Висновок - лазерна діагностика в біології та медицині
Відео: "Сучасні принципи діагностики та лікування сарком м`яких тканин" (частина 2)
Відео: Біохімія організму
Під час написання даної книги автори ставили перед собою завдання познайомити широкого читача з новою бурхливо розвивається і захоплюючою областю досліджень, що полягає в розробці методів лазерної діагностики стосовно завдань, що вирішуються в біології та медицині. У книзі представлені найрізноманітніші методи діагностики. Деякі з цих методів вже добре себе зарекомендували при використанні в клініках і лабораторіях, налагоджений промисловий випуск відповідної діагностичної апаратури. Інші методи знаходяться в стадії розробки і з їх допомогою отримані лише найперші результати.
На сьогоднішній день ситуація така, що практично кожен новий метод або методика лазерної макро- або мікродіагностікізастосовується апробуються на дослідженні біооб`єктів, і немає можливості навіть перерахувати всі ці методи. Тому ряд методів та конкретних прикладів їх застосування в біології та медицині залишився поза увагою авторів. Однак не можна не сказати хоча б у висновку про цілому великому класі лазерних методів діагностики, який взагалі не порушувалося в книзі, - це методи руйнує діагностики.
Через складність біооб`єктів за допомогою неруйнівних методів мікродіагностікізастосовується часто вдається отримати лише якісну інформацію про склад речовини, наявності домішок та ін. В зв`язку з цим інтенсивно розвиваються методи лазерної аналітичної спектроскопії, засновані на ефектах лазерного фотозбудження і фотоіонізації попередньо підготовлених проб біооб`єктів шляхом локального випаровування або розпилення лазерним, електронним або іонним пучками, їх атомізації в полум`ї, термічної атомізації в вакуумі або інертному газі. Ці методи мають високу чутливість і дозволяють отримати кількісну інформацію про зміст різних, наприклад токсичних, домішок в біооб`єктах [П. 40, П. 42, П. 47, 1].
Умовно лазерні методи руйнує діагностики можна розділити на дві групи.
До першої групи належать методи лазерно-ионизационной спектроскопії, в яких, як правило, не потрібно забезпечення локальності діагностики. У цих методах біооб`єкт попередньо тим чи іншим способом атомизируется або забезпечується десорбція молекул з його поверхні. Після підготовки зразка, застосовуючи різні методи однофотонной або многофотонной іонізації лазерним випромінюванням, отримують потік іонів (М +, е ~, (М + С) +) (рис. 5.1), який аналізують шляхом вимірювання електропровідності плазми, або реєстрації вторинних електронів, або використання пропорційних лічильників іонів, або спектрометрії рухливості іонів, або мас-спектрометрії утворилися іонів.
До другої групи належать методи лазерного мікро- спектрального аналізу, які, як правило, забезпечують високу просторову роздільну здатність аналізу за рахунок локального випаровування надзвичайно малих обсягів біооб`єкту (мікропроб) сфокусованим лазерним пучком. Далі використовують традиційні методи аналізу випаруваного речовини: емісійну спектроскопію (при додатковому порушення плазми в дуговому розряді), абсорбційної-трансмісійну спектроскопію або флуоресцентну спектроскопію, а також мас-спектрометрії.
Сучасні завдання діагностики (токсикологія, забруднення навколишнього середовища) вимагають розвитку методів, що дозволяють контролювати вміст домішок в речовин в межах 10-8-10_і%. Така чутливість реалізується в схемах ступінчастою лазерної фотоіонізації при атомізації за рахунок нагріву речовини в тиглях (до 3000 ° С) в атмосфері інертних газів або в вакуумі, нагріву, випаровування і розпилення речовини потужними лазерними, електронними та іонними пучками [П. 42, 1].
Термічна атомізація в вакуумі є найбільш універсальним і досить простим методом, що дозволяє забезпечити чутливість, близьку до граничної. Він застосуємо для широкого класу речовин, в тому числі і біологічного походження. Для його реалізації досить мати вакуум в робочій камері на рівні 10-6 Торр.
Для здійснення многофотонной ступінчастою іонізації атомно-молекулярних пучків в найбільшою мірою підходять лазери на барвниках з накачуванням від ексимерних лазерів, які випромінюють в діапазоні 217-970 нм. У цю область довжин хвиль потрапляють атомні переходи більшості елементів періодичної таблиці (80%). Простіші системи можуть використовувати в якості накачування азотний або мідний лазери.
Фотоіонізаціонний метод найбільш цікавий для дослідження біологічних об`єктів, оскільки дає можливість аналізувати слідові концентрації домішок певного елемента без попереднього поділу проби. Відомими прикладами такої діагностики є аналіз слідів А1 в крові і в морській воді, а також слідів Ru в морській воді, в породах дна океану і кістках риб [П. 42, 1]. При використанні двох-і триступеневої схем збудження ридберговских станів межі виявлення склали (1-2) * 10-7 ат. % А1 і 3 «10-12 ат. % Ru.
Значне місце серед руйнівних методів діагностики займає лазерна мас-спектрометрія [П. 42, П. 47]. Використання лазерної фотоіонізації забезпечує підвищену селективність аналізу, високий вихід іонів (до 100%) і можливість дослідження коротко- живуть продуктів. Мас-спектр являє собою розподіл масових піків по інтенсивності і є характеристикою досліджуваного біооб`єкту. У лазерної мас-спектрометрії найбільш широке застосування знайшли часопролітної системи з селекцією іонів в секторних електричних або магнітних полях, статичні системи з подвійним фокусуванням і динамічні мас-спектрометри типу «мас-рефлектон».
Лазерна мас-спектрометрії використовується для детектування атомарних і молекулярних кластерів, домішкових молекул і радикалів в газах, з її допомогою досліджуються різні сполуки, важливі для біології, медицини, фармакології. Наприклад, близька до 100% ефективність двоступеневої фотоіснізаціі молекул нафталіну випромінюванням KrF лазера (Х = 248 нм) дозволяє детектувати поодинокі молекули в обсязі опромінення за один лазерний імпульс. В результаті чутливість аналізу відповідає реєстрації молекул нафталіну при їх парціальному тиску на рівні 10-14Торр або відносної концентрації в повітрі 10-8 [П. 42].
Переваги лазерної Мессі-спектрометрії проявляються при вивченні труднолетучих і нестійких до нагрівання органічних і біоорганічних молекул, які важко перевести в газову фазу. Мас-спектри молекулярних кристалів аденіну, антрацену, гуаніну, тиміну, урацилу, цитозину і трипептида представлені в [П. 42]. Там же дані результати великих досліджень по мас-спектрометрії, виконаних для різних класів органічних біологічно активних нелетких сполук: олигосахаридов, глікозидів, нуклеотидів, амінокислот і олігопептидів і ін. Для впевненої записи мас-спектра досить, наприклад, зразка сахарози масою 5 нг.
Емісійний спектр випромінювання плазми досліджується різними способами в залежності від розв`язуваних задач. Наприклад, що випускається промисловістю НДР прилад LMA-10 використовує дифракційну спектрограф з фотографічною реєстрацією спектру [2]. Цей прилад забезпечує мінімальні розміри проб 10x10 мкм при аналітичної чутливості 10-11-10-13 м Як лазерного джерела застосовується рубіновий лазер з модуляцією добротності.
Поєднання лазерного випаровування речовини з подальшим абсорбційної-трансмісійним аналізом цих парів дозволяє поєднувати гідності обох методів, т. Е. Отримувати високу ступінь локальності і значну чутливість. Такий спектрометр був використаний при дослідженнях розподілу змісту Cd в кірковій речовині нирки людини [П. 40, 3]. При вимірах діаметр лазерного кратера в зразку товщиною 4 мкм становив 50 мкм, чутливість детектування достатня при аналізі менше 0,1 пг речовини, похибки вимірювань вмісту Cd порядку 6-30 ррш.
Отримав розвиток метод лазерної мікроаналітичних мас-спектрометрії, або JTAMMA-метод, що забезпечує дозвіл на микронном або субмікронних рівнях [П. 42, П. 47]. Цей метод і відповідна апаратура розроблялися спеціально для елементного аналізу в біооб`єктах. JlAMMA-метод дозволяє досліджувати зміст будь-якого елемента періодичної таблиці в біологічних речовинах. Він не вимагає еталонів і дозволяє проводити одночасний аналіз багатьох елементів. Об`єкти дослідження найрізноманітніші: лікарські препарати, суха цільна кров та її компоненти (сироватка, плазма, еритроцити), сітківка ока, тканини печінки, тканини м`язів і інші тканини органів тварин, ниркові камені, кормові дріжджі, тканини рослин (листя, коріння, гілки та ін.) та ін. [П. 42, П. 47, 4-8].
Просторова роздільна здатність методу досягає 1 0,5 мкм, абсолютний межа виявлення багатьох елементів 10-1-6 г, а концентраційний межа виявлення 10-4- 10-8%. Витрата кількості речовини при аналізі становить всього 1 пг і навіть менше. Метод дозволяє проводити аналіз на клітинному і субклітинному рівнях дозволу, на одиничних бактеріях і частинках пилу.
Крім елементного аналізу Елої-метод виявився корисним при вивченні мас-спектрів багатьох класів органічних і біоорганічних сполук: вуглеводів (олігосахаридів, глікозидів та ін.), Органічних кислот (аскорбінової, барбіталовой і ін.), Амінокислот і мікропептидів (гліцину, еланіна, валина , лейцину, ізолейцину, тирозину і фенілаланіну), органічних солей, ароматичних сполук (антрацену, фенантрену, дібензогіофена, ді-бензофурана, карбазолу, Трифену фосфору), металоорганічних комплексів, з`єднань з великою молекулярною вагою (кобаламинов, глікозідадігітоніна і синтетичного липида при додаванні в зразок хлоридів натрію, калію і цезію) [П. 42].
Елої-метод реалізований в різноманітних промислових лазерних мас-спектрометрах чіпа LAMMA-1000 (ФРН), LIMA (Англія), емаль, емаль-2 (СРСР) [П. 42, П. 47].
