Лазерна поляризационная нефелометрія - лазерна діагностика в біології та медицині

Лазерна поляризационная нефелометрія
Загальні відомості. Поширення світла в розсіює і поглинає середовищі супроводжується як ослабленням потужності зондуючого пучка, так і появою розсіяного світла. Кількісно ці явища характеризуються за допомогою коефіцієнта поглинання а, перерізи розсіяння про та індикатриси розсіяння I (0). Однак ця система є неповною. У ній не враховуються зміни стану поляризації при розсіянні.
Найбільш повне пружне розсіяння світла окремими частинками або ансамблями часток описується за допомогою матриці розсіювання світла (МРС) - матриці Мюллера, кожен з 16 елементів якої є функцією довжини хвилі, розміру, форми і складу частинок [17]. Хоча повна МРС містить в собі значну інформацію, властивості всіх її елементів ще не досліджені в достатній мірі. Зупинимося на поляризаційних характеристиках розсіяного випромінювання і можливості їх використання для діагностичних цілей.
Як відомо, біологічні об`єкти мають вельми складну будову, і тому для опису їх властивостей необхідно проводити вимірювання багатьох параметрів, і в той же час вимірювання повинні проводитися досить швидко, до настання незворотних змін в об`єктах in vitro *), або за час настання сенсорно- моторної реакції на об`єктах in vivo. У зв`язку з цим в основу пристроїв для дослідження кутових і поляризаційних характеристик можуть бути покладені швидкодіючі методи і засоби, що використовуються в сучасній еліпсометрії [18]. Однак у зв`язку з обмеженістю апріорних знань про досліджувані біологічних об`єктах автоматичні нуль еліпсометрія з осередками Фарадея [19], що мають велику точність, високу швидкодію і значні перспективи в еліпсометрії поверхні твердих тіл, не можуть бути широко використані в біології та медицині. У біологічних дослідженнях універсальність методу важлива, навіть якщо це дається ціною деяких поступок в точності і швидкодії, т. Е. Необхідні вимірювання повної МРС.

* У пробірці (лат.).

Вимірювання повної МРС пов`язані з певними труднощами. Ймовірно, найпростішим способом вимірювання всіх елементів МРС є використання оптичних елементів, які розміщені перед і за розсіює середовищем [2и]. Як оптичних елементів використовуються лінійні поляризатори і фазові пластинки - компенсатори, оптичні осі яких можна виставляти певним чином відносно горизонтальної площини. Вимірюючи інтенсивності світла при певних наборі і положеннях оптичних елементів нефелометра, можна визначити всі 16 елементів МРС за допомогою відповідних обчислень [17]. Основним недоліком методу вимірювання МРС є можливість виникнення великих відносних похибок при вимірах малих інтенсивностей, одержуваних у вигляді різниць великих сигналів.
Поляризаційний нефелометр. До теперішнього часу розроблено кілька типів поляризаційних нефелометрія для вимірювання МРС, в тому числі і заснованих на модуляції поляризації, в яких основним елементом є поляризаційно-оптичний модулятор [17]. Розглянемо один з варіантів поляризационного нефелометра, добре себе зарекомендував при дослідженні біологічних тканин [21]. Головним його принципом є модуляція світлового пучка за допомогою обертання поляризаційних елементів навколо осі променя з подальшим фотоелектронним детектированием сигналу, аналого-цифровим перетворенням значень фотоструму і розрахунком за отриманими даними оптичних характеристик об`єкта за допомогою сполученої з нефелометрія мікро-ЕОМ. В установці була реалізована схема з обертовими компенсаторами, яка має порівняно простий алгоритм обробки і невисокі вимоги до електронного забезпечення [18].
Оптична схема установки для вимірювання всіх 16 елементів МРС представлена на рис. 2.1. Установка містить фіксовані поляризатор Р і аналізатор А і дві обертові фазові пластинки F і F `, розташовані перед і за досліджуваним об`єктом. Поляризатор і аналізатор орієнтовані паралельно один одному, і їх площині пропускання перпендикулярні площині рассеянія- швидкі осі фазових пластинок F і F `складають з площиною розсіювання кути lt; р і ср `, а внесені ними різниці фаз рівні
б і б `відповідно. Тоді якщо 50 {/ 0, Qo, U0, У0} - вектор-параметр Стокса на вході системи, a S {I, Q, U, V} - вектор-параметр Стокса на її виході, то матричне рівняння, що зв`язує між собою ці вектори, має вигляд
S = AxF`xMxFxPxS, (2.4)
де A, F `, М, F, Р - матриці Мюллера аналізатора, фазової пластинки, розташованої за об`єктом, самого об`єкта, фазової пластинки, розташованої перед об`єктом, і поляризатора відповідно, явний вигляд яких можна знайти, наприклад, в [22]. Співвідношення швидкостей обертання фазових пластинок F і F `було вибрано рівним 1: 5, т. Е. Ф` = 5Ф, так як в цьому випадку однозначно визначаються всі 16 елементів МРС [23].
-

Мал. 2.1. Блок-схема поляризационного нефелометра
Перемножая матриці Мюллера в рівнянні (2.4) і проводячи відповідні тригонометричні перетворення, можна показати, що інтенсивність I на виході системи можна представити у вигляді ряду Фур`є:
(2.5)

Коефіцієнти ряду можуть бути розраховані за формулами дискретного перетворення Фур`є:

(2.6)

якщо відомі I (lt; рг) - значення інтенсивності випромінювання, що реєструються фотодетектором при орієнтації швидкої осі фазового пластинки під кутом lt; рг до площини розсіювання.
Значення коефіцієнтів Фур`є а2к і b2ь. визначаються параметрами досліджуваного об`єкта і використовуваних поляризаційних пристроїв. Їх явні вирази мають найбільш простий вигляд, якщо б = б `= я / 2, однак на практиці точне виготовлення таких пластинок є досить складне завдання і відхилення реально отриманих значень б від л / 2 не можна вважати дуже незначним. Тому зазвичай використовуються загальні вирази для коефіцієнтів a2k і b2й, отримані при довільних б і б `. Неважко показати, що в цьому випадку елементи МРС досліджуваного об`єкта виражаються через коефіцієнти Фур`є ath і явний вигляд яких наведено в [21].
Таким чином, для визначення всіх 16 елементів МРС необхідно провести вимірювання інтенсивності 1 світла на виході системи при різних кутових положеннях фазових пластинок F і F `, причому, як зазначено вище, швидкість обертання фазової пластинки F в п`ять разів більше швидкості обертання пластинки F. Визначивши потім коефіцієнти а2к і bik за формулами (2.6), де N для ефективної реалізації швидких перетворень Фур`є вибрано рівним 256, можна визначити елементи МРС MiS.
Як джерело світла в поляризаційному нефелометрія [21] використовується Ні-Ne лазер 1 типу ЛГН-207А ( = 632,8 нм) (рис. 2.1). На плечах гониометра ГС-5 замість коллиматора і зорової труби змонтовані оптичні кутомірні головки з точністю візуального відліку кутів повороту Г, за якими можна контролювати кути повороти поляризатора 2, аналізатора 3 і компенсаторів 4 і 5. Обертання кутомірних головок поляризаційних елементів здійснюється за допомогою крокових двигунів 11 і 12 відповідно. Керуючі імпульси подаються на крокові двигуни через підсилювачі потужності 14 і 15 за допомогою пристрою сполучення 10 по команді з мікро-ЕОМ 6. Поворот вузла аналізатора з дискретністю 4 `здійснюється кроковим двигуном 13 і підсилювачем потужності 16 по команді з мікро-ЕОМ.
Найбільша точність і чутливість при вимірі слабких світлових потоків може бути досягнута застосуванням методу рахунку фотонів. Тому в якості фотоприймача 7 використовується ФЕУ-79, який має задовільний ділянку лічильної характеристики і мала кількість темнова імпульсів. Сигнал з ФЕУ надходить на амплітудний дискримінатор 8 - порогове пристрій з підсилювачем. Діскрімінатор частково відсікає шумові імпульси з ФЕУ, а також підсилює і стандартизує сигнальні імпульси. Сигнал постійної амплітуди з дискримінатора, частота якого пропорційна інтенсивності падаючого на ФЕУ світла, реєструється частотоміром 9. Взаємодія всіх елементів схеми і мікро-ЕОМ забезпечується пристроєм сполучення 10.
Мікро-ЕОМ видає серію імпульсів, які через пристрій сполучення надходять нг крокові двигуни,
I при повороті фазових пластинок на заданий кут змінюваний сигнал з ФЕУ реєструється частотоміром. Значення інтенсивності світла, що реєструються частотоміром при заданих кутових положеннях фазових пластинок, піддається потім Фур`є-аналізу для визначення поляризаційних характеристик розсіяного випромінювання.

Мал. 2.2. Індикатриси елементів МРС нормального (а) і мутного ф) кришталиків ока людини

Методи калібрування установки досить докладно описані в [21]. Оцінка апаратних похибок і аналіз відповідних спотворень, що вносяться нефелометрія в структуру і кутові залежності компонентів МРС, проведені за допомогою експериментів на суспензіях полістиролів латексів, показали, що найбільші відхилення значень елементів матриці від теоретичних значень
не перевищують 3%, а для компонентів четвертого рядка і четвертого стовпця - 5%.
Матриці розсіювання світла прозорого і мутного кришталиків. Вимірювання МРС проводилися на інтактних кришталиках трупних очей людини, причому час після смерті до початку вимірювань в середньому не перевищувала 8 годин. Каламутні кришталики були отримані безпосередньо після операцій з приводу катаракти. Проведені дослідження показали, що спостерігається гарна відтворюваність результатів вимірювань, виконаних з інтервалом часу не більше 2 годин, при цьому помилка визначення будь-якого матричного елемента не перевищує апаратурною похибки. Індивідуальні відмінності прозорих кришталиків знаходяться в межах 5-10%, в той час як варіації властивостей митних кришталиків виражені більш помітно, що пояснюється різним ступенем зрілості катаракти.
Вимірювання кутових залежностей елементів МРС прозорого і мутного (зріла ядерна катаракта) кришталиків ока проводилися в діапазоні кутів від 20 до 140 °. На рис. 2.2 представлені результати відповідних вимірювань. Аналіз всіх компонентів МРС різних кришталиків показує, що з точністю до похибок вимірювань наведена МРС (т. Е. Все елементи МРС нормовані на перший елемент) має наступну структуру:
(2.7)
При цьому відмінності елементів М33 і М44 не перевищують 10%. Наявність ненульових значень елементів М13 і М23 свідчить про те, що розсіює часткам кришталика властивий відмінний від нуля коефіцієнт перехресної поляризації [17]. Можливим поясненням цього може бути оптична активність речовини кришталика або, що більш імовірно, розсіювання на структурах кришталика, осі симетрії яких нахилені до площини симетрії. Згладжений характер всіх отриманих кривих пояснюється полидисперсностью розсіюють частинок. Відзначимо, що у всьому діапазоні кутів елементи МРС прозорого кришталика задовольняють нерівності
(2.8)
справедливому для скупчення сферичних частинок, неоднорідних за розміром або складу [24].
Як видно з рис. 2.2, кутові характеристики МРС мутного кришталика істотно змінені порівняно с- прозорим кришталиком. Значення елементів М12 і М21, залишаючись негативними, зменшуються за абсолютною величиною, і точка екстремуму зміщується в бік великих кутів розсіювання. Характер кутовий залежності елемента М22 вказує на появу в середовищі великих несферичних розсіюють частинок. Частинки великих розмірів обумовлюють і зміщення точки перетину кривої Мз3 з віссю абсцис в сторону кутів, великих 100 °. Слід так »ж помітити, що при малих кутах розсіювання (lt; 20 °) матричні елементи мутного кришталика не задовольняють нерівності (2.8).
Для порівняння розсіюють властивостей локальних ділянок кришталиків були проведені вимірювання МРС при переміщенні його вздовж променя для декількох фіксованих кутів розсіювання. При цьому візуються обсяг зміщувався на 4 мм в обидві сторони від центру. Було отримано, що зміщення кришталика в межах ± 2 мм не призводить до помітних змін елементів МРС. Це свідчить про `однорідності розсіюють властивостей в межах ядра кришталика, що дозволяє проводити вимірювання МРС на об`єктах in vivo, без внесення жорстких обмежень на стабільність положення кришталика ока.
Таким чином, проведені дослідження показують, що елементи МРС прозорого і катарактального кришталиків мають яскраво виражені відмінності за абсолютним значенням і їх кутовим залежностям. Однак для ранньої діагностики катаракти необхідні дослідження МРС на всіх стадіях зародження і розвитку катаракти. У зв`язку з цим на тварин вивчалися характерні зміни елементів МРС в залежності від ступеня помутніння кришталика. Кришталики з різним ступенем помутнінь отримували від кроликів, які піддавалися щоденним затравки нафталіну протягом 5 діб (1,5 грама нафталіну на 1 кг маси тварини на добу) [25]. Порівняння результатів для нормальних кришталиків ока кроликів і людини свідчить про майже повний збіг їх розсіюють властивостей. Це відповідає висновкам, отриманим на підставі біохімічних досліджень, про великий специфічності органу і малої специфічності виду для складу і будови кришталика [26].
На рис. 2.3 представлені кутові залежності елементів МРС кришталиків кроликів, піддавалися затравки нафталіну протягом 2 і 5 діб відповідно. Традиційні методи клінічних досліджень не дозволили в цьому випадку діагностувати наявність помутнінь, в той час як в кутових залежностях елементів МРС чітко простежуються відмінності від відповідних характеристик прозорого кришталика. Після 5 діб затравки в більшості випадків спостерігалося виражене помутніння кришталика. Якісна зміна характеристик розсіювання схоже з відповідною картиною для зрілої катаракти ока людини, проте є ряд відмінностей, пов`язаних з тим, що нафталінова катаракта моделює дещо інший типу катаракти, ніж бура ядерна катаракта [27].

Мал. 2.3. Індикатриси елементів МРС кришталика ока кролика при терміні нафталіновою затравки 2 доби (а) і 5 діб (б)
Виявлення елементів МРС, найбільш чутливих до конкретних змін параметрів розсіює середовища, є основним завданням інтерпретації експериментальних результатів светорассеяния [17]. Такими критеріями можуть бути значення кутів розсіювання, при яких індикатриси того чи іншого елемента МРС перетинають нульову лінію. Стан середовища може також характеризуватися екстремальним значенням деяких елементів МРС або їх відносним співвідношенням. Докладний аналіз характеру змін елементів МРС наведено в [21]. Слід тільки підкреслити, що термін затравки не може однозначно характеризувати ступінь помутніння. Остання залежить від цілого ряду чинників, таких як загальний стан організму тварини, індивідуальні особливості його тканин і навіть особливості поведінки.
Однак спостерігається загальна тенденція розвитку помутніння в міру збільшення термінів затравки. На підставі закономірностей поведінки елементів МРС можна зробити висновок, що на ранній стадії розвитку помутнінь збільшення розмірів розсіювачів майже не позначається на характеристиках светорассеяния. Можливо, процес розвитку помутнінь починається з незначного збільшення розмірів великого числа розсіювачів або з появою великих розсіювачів, слабо змінюють поляризаційні характеристики розсіяного світла. Це призводить до порушення в розташуванні частинок нормального кришталика. Слід також зауважити, що нафталінова катаракта - це модель, хоча і не повно описує буру ядерну катаракту. Очевидно, в кожному конкретному випадку характеристики змінюються в залежності від етіології помутніння середовища.
Поляризаційні характеристики рогової оболонки ока. Найбільш повно з усіх оптичних середовищ ока вивчені властивості його рогової оболонки. Спочатку для пояснення високої прозорості рогівки було запропоновано, що розсіюють світло колагенові волокна стромального шару рогівки, оточені базовим речовиною, розміщуються в вузлах «ідеальної решітки» [28]. Однак дослідження будови рогової оболонки, проведені за допомогою електронного мікроскопа, показали наявність невпорядкованості в розташуванні волокон. Відповідно до моделі Харта - Фаррел (ХФ), в розташуванні колагенових волокон рогівки існує впорядкованість ближнього порядку, описувана функцією радіального розподілу g (R), що представляє собою відношення локальної щільності до середньої щільності центрів волокон в залежності від відстані R між волокнами [29]. Така впорядкованість в розташуванні центрів волокон обумовлена макромолекулами базового речовини, які утворюють містки між волокнами [30].
Модель ХФ дозволила пояснити гідрофільні властивості рогівки строми [31], втрату прозорості при появі в рогівці ділянок, позбавлених колагенових волокон [32], і деякі інші властивості рогівки. На підставі моделі ХФ було пояснено також поява картин розсіювання світла під малими кутами на об`єктах in vivo, отримані вирази для поляризаційних і кутових залежностей оптичних властивостей рогівки [33-35].

М`якість розсіюють частинок рогівки дозволяє при розрахунках розсіювання знехтувати явищами багаторазового розсіювання. Далі, вважаючи, що прямо минуле випромінювання збігається з ослабленою когерентної складової [21], можна визначити коефіцієнт ослаблення, проинтегрировав інтенсивність розсіяного по всіх напрямах світла
Мал. 2.4. Спектри пропускання рогової оболонки ока при нормальному падінні світла: 1 - вертикальна поляризація, 2 - горизонтальна поляризація, 3 - неполяризоване світло, 4 -експериментальні дані для неполяризованого світла з [36]
з урахуванням інтерференції хвиль від окремих волокон. Останнє описується статистично за допомогою згадуваної вище функції радіального розподілу g (R). Характеристики светорассеяния окремого волокна розраховуються з використанням добре розроблених методів розрахунку, розвинених для довгих циліндрів, причому найбільш точної відповідності результатів розрахунку з експериментом вдається досягти за допомогою теорії Мі [17].
На рис. 2.4 представлені результати розрахунку спектрів пропускання рогівки в діапазоні довжин хвиль від 200 до 800 нм при нормальному падінні світлових пучків, поляризованих паралельно (/) і перпендикулярно (2) напрямку осей колагенових волокон, а також наведені спектр пропускання неполяризованого світла (3) і експериментальний спектр (4) з [36]. Слід відразу зазначити, що різке зменшення пропускання, що спостерігається експериментально при 400 нм, викликається розсіюванням світла, а не поглинанням. Збільшення або зменшення впорядкованості в розташуванні волокон рогівки має призвести до зміщення нижньої межі спектра пропускання вліво або вправо відповідно. На користь цього твердження свідчить той факт, що у людей з порушеною впорядкованістю волокон (наприклад, після операції кератома) погіршується сутінковий зір [37], яке відповідно до ефектом Пуркіньє здійснюється в короткохвильовій області спектра.
З рис. 2.4 видно, що при А, = 632,8 нм різниця в пропущенні світла двох ортогональних поляризацій Д / = = (/ ± - / ,,) //, (де 7ц, / х - інтенсивності минулого рогівку світла, поляризованого паралельно і перпендикулярно напрямку волокон відповідно, h - інтенсивність падаючого на рогівку світла) становить приблизно 15%, що підтверджено експериментально 138].
У видимій області спектра величина А / лінійно убуває з ростом довжини хвилі від 25% при А, = 400 нм до 11% при?. = 700 нм, т. Е. В короткохвильовій області спектра поляризационная чутливість рогівки в 2,5 рази вище, ніж в довгохвильової. Можливо, цим пояснюється той факт, що ентоптіческое явище «щіток» Гайдінгера спостерігається саме в синьо-зеленій області спектра.
Дослідження властивостей рогівки ока становить інтерес як в зв`язку з необхідністю визначення структури самої рогівки, так і тому, що її характеристики істотно впливають на результати вимірювання параметрів внутрішніх структур ока в умовах in vivo, особливо поляризаційні характеристики локальних ділянок рогівки. Очевидно, особливий інтерес представляють вимірювання МРС рогової оболонки в прямому напрямку, так як саме ці характеристики необхідні для введення відповідних поправок при вимірах параметрів розсіювання внутрішніх структур ока.
Експерименти проводилися на рогівці енуклеірованних очей кролика і рогівці трупних очей людини, причому час до початку експерименту зазвичай не перевищувало 30 хвилин і 8 годин відповідно. Виділені рогівки закріплювалися в спеціальній кюветі, що дозволяє імітувати нормальний внутрішньоочний тиск. Тим самим виключалися спотворення за рахунок додаткових напружень при фіксації.
Діаметр облучающего пучка світла, що визначає розмір досліджуваного локального ділянки рогівки, становив не більше 0,2 мм. Кожній ділянці рогової оболонки відповідає значення координат відповідно до схеми, при якій точці з координатою (12,3) відповідає точка рогівки, розташована у вертикальній площині на відстані 3 мм вище центру, точка (3,1) розташована в горизонтальній площині на відстані 1 мм правіше центру і т. п.
Рогівка встановлювалася таким чином, щоб її передня поверхня була перпендикулярна падаючому променю, і вимірювалися МРС рогової оболонки в напрямку вперед.
Таблиця 2.1
Значення елементів МРС рогової оболонки ока людини

Результати вимірювань для рогової оболонки ока людини представлені в табл. 2.1. Аналогічні результати представлені в табл. 2.2 для ділянок рогівки ока кролика, розташованих уздовж горизонтального меридіана.
Необхідність орієнтації поверхні рогівки нормально до падаючого променю призводить до того, що вимірюваний ділянку розташовується на горизонтальній лінії, що проходить через центр рогівки. Тому при використанні даних табл. 2.1 необхідно враховувати, що матриці всіх ділянок, крім розташованих уздовж меридіана 3-9 годин, повернені на кут, пропорційний кутовій координаті цієї ділянки.
Таблиця 2.2
Значення елементів МРС рогової оболонки ока кролика

У табл. 2.1 наведені значення, усереднені для 10 об`єктів. Індивідуальні відмінності рогівки і різний час зберігання призводять до розкиду виміряних значень, в 2-3 рази перевищує похибка експерименту. Проте для кожної окремої рогівки в межах похибки експерименту виконуються співвідношення симетрії, справедливі для неідеальної фазової пластинки, т. Е. М1г = Мг1, M13-M3U М23 = = М32, Мц = -М4г, M3t = -Mt3, M14 = M41 »0.
Загальною закономірністю для всіх рогівки є також наявність більш виражених анізотропних властивостей на периферичних ділянках уздовж вертикального і горизонтального меридіанів для людини і по лінії від вуха до носа для кролика. Центр рогівки є практично ізотропну пластинку. Локальні оптичні осі, Розраховані для еквівалентних фазових пластинок з урахуванням поправок на кут повороту, мають тенденцію до радіальної симетрії. Дихроизм рогової оболонки максимальний на периферичних ділянках 3 і 9 годин.
Методи діагностики катаракти. Для вирішення завдань діагностики в офтальмології необхідна побудова адекватних моделей прозорих середовищ ока. Тому скажемо кілька слів про поляризаційні властивості таких середовищ, як водяниста волога і склоподібне тіло. Водяниста: волога - прозора безбарвна рідина з показником заломлення близько 1,33 містить сопи, сліди білка, аскорбінову кислоту [39]. Склоподібне тіло являє собою гелеобразную середу, за хімічним складом схожу з водянистою вологою. На частку води припадає 99% всього складу склоподібного тіла, гелеобразную структуру йому надають які у ньому білки [39].
Загальна структура МРС водянистої вологи відповідає матриці ізотропного середовища, вона є практично прозорою середовищем, незначне розсіювання світла відбувається на розчинених в ній компонентах органічного походження. Повна інтенсивність розсіяного світла не перевищує 1,5-2,0%, і водяниста волога не змінює поляризаційні характеристики пройшов через неї випромінювання. МРС ж склоподібного тіла за своїми характеристиками близька до матриці прозорого кришталика, однак розсіюють частинки склоподібного тіла дещо більше і їх показник заломлення менше. І крім того, наявність ненульових членів в лівому верхньому і правому верхньому кутах матриці вказує на аморфне будову об`єкта.
Таким чином, водяниста волога і склоподібне тіло практично не змінюють поляризаційних характеристик прямо минулого випромінювання, і, отже, їх впливом на результати вимірювань об`єктів in vivo можна знехтувати.
Як вже зазначалося вище, вимірювання кутових залежностей елементів МРС оптичних середовищ ока проводилися при нормуванні всіх елементів МРС на значення елемента Мп. Однак при цьому може бути втрачена інформація про структуру середовища, обумовлена високою концентрацією розсіюють частинок досліджуваних тканин [40L Нижче ви побачите результати вимірювань индикатрис розсіювання оптичних середовищ ока, проведені при постійному значенні інтенсивності падаючого світла.
Виміри проведені при горизонтальній і вертикальної орієнтації поляризації падаючого світла. Відповідні результати для прозорого і мутного кришталиків, а також для склоподібного тіла представлені на рис. 2.5. Видно, що індикатриси різних середовищ мало відрізняються один від одного, проте слід враховувати, що кожна з них нормована до одиниці при куті розсіювання, що дорівнює 90 °. Таким чином, представлені індикатриси не дозволяють порівняти значення інтенсивності розсіяного в даному напрямку світла кожної з середовищ і ці криві характеризують тільки відносне кутовий розподіл інтенсивності розсіяного випромінювання.

Мал. 2.5. Індикатриси розсіяння нормального кришталика (я),
Як катарактального кришталика (б), склоподібного тіла (в): 1 - вертикальна поляризація, 2 - горизонтальна поляризація
прикладу абсолютних відмінностей можна відзначити, що значення інтенсивності світла, розсіяного прозорим і каламутним кришталиками під кутом 90 °, відносяться як 1: 5.
Як показують розрахунки [21], ефекти несферичності форми реальних розсіювачів проявляються незначно. Слід також зауважити, що для прозорого кришталика в області кутів розсіювання, менших 30 °, спостерігаються відмінності експериментальних значень від розрахункових. Ці відмінності викликані, очевидно, інтерференційними явищами, що виникають унаслідок високої концентрації розсіюють частинок, оскільки, як показано в [40], висока концентрація частинок призводить до виникнення упорядкованості в їх розташуванні і до появи інтерференції хвиль, розсіяних окремими частинками. Згідно з результатами розрахунків [41] і експериментів з модельними середовищами [42], інтерференція світла, розсіяного в середовищі з високою концентрацією розсіюють частинок, призводить до зменшення повної енергії розсіяного випромінювання і збільшення коефіцієнта направленого пропускання світла. Саме це має місце в разі нормального кришталика і обумовлює його високу прозорість.
Розвиток помутнінь кришталика обумовлене утворенням розсіюють частинок, розміри яких змінюються в широких межах. Тому, навіть при відносно щільною упаковці, впорядковане розташування розсіюють частинок мутного кришталика неможливо. Це підтверджується відсутністю осциляцій на індикатриси розсіяння мутного кришталика на відміну від прозорого. Невпорядковане розташування частинок мутного кришталика призводить до збільшення енергії розсіяного випромінювання. Крім того, що розсіюють частинки мутного кришталика мають більші розміри, що збільшує асиметрію індикатриси розсіяння, т. Е. Зростає частка інтенсивності випромінювання, розсіяного під кутом, меншим 90 °.
Згладжений характер індикатриси склоподібного тіла, показаної на рис. 2.5, свідчить про відсутність інтерференційних ефектів в даному середовищі. Це пов`язано, ймовірно, з тим, що щільність основних розсіювачів склоподібного тіла значно нижче щільності розсіюють частинок прозорого хрусталіка- відстань між розсіюючими центрами в цьому випадку значно перевершує їх діаметр, тому впорядкованість в їх розташуванні не спостерігається. Загальний вигляд кутовий залежності індикатриси аналогічний Індикатриса прозорого кришталика, однак теоретично він моделюється м`якшими частками (що підтверджується даними біохімічних досліджень 139]).
Розглянемо модель кришталика з сферичних частинок і проаналізуємо, яку інформацію про будову об`єкта можна отримати на її основі. Будемо вважати, чго елемент обсягу кришталика висвітлюється паралельним світловим пучком, багатократне розсіяння відсутня. Очевидно, складність будови кришталика, як і будь-який біологічної тканини, обумовлює наявність сукупності розсіюють частинок, що розрізняються як розмірами, так і оптичними константами. Значення елементів МРС систем полідисперсних частинок визначаються відповідними сумами, причому кожний доданок входить з певним ваговим мно
жителем, що залежать від концентрації частинок в кожному діапазоні розмірів і оптичних констант. Тканини кришталика не виявляється піків поглинання у видимій області [П. 23], тому оптичні характеристики розсіюють частинок кришталика визначаються в основному дійсною частиною відносного показника заломлення т.
Чисельний розрахунок значень відповідних елементів МРС може бути проведений відповідно до [43] - в результаті отримаємо
(2.9)
Рівняння (2.9) є лінійним інтегральним рівнянням Фредгольма першого роду. Функція f (a, т) - функція концентрації частинок в одиниці об`єму при одиничному збільшенні радіуса а й показника заломлення т, ат1Л і Атаху - граничні радіуси розсіюють частинок, ттИ і ттач - граничні значення відносного показника заломлення. Ядро цього рівняння Мц (В, а, т) являє собою елемент МРС для окремої частки радіуса а.
Розмір частинок досліджуваних тканин ока порівняємо з довжиною хвилі у видимій області, тому використання різних спрощують припущень при розрахунку розсіювання на окремої частинки призводить до великих погрішностей і суворе рішення повинно проводитися в рамках теорії Мі. Завдання діагностики параметрів досліджуваної тканини полягає у визначенні виду функції f a, т). У такій повній постановці звернення рівняння (2.9) викликає великі труднощі. Використання додаткових умов і обмежень, отриманих на основі інших методів досліджень, дозволяє спростити рішення оберненої задачі.
В якості таких додаткових умов можна використовувати оцінки розмірів частинок, отримані за допомогою електронної мікроскопії та інших методів [44]. Результати біохімічних досліджень свідчать, що діапазон зміни відносного показника заломлення білків досить вузький. З метою спрощення задачі обмежимо вид функції / (о, т) гамма-розподілом за розмірами при кожному фіксованому значенні т:

(2.10)

де а0 - найбільш ймовірний радіус частинки, параметр ц визначається зі співвідношення Дя / а0 = 2,35 / К ц, А а - підлозі, ширина f (a, т) [1.4]. Такий вид розподілу набув широкого поширення при описі властивостей розсіюють частинок органічного походження [45]. Суттєвою особливістю гамма-розподілу є його несиметричний вигляд, що дозволяє врахувати внесок не тільки від окремих частинок, а й від більш великих конгломератів цих частинок, що утворюються в біологічних середовищах. Частинки прозорого кришталика мають дуже вузький розподіл за розмірами, яке доцільно моделювати нормальним розподілом [21].
Дізнатися про обмеження вид функції f (a, т), дозволяють визначити значення параметрів гамма-розподілу ft, а 0 і значення відносного показника заломлення т. Основний фракції розсіюють частинок. Для цього розраховується набір индикатрис елементів МРС модельних систем і визначаються значення параметрів | л, а 0 і т, при яких розрахункові криві найкращим чином збігаються з експериментально отриманими Індикатриса елементів МРС реального об`єкта. Моделюючи розсіюють центри кришталика системою сферичний, можна використовувати для аналізу тільки індикатриси елементів М12 (М21), М33 (Мм) і М34 (М43). Значення інших елементів МРС обумовлені несферичністю розсіюють частинок.
Чисельні розрахунки проводилися в рамках теорії Мі, за алгоритмом, запропонованим в [17]. Як показують результати розрахунків [21], експериментальні індикатриси елементів МРС прозорого кришталика досить добре відповідають кривим, отриманим в припущенні нормального розподілу розсіюють частинок, виду [1, 17]:

(2.11)
при / тг = 1,03, ат = 250 нм і про&bdquo- = 20 нм. Ці значення слід вважати наближеною оцінкою найбільш ймовірного радіусу розсіюють частинок кришталика, і, крім того, вони підтверджують, що розподіл за розмірами має невелику ширину, так що в першому наближенні розсіюють частинки прозорого кришталика можна вважати однорідними за розміром. Для мутного кришталика найкращої відповідності розрахункових і експериментальних кривих вдається досягти за умови, що f (a, т) описується виразом (2.10) з наступними параметрами: ц. = 20, а 0 = = 1700 нм. Відносний показник заломлення в даному випадку дорівнює 1,07.
Слід зауважити, що при наявності значних помутнінь криву f (a, т) можна вважати одновершінной, так як відносне значення вкладу великих часток в інтенсивність розсіяного випромінювання значно перевищує внесок фракції з розмірами близько 600 нм. Використання при розрахунках двухвершінной кривої потрібно тільки в тих випадках, коли загальна втрата прозорості не перевищує 20%.
Зазначені вище параметри розсіюють частинок відповідають двом граничним випадкам: прозорого і мутного кришталика. Простежити деталі помутніння в рамках зазначеної моделі не представляється можливим, так як ці деталі затушовуються ефектами несферичності. Проте проведені оцінки дозволяють зробити певні висновки.
На ранніх стадіях помутніння експериментальні характеристики задовільно моделюються системами сферичний з постійним відносним показником заломлення. Функція розподілу за розмірами в даному випадку є двухвершінние

Мал. 2.6. Криві розподілу за розмірами сферичних частинок, що моделюють поляризаційні характеристики кришталиків ока кролика з різним ступенем помутніння (номер кривої відповідає терміну нафталіновою затравки в добі)
криву, причому положення першої вершини залишається незмінним і відповідає 250 нм, а положення другої вершини зміщується в межах від 700 до 1300 нм в міру зменшення прозорості. Одночасно з цим спостерігається збільшення відносної частки крупнодісперсной фракції.
При інтерпретації експериментальних результатів, отриманих для пізніх стадій помутніння, необхідно враховувати поступове збільшення відносного показника заломлення від 1,03 до 1,07. Внесок в характеристики розсіювання дрібнодисперсного фракції стає дуже незначним і при розрахунках його можна не враховувати. Найбільш ймовірний радіус частинок крупнодісперсной фракції збільшується до 1700 ім.
На рис. 2.6 показані криві розподілу за розмірами частинок крупнодісперсной фракції, знайдені підбором параметрів системи сферичних розсіювачів таким чином, щоб розраховані поляризаційні характеристики повною мірою відповідали б експериментальним результатам, отриманим для кришталиків очей кроликів з різними термінами нафталіновою затравки. З малюнка видно, що на ранніх (1, 2) і середніх (3) стадіях процесу помутнінь змін зазнають як положення максимуму кривої розподілу, так і ширина розподілу часток за розмірами. Зміна поляризаційних характеристик на пізніх стадіях розвитку процесу помутніння стає менш вираженим. На підставі цього можна зробити висновок, що в даному випадку зростання інтенсивності розсіювання обумовлений збільшенням числа розсіюють частинок великої фракції при слабо мінливих характеристиках розподілу.
Дослідження формених елементів крові. Методи поляризаційної нефелометрії використовуються і для дослідження формених елементів крові (ФЕК) -ерітроцітов, лейкоцитів і тромбоцитів. Нормальний еритроцит в плазмі має форму двояковогнутого диска діаметром 7,1 мкм, товщиною в центрі 0,9-1,2 мкм і по краю - 1,7- 2,4 мкм. Дійсна частина показника заломлення щодо плазми т-1,041-1,067 (Л. = 600 нм) [2], уявна частина показника заломлення змінюється в межах 10-2-10-5 (А = 350-1000 нм) 11]. Лейкоцити мають форму сфер діаметрами 8-22 мкм [40], а тромбоцити - тонких дисків діаметрами 2-4 мкм. Оптичні параметри тромбоцитів і лейкоцитів мало вивчені, проте їх відносять до слабопоглощающім м`яким часткам (для областей довжин хвиль, великих 600 нм).
З представлених в [46] результатів вимірювань индикатрис МРС нормальних і сферулірованних еритроцитів видно, що максимальні відмінності між розсіюючими характеристиками двох форм для компонента Mi2 досягають 0,12, для M2i - 0,17, М33- 0,20. Таким чином, вивчення МРС дозволяє простежити вплив деформації розсіюють частинок (особливо це справедливо в області кутів розсіювання, великих 90 °).
В роботі [47] на підставі дослідження кутової структури ненульових компонентів МРС описана методика визначення дійсної частини показника заломлення ФЕК. Відзначається, що описана методика придатна як для гамма-, так і нормального розподілів частинок полідисперсних середовищ, причому не потрібні дані про концентрацію частинок, а необхідним є лише дотримання умови одноразового розсіювання. Методика визначення дійсної частини показника заломлення т зводиться до визначення кута розсіювання, при якому елемент МРС в діапазоні 80-120 ° дорівнює нулю, п далі по номограммам, наведеними в [47], визначається показник заломлення т (якщо т лежить в діапазоні 1,02 -1,07). Якщо ж елемент не дорівнює нулю в діапазоні кутів 80-120 °, то, значить, • лgt; 1,07, і необхідно визначити кут розсіювання, при якому компонент М3, також дорівнює нулю.
Слід зауважити, що проведена апробація розробленої методики на тканинах ока, показала її перспективність і високу чутливість для експресного визначення дійсної частини відносного показника заломлення розсіюючих частинок катарактального і нормального кришталиків ока.