Абсорбційна спектроскопія бистропротекающих процесів - лазерна діагностика в біології та медицині

Абсорбційна спектроскопія бистропротекающих
процесів
Методи ультрашвидкий лазерної спектроскопії дозволяють проводити дослідження динаміки внутрішнього руху біомолекул. Багато в чому саме потреби досліджень структурної динаміки біомолекул стимулювали розвиток пико- і субпікосекундной спектроскопії, в тому числі і абсорбційної спектроскопії бистропротекающих процесів [П. 1 - п.З]. За допомогою цих методів досліджуються надшвидкі процеси коливального і електронного збудження біомолекул, а також динаміка хімічних реакцій з їх участю.
Абсорбція методи дозволяють визначати повний час релаксації біомолекул в основний стан, час їх коливальної релаксації, швидкість передачі збудження в суміші біомолекул, швидкість передачі заряду між биомолекулами в суміші акцепторів і донорів, динаміку фотодиссоциации біомолекул в розчині, швидкість конформаційних змін та ін. Досліджуються первинні процеси фотосинтезу організмів - пурпурних і зелених бактерій-динаміка фотосистем I і II в зелених рослинах і водорослях- первинні стадії перетворення енергії світла родопсин при вивченні фотохімії зору і біоенергетики галофільних бактерій (бактериородопсин) - фотообратімие фотохромні пігменти (фітохром), що виконують биорегуляторная функції в клітинах багатьох найпростіших і рослин-динаміка фотодиссоциации гемопротеинов (гемоглобіну і міоглобіну) і ін. Характерні часи розглянутих процесів лежать в досить широкому діапазоні: 0,6-200 пс, необхідний діапазон довжин хвиль лазерного випромінювання для їх дослідження становить 460-880 нм.
Основна ідея абсорбційної спектроскопії з використанням надкоротких імпульсів полягає в тому, щоб «піти» від прямих вимірювань тривалості імпульсу, минулого яка поглинає середу. Тому застосовують два послідовних світових імпульсу, перший з яких переводить біомолекули з основного в збуджений стан, а другий, затриманий на пико- або субпікосекундний інтервал часу, так званий вимірювальний імпульс, реєструє зміна спектра поглинання досліджуваного об`єкта. В даному випадку інерційний фотодетектор фіксує ті зміни в спектрі поглинання, які відбулися за час, що визначається часовою затримкою.
Можливі найрізноманітніші схеми, що реалізують цю ідею, див., Наприклад, [П. 1 - П. 3, 1.35]. При цьому збудливий і пробний імпульси можуть мати однакові і різні довжини хвиль, що збуджує і зондує лазерні пучки можуть бути взаємно перпендикулярні і майже колінеарні, як реєструючого елементу можуть бути використані: фотоплівка, фотодіодние матриці, відеокамери, оптичні багатоканальні аналізатори, і окремі фотодетектори. Можуть бути реалізовані схеми з поодинокими збудливим і пробними імпульсами і з багаторазовим їх повторенням, з широким спектром зондуючого випромінювання тощо.
При дослідженнях швидкостей орієнтаційної і обертальної релаксації, а також швидкості передачі електричної енергії молекул в рідинах використовується одна з модифікацій методу, яка заснована на аналізі наведеної поляризованим збудливим імпульсом анізотропії в середовищі за допомогою вимірювання поглинання пробного імпульсу для різних взаємних орієнтацій поляризації збуджуючого і пробного імпульсів [ П. 1].
Найбільшого поширення при вивченні фотохімічних процесів перебудови структури біомолекул отримав так званий метод диференціальної абсорбційної спектроскопії, який заснований на реєстрації диференціальних спектрів поглинання, що представляють собою різницю між спектрами поглинання до порушення і спектрами, зареєстрованими в різні проміжки часу після порушення. Зміна оптичної щільності досліджуваного об`єкта ДD (k, t) визначаться співвідношенням [6, 7]
де Е = Е а! ЕОА і ей ~ Е ° п / Е1п - відношення енергій пробного і опорного імпульсів, що пройшли через досліджуваний зразок при порушенні та без порушення.

Мал. 5.3. Схема пикосекундной абсорбційного спектрометра на базі параметричних генераторів світла [7]

Мал. 5.2. Принципова схема субпікосекундного абсорбційного спектрометра [61
Як приклад на рис. 5.2 і 5.3 представлені схеми двох типових субпіко- і пікосекундних абсорбційних спектрометрів, що реалізують диференціальну методику, вимірювання спектрів поглинання, майже колінеарну поширення збудливого і пробного світлових пучків, змінну оптичну лінію затримки імпульсів.
У першій схемі імпульс світла гігаватного потужності тривалістю т&bdquo- = 100 фс на довжині хвилі Х = 615 нм ділиться між каналами збудження і зондування. У каналі збудження імпульс через оптичну лінію затримки /, нейтральний світлофільтр 2 потрапляє на зразок 3 і далі на монохроматор 4. В каналі зондування відбувається перетворення випромінювання в субпікосекундний континуум (ВКР перетворення в сантиметрової кюветі з водою, 5, 6 - червоні світлофільтри). Цей пучок далі ділиться на два: пробний і опорний. Пробний поєднується з збудливим пучком, а опорний після фільтрації за допомогою синьо-зеленого світлофільтру 7 використовується для отримання інформації про спектр поглинання середовища за відсутності порушення. Зміна тимчасової затримки імпульсів дозволяє вивчати кінетику процесів, а перебудова монохроматора - зміни в спектрі наведеного поглинання на обраних довжинах хвиль. Сигнали після монохроматора приймаються фотоприймачами 8, 9, оцифровуються за допомогою цифрових вольтметрів 10 і вводяться через інтерфейс 11 в ЕОМ 12, яка здійснює накопичення даних по багатьом лазерним спалахів, їх усереднення і обчислення середньоквадратичної похибки, а також управління роботою всього спектрометра.
Друга схема побудована на основі параметричних генераторів світла (ПГС), відрізняється високим ступенем автоматизації вимірювань і обробки даних (рис. 5.3). Це дозволяє проводити дослідження широкого класу біооб`єктів з малою похибкою вимірювання оптичної щільності, аж до 2-10-4. Джерелом накачування є АІГ: Nd лазер 1 з системою виділення моноімпульса 2 і підсилювачем 3, що визначає високу надійність і стабільність роботи спектрометра. Можлива заміна задає лазера на лазерну систему на фосфатному склі, що дозволяє на порядок збільшити тимчасовий дозвіл спектрометра. Джерелом збудливого випромінювання є пикосекундной ПГС на кристалі KDP 5, що накачується другий гармонікою лазера на АІГ: Nd. При використанні удвоителя і суматора частот 4 така система дозволяє перекривати досить широкий діапазон від 330 до 1400 нм і отримувати досить значний рівень енергії ^ 0,1 мДж.
У каналі зондування можна використовувати два джерела світла: ПГС - на кристалі LiNb03 6 з подвоювачем частоти або джерело пикосекундной континууму (ВКР перетворювач на важкій воді 7). При вимірах кінетичних характеристик поглинання в окремих ділянках спектра застосування ПГС дає можливість підвищити надійність і розширити діапазон вимірювань за рахунок високої стабільності енергетичних ,, спектральних і тимчасових характеристик, широкого діапазону довжин хвиль, включаючи УФ та ІЧ області спектра, високою спектральної яскравості і монохроматичности випромінювання. Останнє дозволяє працювати без монохроматора і використовувати фотодіоди для реєстрації сигналу. При знятті диференціальних спектрів нестаціонарної поглинання більш зручним виявляється ВКР перетворювач на D20 в поєднанні з перебудовуваним монохроматором 12. Неназвані параметри схеми на рис. 5.3: 8 - оптична лінія затримки, .9 - біооб`єкт, 10 - фотодатчик, 11 - електромагнітний затвор, 13 - автоматизована система управління спектрометром.
Принциповим є той факт, що імпульси, одержувані від ПГС, мають більш круті фронти, ніж імпульси лазерів з синхронізацією мод. Це дозволяє збільшити тимчасовий дозвіл за рахунок зменшення тимчасової області перекриття збудливого і зондуючого імпульсів. Розглянутий спектрометр допускає застосування схеми з зондуванням в зустрічному напрямку по відношенню до пучка збудження, що дає можливість значно знизити потрапляння розсіяного світла збудливого пучка в канал зондування. Ця можливість особливо важлива при дослідженнях сильно розсіюють біологічних об`єктів.
Для більш детального ознайомлення з методами лазерної пико- і субпікосекундной абсорбційної спектроскопії біомолекул, з лазерними спектрометрами надвисокої роздільної тимчасового дозволу, а також з конкретними дослідженнями динаміки біомолекул можна рекомендувати літературу, що вийшла в останні роки [П. 1 - П. 3,
1.35].