус ГДК, розроблені прискореними методами. Як вказують Г. Н. Красовський і співавтори (1982), ГДК шкідливих речовин в навколишнє середовище, виявлення прискореними методами, мають юридичний статус ГДК, розроблених за традиційною схемою.
ОБУВ-державний тимчасовий гігієнічний норматив, що обмежує вміст шкідливих речовин в об`єктах довкілля (атмосферному повітрі, воді водойм, повітрі робочої зони і т. Д.) З метою забезпечення безпечних умов праці та побуту.
В результаті спільної роботи НІІОКГ ім. А. Н. Сисіна і НІІГТПЗ АМН СРСР проаналізовані матеріали про гігієнічних параметрах більше 1000 речовин, розраховані близько 5000 рівнянь регресії, з яких апробовані і рекомендовані для практичного використання найбільш надійні. Теоретично обгрунтовано можливість використання матеріалів по гігієнічному нормуванню речовин в різних об`єктах навколишнього середовища не тільки для розрахунку токсико-гігієнічних параметрів, але і для прогнозу небезпеки хімічних сполук. Встановлено, що рівняння для ряду речовин, близьких за фізико-хімічними властивостями і характером біологічної дії, мають більшою точністю, ніж розраховані для загальної сукупності. Хоча і при їх використанні можливі помилки і неточності. М. Iversen (1983) досліджував залежність між величинами ЛД50 і ЛК50 147 різних ксенобіотиків і їх граничними дозами. Всі з`єднання автор розділив на 4 групи: 1) дратівливі речовини-2) галоїдовмісних алифатические сполуки- 3) ароматичні сполуки-4) ефіри, спирти і кетони. Усередині кожної групи встановлена лінійна залежність між показниками гострої токсичності та граничними дозами в системі подвійних логарифмічних координат. Відносно низький коефіцієнт кореляції (0,61) і великі помилки у визначенні ПД за показниками гострої токсичності свідчать про певний ризик.

С. М. Новіков (1984) проаналізував залежність величини МНК від вираженості кумулятивних властивостей на двох вибірках шкідливих речовин (близько 200 з`єднань). При цьому виявлено дуже слабкий зв`язок між вивченими показниками, що не дозволяє ввести в розрахункові формули коефіцієнт кумуляції. У зв`язку з цим при гігієнічному нормуванні шкідливих речовин доцільно, як це пропонують Г. Н. Красовський і співавтори (1979), орієнтуватися на середній час загибелі тварин і пороги підгострого дії. С. М. Новіков (1984) запропонував рівняння для розрахунку МНК за величиною порога підгострого ефекту, встановленого в 30-45-денному експерименті:

Аналіз структури речовин, для яких затверджені ГДК в трьох середовищах (Ю. С. Каган і співавт., 1979), показав, що практично всі вони можуть розглядатися як аналоги нормованих речовин, т. Е. Речовин, що належать до вже вивченим токсикологічними класів хімічних з`єднань. Ю. С. Каган і інші вчені ставлять питання про перегляд загальноприйнятих схем встановлення ГДК і відмову від тривалих хронічних експериментів при обгрунтуванні гігієнічних регламентів по Загальнотоксичної ефекту, обмежившись вивченням фізико-хімічних властивостей, встановленням основних параметрів гострої токсичності, кумулятивних властивостей, виявленням найбільш слабости органів і систем, а при необхідності - віддалених і алергенних ефектів. Зазначеної інформації, на думку авторів, досить для обгрунтування надійних показників ГДК, підкріплених відповідними апробованими розрахунковими методами, тим більше, як показує досвід, відсутні суттєві відмінності у величині нормативів, виявлених по розгорнутій програмі або за допомогою прискорених методів. Однак в ряді випадків прискорене нормування неможливо в зв`язку з необхідністю вивчення канцерогенного або мутагенного дії хімічних речовин.
Н. В. Гринь і Н. Н. Говорунова (1983) запропонували використовувати при розробці ОБУВ матеріали ембріотоксікологіческого експерименту. Автори відзначають, що багато хімічних речовин з молекулярною масою не більше 600 майже безперешкодно проходять в плід через плаценту в кількостях, що перевищують фізіологічний рівень. У той же час ембріон не здатний реагувати на патогенні фактори реактивними процесами і різні ксенобіотики викликають в ньому однотипні неспецифічні зрушення, починаючи з порушення обмінних процесів і закінчуючи загибеллю його тканинних елементів. З огляду на відносну простоту досліджень і порівняно невеликий термін експерименту, автори рекомендують визначати ембріотоксичний ефект при обгрунтуванні ОБУВ металовмісних сполук. Однак, на думку С. С. Brown (1983), розробка і використання нових статистичних методів і моделей для екстраполяції не має сенсу без отримання більш точних даних про механізми дії хімічних речовин. Фармакокінетичний механізм поведінки речовин може істотно впливати на можливості і принципи екстраполяції від високих доз до малих, особливо для речовин, що характеризуються нелінійної кінетики.
Важливе місце в проблемі прискореного нормування займає розробка методів експрес-експериментального встановлення ГДК хімічних речовин за результатами гострих дослідів і короткострокових експериментів. З проблемою прискореного нормування тісно пов`язане пропозицію про єдиний нормуванні хімічних речовин у різних об`єктах навколишнього середовища. Що стосується гігієнічної регламентації виділення шкідливих речовин з полімерних матеріалів, то в цілях підвищення надійності ДУ і ДКМ, безумовно, потрібно їх уніфікація. Під уніфікацією в даному випадку слід розуміти дотримання принципу, згідно з яким споріднені гігієнічні нормативи повинні розраховуватися від одного найважливішого кількісної ознаки хімічного речовини-максимально нешкідливою дози (МБД), встановленої в хронічному експерименті. Якщо провести аналогію з фізикою чи хімією, то МБД в хронічному досліді - така ж певна характеристика речовини, як його щільність або температура плавлення. Тому оскільки при виведенні інших похідних характеристик речовини в формулу закладають один раз встановлену величину цих показників, то і при обчисленні родинних гігієнічних нормативів слід використовувати МБД і коефіцієнти, що враховують умови надходження речовин в організм і необхідний запас. Так як всі гігієнічні нормативи визначаються з урахуванням фактів, відомих зараз, але ніяк не в майбутньому, можна ігнорувати ту обставину, що величина МБД залежить від чутливості методів її виявлення.
Отже, в даний час актуальним завданням санітарної токсикології є розробка єдиної схеми хронічного досвіду, який дозволяє встановити МБД при інгаляційному та пероральному надходженні речовини з подальшим розрахунком ГДК в воді водойм, атмосферному повітрі, повітрі робочої зони, допустимих кількостей ксенобіотиків в харчових продуктах, ДУ і ДКМ. Експериментальні роботи, що завершуються обґрунтуванням тільки 1 з 7 нормативів, пов`язані з втратою важливої інформації (В. О. Шефтель, 1981). На жаль, реалізація такого принципу не може бути забезпечена існуючими методами перерахунку. Тому для встановлення максимально допустимого навантаження необхідно мати уявлення про максимально нешкідливих дозах при надходженні речовини з повітрям, водою, їжею, а також через шкіру.