Імуноферментні методи діагностики - системний червоний вовчак, системна склеродермія, ревматоїдний артрит
ГЛАВА IV
Імуноферментний метод діагностики імунних ПОРУШЕНЬ
Імуноферментний аналіз є одним го найбільш активно розвиваються напрямків хімічної ензимології. Це обумовлено тим, що в цьому методі унікальна специфічність иммунохимического аналізу поєднується з високою чутливістю детекції ферментативної мітки. Висока стабільність реагентів, простота методів реєстрації є незаперечними перевагами методу, що зумовлюють його широке застосування в медицині.
Суть методу полягає в специфічному зв`язуванні визначається з`єднання відповідними антитілами. Класичні методи иммунохимического аналізу засновані на освіти антитілами в присутності антигену преципитата (осаду). Індикація утворився комплексу антиген-антитіло в розчині може бути здійснена, ecли в один їх вихідних компонентів реакційної системи ввести мітку, яка легко визначається відповідним високочутливим физикохимической методом. З цією метою застосовуються ізотопні, ферментні, флуоресцентні, парамагнітні мітки, використання яких дало можливість збільшити чутливість иммунохимических методів в мільйони разів, а час аналізу зменшити до декількох годин.
Для здійснення такого аналізу необхідно провести ефективне розділення комплексів від вільних компонентів. Це завдання виявилося легко вирішити, якщо один з компонентів пари антиген-антитіло міцно иммобилизовать на твердому носії. Іммобілізація дозволяє запобігти агрегацію в розчині і здійснити фізичне поділ утворюються імунних комплексів від вільних компонентів.
Нові иммунохимические методи, засновані на застосуванні мічених реагентів, знайшли широке поширення для кількісного визначення біологічно активних сполук найрізноманітнішої структури - від низькомолекулярних гормонів до високомолекулярних вірусів і цілих клітин.
Найбільший розвиток серед них отримав радіоімунологічний аналіз, запропонований в кінці 50-х років. Завдяки можливості визначати мітку, якої є ізотоп 1-125, в дуже малих концентраціях, вдалося досягти високої чутливості аналізу. Розробка цього методу стала поворотним моментом у розвитку иммунохимических методів аналізу, що поклав початок цілій серії методів з використанням різних мічених сполук. За розробку методу його автори Р. Йалоу і С. Берсон в 1977 році були удостоєні Нобелівської премії.
Поряд з перевагами радіоімунологічний метод має і недоліки, до яких відносяться дорожнеча обладнання та екологічна небезпечність, пов`язана з можливістю радіоактивного зараження навколишнього середовища при здійсненні великої кількості аналізів, і необхідність дотримання спеціальних запобіжних заходів і високої кваліфікації обслуговуючого персоналу. Саме ці труднощі послужили вихідним моментом для пошуку методів, альтернативних радіоімунологічними, але зберігають його високу чутливість, специфічність і експресивність.
Протягом останніх десятиліть імуноферментні методи аналізу інтенсивно розвивалися як в теоретичному і практичному плані і до теперішнього часу вони сформувалися в самостійний науковий напрям, що має важливе прикладне значення. Використання твердих носіїв для сорбційної або ковалентного іммобілізації антитіл з наступним специфічним зв`язуванням аналізованого з`єднання на імуносорбент і виявленням утворилися імунних комплексів за допомогою мічених ферментами компонентів поклало початок методам твердофазного (гетерогенного) імуноферментного аналізу.
Ці методи найбільш поширені і використовуються для визначення широкого кола як низькомолекулярних, так і високомолекулярних сполук - антитіл, пептидів, вірусних і бактеріальних антигенів, фармакологічних препаратів.
Особливу значущість для широкого впровадження твердофазного імуноферментного аналізу в практику мала розробка в якості носіїв для сорбційної іммобілізації антитіл і антигенів спеціальних полістирольних плат, що містять 96 лунок. Факт сорбції антитіл на поверхні полістиролу був встановлений в середині 60-х років і використаний спочатку в методах радиоиммунологического аналізу. Впровадження в практику імуноферментного аналізу полістирольних плат дозволило спростити методичну процедуру його виконання. Були сконструйовані спеціальні прилади, що дозволяють автоматизувати стадії додавання реагентів, промивання і здійснювати одночасну реєстрацію каталітичної активності ферменту-мітки в кожній з лунок плати.
Найбільш поширеними схемами імуноферментного аналізу є наступні: конкурентна, метод послідовного насичення, «сандвіч» -метод і метод визначення антигенів з використанням мічених антивидових антитіл.
Принцип конкурентного імуноферментного аналізу полягає в одночасному додаванні визначається і меченного ферментом антигену до антитіл, доведення системи до рівноваги і подальшої оцінки ферментної мітки в комплексі з антитілами або в незв`язаному мічених антигене.
На відміну від конкурентного імуноферментного, метод послідовного насичення заснований на послідовному взаємодії антитіл спочатку з визначеним, а потім з міченим ферментом антигеном. Проведення аналізу можливо двома шляхами. У першому випадку мічений антиген додається безпосередньо в інкубації іншу суміш, яка містить антитіла і досліджуваний зразок. У другому випадку (можливий тільки при застосуванні твердофазного імуноферментного аналізу) імуносорбент після першої реакції відмивають від незв`язаних комплексів, а потім вводять мічений антиген. Цей метод дозволяє уникнути можливого інгібуючого впливу компонентів досліджуваної біологічної рідини на ферментмаркер. Концентрація зв`язався з антитілами кон`югату пропорційна початковій концентрації антигену і служить характеристикою його змісту в досліджуваному зразку.
«Сандвіч» -метод заснований на використанні іммобілізованих і мічених специфічних антитіл і є одним з найбільш поширених підходів для аналізу полівалентних антигенів. Метод існує в декількох модифікаціях. Найбільш широко поширена включає дві стадії. На першій визначається антиген взаємодіє з іммобілізованими антитілами, потім імуносорбент промивають і додають мічені ферментом антитіла, ступінь зв`язування яких з вільними детермінантами пропорційна початковій концентрації антигену. Вдруге промивають субстрат і реєструють кількість мітки, зв`язалася з імуносорбент.
Конкурентний метод з використанням мічених антивидових антитіл дозволяє визначати різні антигени (як моно-, так і полідетермінантние) з використанням одних і тих же мічених антитіл. Аналіз проводять наступним чином. До іммобілізованих на носії антигену додають визначається антиген і специфічні антитіла. В процесі інкубації іммобілізований і визначається антигени конкурують за центри зв`язування антитіл. В результаті на носії утворюється комплекс антиген-антитіло, концентрація антитіл в якому пропорційна початковій концентрації що визначається антигену. Після видалення надлишку незв`язаних компонентів до носія додають мічені ферментом антивидові антитіла, що утворюють комплекс зі специфічними антитілами. Після видалення надлишку мічених антитіл реєструють концентрацію мітки на носії. Таким чином, в методі поєднуються принципи конкурентного і «сандвіч»-аналізу.
Природно, що для проведення всіх цих способів імуноферментного аналізу необхідна наявність антитіл до визначеного субстрату. Таким чином, важливим моментом є отримання антисироваток і поліклональних антитіл. З цією метою в даний час застосовують імунізацію тварин адьювантом Фрейнда, після чого проводять виділення і очищення антитіл, тобто видалення неспецифічних антитіл. У деяких модифікаціях імуноферментного аналізу використовуються кон`югати ферментів ні з цілої молекулою імуноглобуліну, а з тим її фрагментом, який специфічно зв`язується з молекулою антигену, Fab-фрагментом.
Поліклональні антисироватки часто мають високу перехресну реактивність, що робить скрутним і навіть неможливим їх використання в імуноаналізі. Основною перевагою моноклональних антитіл є можливість їх отримання в необмежених кількостях з ідентичними від партії до партії фізико-хімічними характеристиками. Основною властивістю, на якому засновано застосування моноклональних антитіл, є висока специфічність взаємодії. Використання моноклональних антитіл в «сандвіч» - модифікації дозволяє скоротити час аналізу.
Рівень антитіл до колагену I типу та фибронектин можна визначати багатьма методами: імуноферментного аналізу, іммунофлуоресцетгним, методами ракетного іммуноелектрофореза і аглютинації. Серед них метод твердофазного імуноферментного аналізу має переваги в простоті, доступності використання, точності і достовірності. Ось чому більшість результатів вивчення антитіл до колагену і фібронектину, наведених нижче, отримані методом імуноферментного аналізу.
Для дослідження рівня антитіл до колагену Г типу, загального і імуноактивний фибронектина здійснюється забір крові в поліпропіленові пробірки. У пробірки, призначені для визначення фібронектину, додається антикоагулянт 3,8% цитрат натрію в співвідношенні кров до антикоагулянтів 1: 9 за обсягом. Для запобігання протеолітичного розщеплення фибронектина до розчину антикоагулянту додається трасилол в кількості 40 ED / мл. Кров відразу повинна бути центріфугірована протягом 15 хв при 3000 обертів / хв. Отримані сироватки і плазми переносяться в пластикові еппо Дорф, заморожуються і зберігаються при tt-20 ° C. До виконання аналізів проби не повинні розморожувати для запобігання утворенню фібронектину-С, що представляє собою розщеплену молекулу (Morrink et al., 1985). Час від забору зразків сироватки та плазми до виконання аналізів не повинно перевищувати 6 місяців.
Антитіла до колагену I типу визначаються методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням нативного гетерологічного колагену I типу (Katsuyuki F. et Michiko Т.).
Нативний колаген I типу застосовується для іммобілізації на полістиролових планшетах фірми «Libro Plastics» (США). Колаген вноситься в лунки планшета по 200 мкл в фосфатному буфері 0,01 pH 7,4. Планшети инкубируются протягом 15-18 год при t ± 4 ° C, потім багаторазово відмиваються водопровідною водою з 0,05% -м таємному 20 і вносяться в лунки по 200 мкл досліджуваних зразків сироватки крові, розведених 1: 1000 фосфатно-сольовим буфером pH 7,2. Зразки инкубируются в лунках протягом 30 хв при t ± 37 ° C. Лунки знову відмиваються, як зазначено вище, і в кожну з них додають по 200 мл кон`югату протівоколлагенових антитіл з пероксидазою в робочому розведенні. Кон`югат инкубируют 30 хв при t ± 37 ° C і після відмивання планшетів в кожну лунку вносять по 200 мкл субстратной суміші, що складається з 0,0015% -го розчину перекису водню і 0,01% -м розчином ортофенілендіамін в 0,05М цитратному буфері pH 4,7. Після інкубації протягом 10 хв при кімнатній температурі реакцію зупиняють додаванням в лунки 50 мкл 50% -й сірчаної кислоти. Інтенсивність забарвлення субстратной суміші вимірюється при довжині хвилі 492 нм.
Як зразок порівняння береться пул сироватки, отриманої від 100 донорів. Результати визначаються за формулою:
А - Те / Тк • 100, де Тк - титр зразка порівняння-
То - титр досліджуваного зразка.
Рівень загального фибронектина плазми визначається за методикою Г. А. Ермолина за допомогою ELISA в «сандвіч- модифікації».
Кролячі антитіла до фібронектину людини використовують для іммобілізації на полістиролових планшетах ( «Libro Plastics»). Антитіла вносяться в лунки планшета по 200 мкл в карбонатному буфері 0,01 pH 9,6 (вміст білка 10 мкг / мл). Планшети інкубують протягом 15-18 год при t 4
Стандартну калібровану криву отримують, використовуючи фибронектин, який для калібрувальної кривої розлучається в фосфатно-сольовому буфері з 0,05% - м твіном 20 pH 7,2-7,4. В результаті аналізу серії отриманих калібрувальних кривих, побудованих в координатах, величина екстинкції - кількість фібронектину, вибирається лінійний ділянку калібрувальної кривої, до складу якого такі кількості фибронектина: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 нм / мл. Зміст фибронектина в досліджуваних зразках плазми крові визначають за стандартною калібрувальної кривої. Стандартні розведення фибронектина для побудови калібрувальної кривої готуються для кожного планшета.
Фізіологічно молекула фибронектина плазми здатна реалізовувати свою зв`язує опсоніческую активність тільки за умови наявності хоча б одного вільного домна до колагену (EngvaJl Е. et al, 1977). При цьому одна молекула фибронектина має 2 домену - по одному в кожній субодиниці (D&rsquo-Ardenne A. et al., 1984). Таким чином, визначаючи рівень загального фибронектина плазми, не можна з достатньою, достовірністю судити про функціональну активність його молекул, так як реакції визначення засновані на розпізнаванні видових епітопів.
Дня визначення змісту імуноактивний фибронектина плазми використовується модифікація ELISA ,, при якому на полістиролових планшетах іммобілізовивают НЕ антитіла як «сандвіч-метод», а 1% - й розчин желатину, з яким фибронектин зв`язується через колагеновий домен. Таким чином, для визначення в планшеті з желатином на твердій фазі взаємодіють тільки молекули фибронектина плазми, які мають вільний домен, «липкий» до колагену. Як стандарт використовується свіжа плазма здорового донора з відомим вмістом загального фибронектина плазми. Розрахунок змісту імуноактивний фибронектина плазми в пробах обчислюється за формулою:
К = 1 - (х - N / x), де К - кількість імуноактивний фибронектина плазми, виражене в умовних едініцах-
х - екстінція зразка-
N - екстінція донорської плазми.
