Молекулярно-генетична діагностика
Окремий ген або короткі сегменти ДНК не можуть визуализироваться при мікроскопічному дослідженні, тому для ідентифікації мутацій застосовуються методи молекулярно-генетичної діагностики. Інформація, отримана в результаті «Проекту геному людини», і інші досягнення в галузі молекулярної генетики значно розширили можливості пре- і постнатальної діагностики генетичних захворювань. Методи молекулярно-генетичної діагностики забезпечують раннє виявлення і прогноз моно- і полігенних захворювань з дебютом в дорослому віці. Технічні можливості молекулярно-генетичної діагностики можуть виходити за етичні рамки, встановлені щодо спадкових захворювань, особливо якщо ці дослідження повинні проводитися в дитячому та підлітковому віці.
Методи молекулярної цитогенетики
Кількісні і структурні аномалії хромосом - найпоширеніші причини численних вад розвитку і онкологічних захворювань. Ідентифікація цих хромосомних аберацій має важливе значення при сімейному консультуванні для оцінки прогнозу і репродуктивного ризику при майбутніх вагітностях. Традиційний хромосомний аналіз - «золотий стандарт» цитогенетичної діагностики, проте він має обмежені можливості. Методи молекулярно-генетичної діагностики із застосуванням флуоресцентних міток, засновані на технологіях клонування, і підвищена чутливість кон`югатів антитіл сприяють виявленню тонких хромосомних змін, які не виявляються при класичному цитогенетичному дослідженні. Такі техніки розширюють діагностичні можливості при обстеженні дітей з розумовою відсталістю, пороками розвитку і багатьма іншими захворюваннями.
Метод флюоресцентної гібридизації in situ
Метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включає застосування унікальних нуклеотидних послідовностей ДНК в якості зонда для пошуку потрібних послідовностей ДНК в матеріалі, отриманому від пацієнта. Локусспеціфіческій або генспеціфіческій ДНК-зонд позначений певним маркером (наприклад, флюорохромом), що забезпечує його виявлення при флюоресцентної мікроскопії. Досліджувана ДНК являє собою препарат хромосом для мікроскопічного дослідження, що містить нитки в метафазі і ядра в інтерфазі (в що не ділиться стані). ДНК-зонд і досліджувану ДНК денатурують, що призводить до утворення одноцепочной ДНК. ДНК-зонд додають до препарату хромосом і інкубують протягом часу, достатнього для гібридизації ДНК-зонда і комплементарних послідовностей ДНК хворого, якщо у хворого є ділянка ДНК, комплементарний ДНК-зонду. Гібридизація відбувається тільки на комплементарних ділянках ДНК і не стосується фрагментів з іншими послідовностями ДНК з інших частин геному. Присутність або відсутність міченого флюорохромом зонда в складі ДНК після гібридизації визначається при дослідженні хромосом за допомогою флюоресцентної мікроскопії. Результат даного методу молекулярно-генетичної діагностики, як правило, не викликає сумніву.
Переваги методу молекулярно-генетичної діагностики FISH включають швидкий аналіз великого числа клітин, високу чутливість і специфічність, можливість досліджувати некультивованих і клітки, що не. За допомогою цього методу можна дослідити клітини, що містяться в парафінових зрізах. Недоліки методу полягають в неможливості отримати інформацію про фізичний стан досліджуваної ДНК або ділянки хромосоми. Проведення FISH вимагає знання локусу, залученого в хромосомну аберацію, а також підбору відповідного ДНК-зонда, який зможе виявити дану аберацію. FISH не використовується в якості скринінгового методу молекулярно-генетичної діагностики. Метод застосовується для того, щоб отримати відповідь на конкретне запитання (визначити відсутність або наявність передбачуваної специфічної мутації). Як правило, він доповнює класичні методи фарбування хромосом, а також є основним способом ідентифікації хромосом в метафазі або интерфазе і специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК, що лежать в основі певного захворювання (фенотип).
FISH застосовують в пренатальної молекулярно-генетичної діагностики та для характеристики опухолей- в педіатричній практиці його використовують, як правило, для ідентифікації субмикроскопических делеций, асоційованих зі специфічними вадами розвитку. Синдроми, в основі яких лежать мікроделеції, раніше вважалися захворюваннями невідомої етіології, так як хромосомні делеції та перебудови, що викликають розвиток цих захворювань, як правило, не візуалізуються при традиційних методах хромосомного аналізу. Такі дрібні делеції в специфічних ділянках хромосом можна з великою точністю виявити методом FISH. До захворювань, обумовленим субмікроскопічними делеціями, відносяться синдроми Прадера-Віллі, Ангельмана, Вільямса, Міллера-Дикер, Сміт-Мадженіс і велокардіофаціальний синдром. FISH полегшує діагностику цих синдромів в нетипових випадках, особливо в дитячому віці, коли ще відсутня велика кількість діагностично значимі ознаки захворювання. Застосування цього методу молекулярно-генетичної діагностики доцільно також в підлітковому і в дорослому віці, коли типові клінічні ознаки захворювання, характерні для дитячого віку, зазнають змін.
Субтеломеріческіе перестановки
У більшості випадків транслокации втягують кінці хромосом (теломери). Велика кількість генів, що лежать в основі спадкових синдромів, що виявляються у вигляді вад розвитку, локалізовано в областях, прилеглих до теломерам, в субтеломеріческіх областях хромосоми. Скринінг теломер з метою виявити хромосомних перебудов є цінним методом ідентифікації субмикроскопических хромосомних мутацій і перебудов, які не виявляються при стандартному хромосомному аналізі. FISH, застосовуваний для виявлення субмикроскопических хромосомних перебудов у пацієнтів з розумовою відсталістю, фокусується на ідентифікації перебудов, розташованих на кінцях хромосом- субтеломеріческіе аномалії виявляються приблизно у 7,5% цих пацієнтів.
Порівняльна геномна гібридизація
Порівняльна геномна гібридизація (РГД) - це застосування методу FISH для широкого скринінгу генома з метою виявити відмінності в числі копій будь-яких нуклеотидних послідовностей ДНК у пацієнта. РГД була розроблена для генетичних досліджень в сфері онкології (первинні солідні пухлини), але в даний час застосовується для визначення локалізації надлишкового генетичного матеріалу або зон випадання ділянок хромосом при передбачуваних хромосомних аномаліях. Цей метод молекулярно-генетичної діагностики полягає в змішуванні і одночасної гібридизації рівних кількостей меченной різними барвниками, що тестується ДНК (наприклад, меченной зеленим флюоресцирующим барвником) і нормальної референтної ДНК (наприклад, червоний флуоресцентний барвник) з нормальними нитками в метафазі. В результаті отримують певне співвідношення зеленою і червоною флюоресценції. При цьому зони ампліфікації тестируемой ДНК (багаторазового копіювання) виявляються як зони надлишкової концентрації зеленого барвника, зони випадання - як червоні ділянки, що відображають дефіцит тестируемой ДНК, а при рівному співвідношенні, що тестується і нормальної ДНК є області жовтого кольору. Таким чином, РГД дозволяє отримати карту нуклеотидних послідовностей ДНК в геномі. До переваг даного методу молекулярно-генетичної діагностики відноситься можливість його застосування до будь-якої тканини. Метод не може виявити збалансовані хромосомні аномалії, при яких кількість копій ДНК не змінюється. Роздільна здатність методу не дозволяє ідентифікувати хромосомні копії розміром менше 10 Мб, а також зміни числа копій, якщо випадання ділянок хромосом або надлишковий хромосомний матеріал містяться менш ніж в 50% аналізованих клітин.
Спектральний кариотипирование і багатобарвна FISH
Обмеження можливостей РГД при виявленні збалансованих хромосомних перебудов заповнюється за допомогою багатоколірного фарбування всіх хромосом при одноразової гібридизації. Спектральний кариотипирование і багатобарвна FISH (M-FISH) - взаємопов`язані методи молекулярно-генетичного аналізу, які здатні ідентифікувати збалансовані хромосомні перебудови. При обох методах молекулярно-генетичної діагностики кожна з хромосом в метафазі маркується специфічним кольором, що дозволяє одночасно візуалізувати всю сукупність хромосом. 24 маркованих хромосомних зонда і 5 флюорохромів застосовуються в комбінації, що призводить до створення комбінаторної схеми, в якій кожна з 22 аутосом, а також X- і Y-хромосоми пофарбовані в різні кольори. M-FISH вимагає застосування специфічних комплектів фільтрів для кожного з 5 флюорохромов- при спектральному каріотипування застосовуються спектроскопія і інтерферометр для оцінки патернів флюоресцентной емісії. Ці методи дозволяють виявити складні хромосомні перебудови, дрібні транслокации і марковані хромосоми. Недоліки методів включають неможливість ідентифікувати дрібні інтрахромосомние делеции або дуплікації, а також періцентріческіе або парацентрической інверсії.
Методи ДНК-аналізу
Молекулярні цитогенетичні методи підвищують діагностичні можливості для виявлення хромосомних делецій або дуплікацій (що містять десятки або сотні генів). Інші методи ДНК-аналізу дозволяють виявити зміни в окремих генах. Проведення ДНК-аналізу можливо в зв`язку з тим, що ДНК - це відносно стабільна молекула, яка може бути ізольована з будь-яких ядерні клітин і збережена для подальших досліджень. Найбільш часто ДНК виділяють з лейкоцітов- інші тканини, що застосовуються для цього, включають амніотичні клітини і ворсинихоріона (при пренатальної діагностики), клітини, отримані з мазка зі слизової оболонки щоки, і фібробласти, отримані при біопсії шкіри. При заборі цих тканин, як правило, вдається виділити достатню кількість ДНК. Сучасні методи молекулярно-генетичної діагностики, такі як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), дозволяють амплификацию ДНК, отриманої за все з однієї або декількох клітин.
Саузерн, вестерн, Нозерн-блот
Саузерн-блот - це перший метод молекулярно-генетичної діагностики на молекулярному рівні. Зараз він в значній мірі витіснений методами, заснованими на ПЛР, і прямим секвенуванням ДНК. За допомогою Саузерн-блот виділяють геномної ДНК пацієнта і розрізають її на дрібні фрагменти за допомогою рестриктаз (ферменти бактерій, які розщеплюють ДНК в строго специфічних сайтах). Отримані фрагменти поділяють за розміром з використанням електрофорезу в агарозному гелі, переносять за допомогою блоттинга на стабільний нейлоновий фільтр, фіксують на фільтрі, проводять гібридизацію з радіоактивно міченим ДНК-зондом, після чого проводять радіоавтографія. Даний метод молекуляно-генетичної діагнстікі дозволяє виявляти мутації, якщо вони змінюють довжину фрагмента ДНК (сайт рестрикції), що змінює результуючу картину ферментного розщеплення. Саузерн-блот як і раніше найбільш часто застосовується для виявлення зчеплення гена зі специфічним вродженим поліморфізмом ДНК. Можна також простежити поширення гена у інших членів сім`ї, навіть якщо специфічний молекулярний дефект, асоційований з спадковим захворюванням, не може бути ідентифікований.
При Нозерн-блот аналізуються структура і кількість мРНК, продукувати специфічним геном. Розщеплення РНК рестрикційний ферментами неможливо. Довжина транскриптов різних РНК залежить від розміру і кількості екзонів в гені. Таким чином, мутації, які змінюють кількість або довжину екзонів, можна визначати в результаті виявляються змін РНК при Нозерн-блот. Методика ідентична Саузерн-блот, за тим винятком, що досліджується загальна РНК клітин або очищена мРНК, а не розщеплена рестріктазамі ДНК.
Вестерн-блот дає інформацію про розмір і кількість мутантних білків в клітинних екстрактах, отриманих від пацієнтів зі специфічними генетичними захворюваннями. Білки з клітинних екстрактів поділяють за розміром за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі і переносять на мембрану. Потім мембрану инкубируют зі специфічними антитілами до білків. Вторинні антитіла (спрямовані проти перших антитіл), мічені флюоресцирующим барвником Цей метод молекулярно-генетичної діагностики застосовується для визначення наявності або відсутності, а також розміру м`язового білка дистрофина у пацієнтів з Х-зчепленої м`язовою дистрофією.
Полімеразна ланцюгова реакція
Хоча при деяких захворюваннях велика частина мутацій виникає в результаті великих делеций ДНК, які виявляються за допомогою Саузерн-блот, більшість аномалій генів, що лежать в основі багатьох захворювань, є точкові мутації. Після виявлення точкової мутації можна синтезувати конструкції ДНК (праймери), що покривають короткий ділянку, уражену мутацією. Отримання достатньої кількості копій зміненої ДНК може бути складно, але ПЛР надає множинні копії специфічних фрагментів ДНК. При ПЛР ампліфікація ДНК здійснюється шляхом повторних теплових циклів. ПЛР зробила революцію в діагностиці мутацій. Це високочутливий, стандартизований і автоматичний метод молекулярно-генетичної діагностики, який можна проводити на малій кількості зразків. Метод відносно недорогий, протягом декількох годин можна отримати мільярди копій специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК.
Пряме секвенування ДНК
Автоматизоване секвенування ДНК стало стандартним методом молекулярно-генетичної діагностики в багатьох клінічних лабораторіях молекулярної генетики та сприяло значному прогресу «Проекту геному людини». Секвенування ДНК особливо корисно у випадках невеликих генів і в ситуаціях, коли точна мутація у членів даної сім`ї невідома. Усі виявлені зміни в структурі гена повинні бути ретельно проаналізовані, щоб зрозуміти, чи лежать вони в основі захворювання або відносяться до нормального поліморфізму.
