Вивчення мутагенної активності - токсикологія полімерних матеріалів

Вивчення мутагенної активності компонентів полімерних матеріалів. Генетичні дослідження, що проводяться в інтересах гігієнічної регламентації вмісту хімічних речовин у навколишньому середовищі, вирішують такі основні завдання: виявлення хімічних мутагенов- оцінка ступеня їх небезпеки для населення-розробка гігієнічних рекомендацій щодо безпечного застосування хімічних речовин, що володіють мутагенними властивостями.
«Тимчасові методичні рекомендації з оцінки потенційної мутагенної небезпеки пестицидів» (1980 г.) в якості об`єкта при вивченні мутагенної активності хімічних речовин пропонують використовувати ссавців (метод цитогенетичного аналізу клітин кісткового мозку і метод домінантних летальних мутацій) і культуру лейкоцитів людини (метод хромосомного аналізу) .

Мал. 4. Загальні методи вивчення мутагенної активності хімічних речовин
Для визначення здатності речовини індукувати генні (точкові) мутації рекомендується застосовувати мікробні тести з метаболічної активацією речовин (рис. 4).
В. С. Журко (1981) вважає, що при проведенні генетичних досліджень на ссавців тривалість дослідів повинна. бути достатньою для прогнозування хронічного мутагенного дії. Для прогнозу величини цитогенетичного ефекту хімічних речовин в клітинах кісткового мозку ссавців при хронічному впливі можна обмежитися підгострим експериментом. Автор пропонує 10-добову пероральну або ингаляционную приманку. Для аналізу мутагенної активності хімічних речовин в дослідах по індукції домінантних деталей у самців ссавців тривалість експерименту повинна відповідати тривалості постмейотіческіх і мейотіческіх стадій сперматогенезу, т. Е. 5 тижнів для мишей і 7 тижнів для щурів. Оскільки прямі методи, що дозволяють встановити здатність хімічної речовини викликати успадковані мутації у людини, в даний час відсутні, інформація про можливість виникнення мутацій в статевих клітинах людини може бути отримана кількома шляхами.

1. Встановленням факту пошкодження ДНК, що включає її зміни, стимулювання репарації ДНК, тести на виявлення генних мутацій, в тому числі і на мікроорганізмах.
2. Виявленням точкових або генних мутацій на цілому організмі, в тому числі і на комах.
3. Ухвалою хромосомних мутацій, включаючи цитогенетичні тести на ссавців, метод домінантних леталей на ссавців і тест успадковане транслокации на гризунах.

Наведемо коротку характеристику основних методів вивчення генетичної активності хімічних речовин.
Тест Еймса (1973) «Тест-система оцінки мутагенної активності забруднювачів середовища на Salmonella» (методичний указаніе- М., 1977 р) дозволяє оцінити мутагенність за кількістю ревертанти серед клітин спеціального штаму сальмонел при інкубації їх з речовиною в присутності тканинних гомогенатов гризунів або людини, що виконують функцію активатора. Мабуть, мутації у бактерій можуть бути чутливим показником для перевірки ушкодження ДНК, хоча використання цих результатів з метою гігієнічної регламентації утруднено через відмінності в концентрації і розподілі хімічних речовин і відмінностей в фізіології і метаболізмі.
Дослідження на комах. Найбільшою популярністю користується Dr. melanogaster, генетично добре вивчене комаха. За допомогою дрозофіли може оцінюватися частота мутацій на різних стадіях розвитку статевих клітин. Одним з найбільш чутливих є тест зчеплених зі статтю рецесивних летальних мутацій, так як Х-хромосома майже 1 5 генома. На відміну від мікроорганізмів, у комах досить розвинена система ферментів, яка, очевидно, метаболизирует чужорідні сполуки тими ж шляхами, що й у ссавців.
Визначення цитогенетичної активності на клітинах кісткового мозку мишей. Високий ступінь клітинної проліферації в кістковому мозку не дозволяє оцінити справжню цитогенетичну активність речовин при тривалому впливі. Тому дослідження проводять після однократного або п`ятикратного (протягом 5 днів) внутрижелудочного введення речовини безпородним білим мишам. Вивчення мутагенної активності починають з великих доз (1 2-1 5 від ЛД50), які потім знижують. Кістковий мозок фіксують в кінці митотического циклу (через 20-24 год після впливу). Кожну дозу перевіряють не менше, ніж на 6 тварин. Від кожної миші досліджують не менше 100 метафаз.
Визначення цитогенетичної активності в культурі лімфоцитів периферичної крові людини. Для оцінки дії хімічних речовин на хромосоми зазвичай використовують коротко живе in vitro культуру лімфоцитів людини, куди додають речовину у вигляді розчину або суспензії в живильному середовищі 199. У разі виявлення мутагенних ефектів дозу (концентрацію) знижують. Структурна перебудова хромосом, що відбувається внаслідок неправильної репарації хромосомних розривів, може привести до ділок, дуплікації і транслокаціях. Спостерігається також аберація числа хромосом внаслідок їх нерасхожденія.
Тести домінатний леталей і інші системи in vivo. Метод заснований на припущенні, що в яйцеклітинах або спермі відбувається одиночна мутація, летальна для ембріона і гетерозиготна в вражає локусе. Недоліком методу є те, що велика кількість мутагенів дає негативну відповідь в цьому місці. Крім цього, хімічні речовини, що переривають сперматогенез, можуть дати помилкові позитивні результати.
Тест специфічних локусів на мишах. Метод полягає в спарюванні безпородних мишей, самок або самців, які піддавалися впливу речовини, з лінією, гомозиготною по ряду відомих рецесивних генів. Рецесивні гени фенотипно виявляються в гомозиготному стані. У разі виникнення мутації в будь-якому з досліджуваних локусів статевих клітин, які зазнали впливу тварин, вона буде виявлена в потомстві (Russel, 1951 Cattanach, 1971).
На думку більшості дослідників, оптимальними методами оцінки мутагенності хімічних речовин в дослідах на ссавців є аналіз хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку і облік домінантних леталей в статевих клітинах самців.
Оцінка мутагенної активності хімічної речовини визначається трьома показниками.

1. Встановленням порогової дози мутагена згідно з традицією вітчизняної школи гігієнічного нормування. При цьому визначається вибірковість мутагенного дії. При встановленні нормативу використовується коефіцієнт запасу (І. В. Саноцкий, В. Н. Фоменко, 1979- Г. Н. Красовський і співавт., 1979- М. А. Пилинський, А. І. Курячий, 1980). Методичний рівень сучасних генетичних досліджень дозволяє достовірно визначити порогову дозу, яка підвищує частоту мутацій в 2-3 рази в порівнянні з контролем, що не гарантує від появи мутантних клітин при менших рівнях впливу в досить великих популяціях.
2. Виразністю мутагенного дії, що ґрунтується на порівнянні з показником спонтанного рівня мутацій і оцінці мутагенної небезпеки за ступенем перевищення цього рівня (Н. П. Бочков, 1975). Приймається, що максимальне перевищення спонтанного рівня мутацій від дії всієї суми хімічних мутагенів не повинно перевищувати 10%, а від ізольованої дії окремих мутагенів за різними оцінками -0,1 -1%. Цей підхід вимагає встановлення залежності ефекту від дози, що не завжди можливо.
3. Універсальністю дії, т. Е. Прояв мутагенних ефектів на різних об`єктах (хромосомні і генні мутації).

Речовини, що викликають цитогенетичний ефект тільки в високих дозах, розглядаються як сумнівні мутагени. Залежно від ступеня мутагенної небезпеки речовини забороняють або регламентують їх використання.

Таблиця 19. Етапна схема оцінки мутагенної активності хімічних чинників навколишнього середовища при їх гігієнічної регламентації

Таким чином, згідно з сучасними уявленнями, гігієнічна оцінка мутагенного дії факторів навколишнього середовища (в тому числі ПМ і їх компонентів) повинна базуватися на етапності проведення досліджень, використання для регламентації тільки даних дослідів на ссавців, аналізі залежності мутагенних ефектів від дози. В. С. Журко і В. В. Соколовський (1985) запропонували етапну схему оцінки мутагенної активності факторів середовища (табл. 19).
На першому етапі аналізуються літературні дані. При відсутності, або суперечливих, або сумнівних результатах ставляться експерименти з використанням швидких, недорогих і інформативних тестів (тест Еймса, аналіз частоти поліхроматофільних еритроцитів з мікроядра в кістковому мозку в гострих дослідах на ссавців - мікроядерний тест, облік хромосомних аберацій в культурі лімфоцитів людини in vitro ).
Речовини, за допомогою яких виявлено мутагенний ефект, досліджуються на другому етапі, де виробляють метафазну облік хромосомних аберацій і аналіз домінантних летальних мутацій у самців мишей чи пацюків. При цьому тривалість експерименту для обліку хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку становить 10-15 діб, для аналізу домінантних летальних мутацій у самців мишей - 5 тижнів, у самців щурів - 7 тижнів. У дослідах вивчають 4-5 доз, починаючи з 1 10 від ЛД50. Як мінімально діючої дози мутагену (МДД) приймається мінімальна доза речовини, що викликає достовірне підвищення рівня мутацій в дослідній групі в порівнянні з контрольною.
Допустиму дозу мутагена (ДДмут) встановлюють с. урахуванням частки перевищення мутагенних ефектів над спонтанним рівнем
(В. С. Журко, 1981). Оскільки максимальне перевищення спонтанного рівня від дії одного мутагена не повинно перевищувати 1%, а застосовувані на 2-му етапі методи і схеми експериментів дозволяють достовірно виявляти підвищення спонтанного рівня на 100-200%, то ДДмут розраховують за формулою:

Допустиме перевищення фону на 1% отримано також в експериментах Н. П. Бочкова та співавторів (1975) і Committee 17 Enviromental mutagens hazards (1975). При відсутності експериментально встановленої залежності доза - мутагенний ефект слід обчислювати ДДмут на основі лінійної екстраполяції від МДД. Математичної основою застосування лінійної моделі для розрахунку дози, що викликає підвищення рівня мутацій на 1% в порівнянні з контролем, є той факт, що до цього рівня вибір форми математичної моделі дає невеликі відмінності (D. W. Gaylor, 1983).
Використовується також наступна схема тестування на мутагенність: тест на зворотні мутації у S. typhimurium, мутаційний аналіз у Е. Coli, цитогенетичний аналіз на клітинах кісткового мозку ссавців in vivo і мікроядерний тест.
В. В. Соколовський і В. С. Журко (1982) вважають за необхідне розробку та введення нового інтегрального показника - сумарною мутагенної активності факторів навколишнього середовища для оцінки реального навантаження в умовах сучасного світу. Цим же цілям служить розробка генетико-гігієнічних класифікацій небезпеки мутагенів у навколишньому середовищі.
Сьогодні немає прямої кореляції між даними лабораторних тестів і результатами досліджень мутагенезу на людину. Однак наявна інформація доводить необхідність прийняття їх до уваги при розробці заходів безпеки при впровадженні нових полімерних матеріалів в народне господарство і побут. Використовуються методи ще настільки малочутливі, що багато хімічних мутагени можуть бути не помічені. Тому вивчення мутагенної активності компонентів полімерних матеріалів має стати обов`язковою частиною їх гігієнічної оцінки.