Методи дослідження хромосом - спадкові і вроджені хвороби плода та новонародженого
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Культура клітин. Малий лімфоцит, легко стимульований до поділу за допомогою рослинного митогена фитогемагглютинина (ФГА), зазвичай використовують для хромосомних досліджень. Діляться клітини фіксуються в метафазі, а при додаванні гипотонического розчину виділяються хромосоми. Мазки-препарати хромосом висушують на повітрі.
Для вивчення мозаицизма і біохімічних дефектів необхідно використовувати культури фібробластів, що вимагає великих технічних засобів і витрат часу. Для діагностики захворювань крові краще використовувати культуру кісткового мозку, але можуть бути використані хромосоми з мієлоцитів периферичної крові. Методи дослідження для отримання культури клітин амніотичної рідини аналогічні таким для отримання культури фібробластів. Цитогенетичний аналіз завершується через 2-3 тижнів.
До найбільш швидкоздійсненним методів відноситься біопсія хоріонічний ворсинок. Їх отримують в невеликій кількості за допомогою ультразвукового відсмоктування через шийку матки слідом за безпосереднім наглядом хромосом в зразку або культурі клітин. Цю процедуру виконують при терміні вагітності 8-11 тижнів, а результати отримують зазвичай до закінчення I триместру вагітності. Її безпеку повністю не оцінена.
Традиційні методи фарбування хромосом в більшості своїй були витіснені методами, що дозволяють отримувати характерний тип їх фарбування з чергуванням світлих і темних (або яскравих і сірих) дисків в кожній хромосомі. Ці диски (або смуги) пов`язані зі структурою основних пар нуклеотидів, які формують ДНК, а також розподілені уздовж довгої осі хромосоми у вигляді гістонових і негістонових протеїнів. Фарбування похідними хінакріна або аналогічними йому речовинами і подальше мікроскопування з використанням ультрафіолетового джерела світла дозволяють виділити флюоресцентні диски (Q-диски), в той час як відповідні G-диски виділяються при фарбуванні за модифікованим методом Гимзе. При іншому методі, при якому використовують барвник Гимзе або акридіновий помаранчевий, відбувається протилежне забарвлення Q- і G-дисків і виявляються так звані реверсивні, або R-диски. В даний час в будь-який спеціалізованої лабораторії для точної діагностики використовують принаймні один иа цих методів фарбування хромосом. До інших методів відносяться виділення С-диска при фарбуванні гетерохроматина, що виявляється близько центромери кожної хромосоми, фарбування З-диска (G-11) в 9-й хромосомі, виділення ділянок з ЯДЕРЦЕВОГО організатором (ЯО) в сателітних хромосомах при фарбуванні аміачним сріблом, виявлення обміну сестринськими хроматидами.
Досягнення останніх років дозволяють досліджувати хромосоми в пізній період профази, коли вони менше зморщені, ніж при звичайному дослідженні в метафазі. У порівнянні зі звичайним методом дослідження, що дозволяє аналізувати 200-400 дисків, за допомогою цього методу виділяють до 600 1400 дисків, що забезпечує можливість виявляти вкрай малі делеції і дуплікації.
каріотипування. Хромосомна ДНК реплікується під час S-стадії інтерфази, але двухструктурная природа хромосом стає чітко видимою тільки на початку мітозу. Таким чином, під час мітозу кожна хромосома складається з двох однаково довгих тонких тяжів, званих сестринськими хроматидами, що стискуються в щільні структури, в зв`язку з чим створюється враження коротких, товстих плечей, утримуються разом за допомогою центромери. У метафазі, коли їх довжина найменша, хромосоми організовуються в пари. Подібна систематизація хромосом з однієї клітини називається каріотипом. В даний час в більшості випадків при лабораторних дослідженнях у кожного хворого аналізуються 10-40 метафазних кариотипов і інформативними вважають методи, що дозволяють виявляти хромосоми з типовим розташуванням дисків. При підозрі на мозаицизм необхідно аналізувати як більша кількість клітин, так і клітини інших тканин. У тих випадках, коли потрібно більш детальний аналіз, досліджують профазних і прометафазних хромосоми, оскільки вони більшою довжини і в них ідентифікується більше число дисків.
нормальний каріотип
Мал. 6-5. Положення центромери, що визначає три типи хромосом в нормальному каріотипі людини: мета-, суб-і акроцентріческіе (а) - морфологічні маркери, які використовуються при ідентифікації хромосом (б).
Диплоидное число хромосом у людини становить 46, т. Е. 23 пари. Таким чином, 23 - гаплоидное число хромосом, що виявляється в гаметах. У метафазі кожна хромосома складається з двох хроматид, відрізняється характерною морфологією, яка визначається положенням центромери або первинної перетяжкою, яка визначає розміри довгого і короткого плечей (рис. 6-5). Прикладами трьох нормальних форм хромосом служать 1, 3 і 16-я (метацентріческая), 4-я і 5-я (субметацентріческіе) і 21-я і 22-я (акроцентріческіе). Все акроцентріческіе хромосоми, крім Y-хромосоми, мають вторинну перетяжку і сателіт. У міру ідентифікації за розміром, морфології і характерному розташуванню забарвлених дисків була розроблена числова система позначення хромосом (за винятком статевих) (рис. 6-6).
Мал. 6-6. Каріотип здорового чоловіка з хромосомами в пізньої профазе, в якій вони відрізняються більшою довжиною плеча і великим числом дисків, ніж в хромосомах, що знаходяться в метафазі.
У нормальному каріотипі при фарбуванні традиційними методами було виявлено кілька варіантів морфологічної структури хромосом. Найбільш вивчено подовження парацентромерного ділянки в довгому плечі 1, 9 і 16-й хромосом, збільшене або зменшене коротке плече або збільшені сателіти акроцентріческіх хромосом і вторинна перетяжка на короткому плечі хромосоми 17 (див. Рис. 6-5- рис. 6-7) . Форма і довжина Y-хромосоми також може бути різною. Незважаючи на те що розташування дисків в кожній хромосомі постійно, були виявлені зустрічаються в нормі різні варіанти при використанні флуоресцентних методів фарбування, наприклад відмінності в інтенсивності флуоресцентних дисків близько центромер 3-й і 4-й хромосом і сателітів акроцентріческіх хромосом (див. Рис. 6 -7). Різниця в довжині Y-хромосоми зумовлено розширенням або втратою основного Q-диска, що не впливає на фенотип. Спочатку морфологічні варіанти були виявлені у осіб з аномаліями, в зв`язку з чим їх пов`язували із захворюваннями, але незабаром стало очевидним, що ці морфологічні відмінності успадковуються по менделевскому типу, а деякі варіанти зустрічаються досить часто, що можна вважати поліморфізмом (варіанти норми). Таким чином, вони являють собою корисні генетичні маркери і можуть допомогти локалізувати гени в певних хромосомах.
У літніх осіб були виявлені коливання числа хромосом в різних клітинах. Відзначено тенденцію до втрати Х-хромосоми у жінок у віці 55 років і старше і Y-хромосоми у чоловіків у віці старше 65 років.
До іншої категорії відмінностей відноситься наявність або відсутність місць поломок. Незважаючи на те що більшість з них не пов`язане зі специфічними синдромами, виявлення поломок у кінця довгого плеча хромосоми X поєднується з розумовою відсталістю (рис. 6-8).
а- хромосоми, забарвлені ацетоарсеіном- розташовується зліва хромосома в кожній парі або тріаді зазвичай «немаркіруемая» - б - хромосоми, забарвлені за допомогою хіпакріна дигідрохлориду, розрізняються за інтенсивністю флюоресцірованія смуг.
Мал. 6-7. Деякі морфологічні варіанти у здорових осіб.
Мал. 6-8. Х-хромосоми, у одній з яких (зліва) видно поломка в нижньому кінці довгого плеча (fra (X) (Ч28).
Відео: Діагностика синдрому Дауна під час вагітності
аномальні каріотипи
Зміна числа хромосоми. Хромосомніаберації поділяються залежно від числових і структурних змін. Клітини з кратним збільшенням гаплоидного числа, наприклад 46, 69, 92 і так далі, відносяться до еуплоідним. Еуплоідние клітини з числом хромосом, що перевищує диплоїдний набір 46, називаються поліплоїдні. Клітини з відхиленням числа хромосом від одного з еуплоідних чисел, називаються анеуплоїдними.
До найбільш частих прикладів анеуплоідіі відноситься трисомия, т. Е. Три гомологічні хромосоми замість звичайної пари хромосом. Брак хромосоми називається моносомією (для відповідної пари). Анеуплоідних індивіди можуть бути трісомнимі більш ніж по одній парі хромосом або у них може бути комбінація три- і моносомии. Під час мейозу гомологічні хромосоми соедіняются- після подвоєння числа хромосоми розходяться до протилежних полюсів ділиться клітини. При порушенні з`єднання або поділу (нерасхождение) змінюється процес сегрегації, що може привести до анеуплоідіі (рис. 6-9). Нерасхожденіе хромосом під час мітозу призводить до мозаїцизму, що означає присутність більш однієї популяції клітин з різним числом хромосом у одного і того ж індивіда (рис. 6-10). Чим старше мати, тим більша ймовірність нерасхожденія хромосом і трисомії. Моносомія може бути результатом втрати хромосоми, або анафазного зсуву, т. Е. Нездатності хромосоми досягати одного з полюсів клітини під час анафази, що також призводить до мозаїцизму (див. Рис. 6-10). Митотическое нерасхождение в період ембріонального розвитку може привести до мозаїцизму з двома або трьома популяціями клітин (рис. 6-11).
Мал. 6-9. Нерасхожденіе під час мейозу, що підтверджується двома парами
хромосом.
Перше розподіл з нерозходженням, нездатністю малих гомологічниххромосом розділитися, утворює гамети з відсутньою малої або додаткової хромосомою (а) - другий розподіл з нерозходженням при розподілі центромери.
Повна полиплоидия несумісна з життям, але відомі випадки виживання осіб з мозаїцизмом. Триплоїд (потрійний гаплоїдний набір, всього 69 хромосом) найчастіше виявляли у спонтанно абортованих плодів і мертвонароджених. Вона обумовлена заплідненням яйцеклітини двома сперматозоїдами або приєднанням гаплоидного набору до диплоидной гамете. Тетраплоідние клітини були виявлені у абортусов, у осіб із злоякісними захворюваннями та іноді у немовлят з дисморфия. Тетраплоидия іноді зустрічається в культурах клітин, особливо в клітинах амніотичної рідини, і число їх збільшується пропорційно часу культивування.
Мал. 6-10. Формування мозаицизма. Хромосоми X і Y використані для ілюстрації двох основних помилок, що обумовлюють появу популяції клітин з неправильним набором хромосом. У нормі при мітозі (вгорі) подвоєні хромосоми розділяються і переходять в дочірні клітини. Якщо одна з подвоєних хромосом не розходиться, відбувається мітотичний нерасхожкеніе (в центрі). При звичайному розбіжності і затримці міграції хромосом відбувається затримка в анафазе (внизу) 
до
ж
Мал. 6-11. Зв`язок між моментом митотического нерасхожденія і пропорцією аномальних клітин у ембріона з мозаїцизмом.
а - мітоз в нормі: всі утворюються клітини містять 46 хромосом- б - помилки в процесі перового після зачаття мітозу: утворюється два типи ембріональних клітин, в одній половині з яких міститься 47 хромосом, в іншій половині - 45 в - помилки, що зустрічаються по досягненні певного розміру: утворюється три клітинні популяції (з 45, 46 і 47 хромосомами)
Дві новостворені хромосоми в клітинах справа не можуть розділитися (б).
Мал. 6-12. Механізм, що обумовлює структурні аномалії хромосом. Ці аберації залежать принаймні від двох розривів (позначені хвилястою лінією).
структурні аберації. Ці аномалії обумовлені розривом хромосом і їх перебудовою. Синдроми делеции, наприклад синдром котячого крику (5р-), можуть бути результатом простий делеції або успадкування транслоцироваться хромосоми з ділянкою делеции. Внутрішні делеции відбуваються при втраті сегмента хромосоми всередині хромосомного плеча (рис. 6-12).
Для всіх структурних аномалій потрібно хоча б два хромосомних розриву, після чого відбувається відновлення розірваних кінців. Транслокації, які можуть успадковуватися або виникати de novo, виявляються найчастіше. Реципрокні транслокации обумовлені обміном сегментами між двома негомологічної хромосоми (див. Рис. 6-12). Носії реципрокних транслокацій зазвичай фенотипічно нормальні, так як відрізняються повним набором генів. У дітей, народжених від носіїв транслокацій, ознаки патології проявляться в тому випадку, якщо вони отримають тільки одну хромосому з двох транслоцироваться і, відповідно, у них будуть зустрічатися дуплікаціонно-дефіцитні синдроми (рис. 6-13). Залежно від кількості успадкованого матеріалу, збільшеного вдвічі або втраченого, аберацію вважають часткової трисомія або часткової моносомією. 
Мал. 6-13. Спадкування транслокации 2/15
До особливого типу транслокації відносять центрическое з`єднання, або робертсоновской транслокацию, коли в процес втягуються акроцентріческіе хромосоми, в яких розриви зустрічаються в окоцентромерних ділянках, реципієнтную і донорської хромосом. Зазвичай губляться короткі плечі обох хромосом і центромера донорської хромосоми. Центричний з`єднання частіше зустрічається в 14-й і 21-й хромосомах, що може зумовити синдром Дауна (рис. 6-14). Оскільки коротке плече акроцентріческіе хромосоми генетично неактивно, втрата знаходиться в ньому генетичного матеріалу не робить очевидного фенотипічного впливу на носія.
Кільцеві хромосоми утворюються в тому випадку, якщо обидва кінці хромосоми відриваються, а кінці центральних фрагментів з`єднуються, утворюючи хромосому з делецией як короткого, так і довгого плеча (см. Рис »6-12). Ця нестабільна замкнута структура ускладнює мітоз. Інверсії (див. Рис. 6-12) двох типів можуть бути результатом того, що сегменти між двома розривами в одній хромосомі міняються місцями і порядок генів стає зворотним. Оскільки інверсія може привести до утруднення кон`югації хромосом, це може збільшити ризик їх нерасхожденія.
У процесі мейозу кроссинговер генів між хроматидами гомологічниххромосом є нормальне явище, легко доказувана рекомбинацией або поділом генів, зазвичай локалізованих на одній і тій же хромосомі.
Мал. 6-14. Спадкування центричного злиття 14/21. Незважаючи на те що ця транслокация також може призводити до аномалії хромосоми 14 і моносомии 21, нащадки з цими дефектами, якщо виживають, зустрічаються
Обмін між хроматидами також може зустрічатися під час мітозу і може залучати до процесу хроматиди двох гомологічних або хромосом. Оскільки в метафазі сестринські хроматиди ще не розділені, такий обмін призводить до утворення четирехрадіусной конфігурації, що нагадує дорожній перехрестя. Дещо складніше довести існування обміну між сестринськими хроматидами в мітотичних клітинах через те, що реплікованих хроматиди несуть на собі ідентичні гени і незвичайна конфігурація не утворюється. Це можна довести за допомогою різних методів забарвлення. Різноманітні типи обміну хроматид виявляють при синдромах розривів (див. Далі) і в клітинах, оброблених мутагенними речовинами.
номенклатура
Таблиця 6-4. Деякі типові зразки записи кариотипов
46, XY | Нормальний каріотип у чоловіка |
47, ХХ + 13 | Жінка з трисомія 13 |
47, XY + 21 | Чоловік з трисомія 21 (синдром Дауна) |
46, XY, -21, + t (21q21q) | Чоловік з синдромом Дауна в результаті транслокаціітіпа центричного з`єднання між двома хромосомами 21, заміщення однойхромосоми 21 |
45, XX, -lt; 14, -21, + t (14q21q) | Фенотипічно нормальна жінка-носітельтранслокаціі типу центричного з`єднання між хромосомами 14 та 21 |
46, XY, del (5p) | Чоловік з синдромом котячого крику, обумовленим делецией частини короткого плеча хромосоми 5 |
46, XX, del (18q) | Жінка з делецией всього або частини длінногоплеча хромосоми 18 |
46, XY, г (19) | Чоловік з кільцевої хромосомою 19 |
45, X | Жінка з синдромом Тернера, обусловленниммоносоміей X |
47, XXY | Чоловік з синдромом Клайнфелтера |
46, X, i (Xq) | Жінка з синдромом Тернера, обусловленнимізохромосомой довгого плеча Х-хромосоми |
46, XY / 47, XXY | Чоловік з XY / XXY мозаїчним сіндромомКлайнфелтера Відео: Скринінг анатомії плода |
46, XY, fra (X) | Чоловік з поломкою Х-хромосоми |
Для того щоб уникнути плутанини, номенклатура для опису каріотипу була стандартизована. По-перше, записують загальне число хромосом, по-друге, набір статевих хромосом, після чого йде опис аберацій (табл. 6-4). Коротке плече хромосоми позначають літерою «р», а довге плече - літерою «q». Будь-яке збільшення або втрата хромосомного матеріалу позначають відповідно знаком «+» або «-», що поміщається перед номером хромосоми, якщо мова йде про цілу хромосомі, і після символу, що позначає плече, якщо мова йде про будь-якому збільшенні або зменшенні довжини плеча. Хромосоми з транслокацією записують в дужках, перед якими ставлять літеру «t»: наприклад, t (14q21 q) означає найчастіше виявляємо транслокацию при синдромі Дауна (у більшості дітей, однак, відзначається трисомія по 21-й хромосомі, додаткову хромосому позначають + 21 ).
В даний час в хромосомах можуть бути виділені ділянки за характерними для них смугах. Кожне плече хромосоми розділене на ділянки і, таким чином, порушення структури хромосом і хромосомні перебудови можуть бути ідентифіковані, аберації описуються з відносною точністю.
дерматогліфіка
До розвитку цитогенетики людини одним з критеріїв для діагностики синдрому Дауна служили відбитки долонній і підошовної поверхонь. Подальший розвиток методів хромосомного аналізу зменшило відносне значення дерматоглифики в клінічній оцінці хворих з підозрою на хромосомні аномалії.
Дерматогліфіка є конфігурацією, яку утворюють шкірні виступи, але не складки при згинанні. Найбільше значення мають малюнок кінцевих фаланг пальців, розташування трирадіус щодо долонній осі і малюнок поверхні стопи. Відбиток визначають шляхом підрахунку числа шкірних виступів між центром відбитка і трирадіус, визначальним периферію відбитка. Пальцеві візерунки зазвичай відрізняються найбільшим числом ліній, в той час як на долонній дузі вони відсутні, оскільки на ній немає трирадіус. Для певних синдромів важливі характер і розмір відбитків.
Показана виражена кореляція між дерматогліфічний ознаками і змінами хромосом. Характерні шкірні відбитки зараз є добре відомі діагностичні критерії при трисомії по 13, 18 і 21-й хромосомах і синдромі делеции в 18-й хромосомі і групі G. Всі вони описані при відповідних синдромах.
