Області застосування калориметричних методів - лазерна діагностика в біології та медицині
5.6. Області застосування калориметричних методів
Загальні відомості. Висока чутливість, можливість отримання значного дозволу при використанні лазерів в якості джерел випромінювання, локальність аналізу, застосовність для дослідження речовин в різних агрегатних станах і в малих обсягах, простота обробки результатів і можливість автоматизації роблять ОА метод і інші калориметричні методи дослідження унікальними з точки зору діапазону їх застосувань в біології та медицині. Вони застосовуються: при газовому аналізі, необхідному для контролю процесів дихання і харчування тваринного світу, мікроорганізмів і рослин-аналізі забруднень атмосфери та гідросфери, необхідному для санітарного контролю навколишнього середовища-аналізі лікарських препаратів і біологічних середовищ у вигляді порошків і тонких плівок- контролі фотохімічних і біохімічних реакцій- вивченні фотохромних біологічних середовищ вивченні ефективності фотосинтезу з метою ранньої діагностики врожайності сільськогосподарських культур-в лабораторної медичної діагностіке- оптико-акустичної мікроскопіі- в офтальмології та дерматології.
Газовий аналіз. Виділення різноманітних газів в процесі життєдіяльності людини, мікроорганізмів і рослин є найважливішим показником характеру протікання відповідних біохімічних реакцій. Тому контроль складу та концентрації газів, що виділяються представляє важливу задачу в біохімічних дослідженнях, а також у діагностиці деяких захворювань. Завдання газового аналізу зводиться до аналізу багатокомпонентної суміші газів, що мають, як правило, малі коефіцієнту поглинання у видимій та ближній ІЧ областях спектру. Застосування методу абсорбційної спектроскопії в даному випадку вимагає довжини стовпа газу в кілька десятків і сотень метрів, що в біологічному експерименті забезпечити важко. Потрібно також високу спектральний дозвіл для поділу вкладу окремих компонентів в спектри поглинання.
Ці проблеми виключаються при використанні ОА методу, в якому в якості джерел світла застосовують перебудовувані лазери. В ІК області спектри поглинання парів води, окису азоту, метану реєструються за допомогою, дискретно перебудовуються DF (3,5-4 мкм) і С02 (9,1-3 мкм) лазерів. При дослідженні багатоатомних молекул видима область спектра цікава з точки зору визначення їх концентрації в багатокомпонентної суміші. Вона формується за рахунок коливальних обертонів високого порядку, і тому інтенсивність поглинання надзвичайно мала. Методом внутрірезонаторними ОА спектроскопії, що забезпечує часткове дозвіл обертальної структури смуг коливального поглинання (1 см-1), при використанні лазерів на барвниках вдається отримати найбільш повні спектри обертонного коливального поглинання (аж до 7-9 порядків) таких багатоатомних молекул, як НС1, невеликих органічних молекул типу C0H (i, модифікацій метанолу СН3ОН, CH3OD і SiHD3 в газовій фазі.
Показана можливість дослідження парів азулена за допомогою ОА кювети, яка показана на рис. 5.66, з високою точністю, яка визначається шириною лінії генерації імпульсного лазера на барвниках з ламповим накачуванням, і високою чутливістю, що дозволяє реєструвати ОА спектри навіть при кімнатній температурі при довжині шляху поглинання всього 1 мм. Раніше для отримання спектра поглинання азулена в паровій фазі з тієї ж чутливістю і меншим дозволом була потрібна довжина шляху поглинання, що дорівнює 4 м.
В ОА спектроскопії існують і інші підходи до вирішення завдання газового аналізу. Наприклад, перспективним є поєднання Про А методу і методу газової хроматографії, що забезпечує попереднє поділ компонентів досліджуваної суміші на окремі фракції. Висока ефективність ОА детектування в газовій хроматографії продемонстрована на прикладах селективного аналізу ізомерів бутилового спирту і ксилолов, визначення вмісту транс-ізомерів жирних кислот в зразках харчових жирів, детектування гербіцидів і ін. [П. 42].
В іншому підході використовуються специфічні особливості ОА методу, які полягають у зміні ОА сигналу в залежності від параметрів буферних газів (непоглощающіх газів): їх молекулярного ваги, ізотопного складу, теплоємності, теплопровідності і в`язкості. Зазвичай для цих цілей застосовують резонансні спектрофони, для яких властивості буферних газів виявляються в зміщенні резонансної частоти, обумовленому зміною швидкості звуку в суміші, і зміні добротності акустичного резонатора за рахунок різних механізмів загасання в буферних газах.
Аналіз забруднень атмосфери і микропримесей в рідинах. При аналізі забруднень атмосфери в повній мірі реалізуються такі гідності ОА методу, як висока чутливість і надзвичайно широкий динамічний діапазон. Для газів, присутніх в атмосфері, динамічний діапазон становить 10-7-10-1 при довжині кювети 10 см. Нижня межа визначається чутливістю спектрофона, а верхній - процесами насичення. Такий динамічний діапазон дозволяє за допомогою одного і того ж пристрою реєструвати як сліди речовин, що забруднюють атмосферу (малі рівні), так і джерела забруднення (великі рівні).
Оскільки ОА метод дозволяє реєструвати забруднення в обмеженому обсязі (локально) і в реальному масштабі часу, то забезпечується можливість аналізу динаміки надходження і догляду домішок в досліджуваному обсязі. Наприклад, многоволновой газоаналізатор на основі внутрірезонаторними ОА спектроскопії з використанням СО, С02 і Нє - Ne (А. = 3,39 мкм) лазерів і модуляцією довжини хвилі (для усунення фонових сигналів) має межі виявлення домішок індустріальних забруднень атмосфери (NO, N02, NH3, С2Н4, 2jCnH2&bdquo- + 2) в межах 0,1-103 ppb, динамічний діапазон 10 * -105 [11]. За допомогою компактного волноводного СОГ лазера з поперечної ВЧ накачуванням можна забезпечити діагностику забруднень від гідразівного палива і токсичних промислових речовин на рівні 1-100 ppb [П. 46].
Відсутність плавно перебудовуються лазерів з достатньою вихідною потужністю в ІК області спектра (2-15 мкм) дещо стримує широке впровадження в практику ОА методу аналізу забруднень атмосфери. У зв`язку з цим перспективними вважаються методи нелінійної фотоакустичної спектроскопії. Цими методами визначені пороги виявлення газів: СН4, С02, N02 і С2Н3С13 в атмосфере- вони знаходяться в межах 1-10ррш.
Застосування ОА методу перспективно також і для визначення мікродомішок в рідинах. Використовуються лазери як безперервного, так і імпульсної дії. При роботі двухволнового Аг лазера і рідинної комірки (типу представленої на рис. 5.6в) вдалося зареєструвати сліди Р-каротину в хлороформі на рівні 12 ppt (0,08 нг / мл). Аналогічна осередок і Аг лазер (514,5 нм) потужністю 0,5 Вт використовувалися для детектування малих концентрацій на рівні 14 ppt (0,02 нг / мл) Cd в пеніцилін після його екстракції в хлороформ, а також для аналізу малих концентрацій канцерогенних харчових барвників у воді, 2,75-10-8моль / л (0,7 ppb). Межа виявлення вітаміну А в екстрактах з крові при використанні імпульсного азотного лазера (337,1 нм) становить близько 1 ppt (2 пг / мл).
Імпульсний метод в принципі має більш високу чутливість. Однак, щоб її реалізувати, необхідний спеціальний розчинник. Вода виявляється не кращим розчинником, оскільки досить значно поглинає світло навіть у видимому діапазоні довжин хвиль. Імпульсні азотні лазери, а також лазери на барвниках, успішно застосовуються для визначення малих концентрацій різних порфіринів, барвників, лікарських препаратів, включаючи наркотики і вітаміни, на рівні 0,09- 1 ppb. Як розчинники використовується вода, етанол, гексан, СС14 і ін., А в якості детекторів - найбільш прості кювети (рис. 5.6г) або акустичний зонд (рис. 5.6д). Результати вимірювань у вигляді граничних концентрацій аналізованих речовин представлені в табл. 5.2 (див. [П. 23]).
За допомогою ОА осередки, зображеної на рис. 5.6г, вдається забезпечити гранично обнаружіми концентрації іонів актиноїдів у водних розчинах на рівні 8-10-7- 7 • 10-8 моль / л. Це завдання виникає у зв`язку з проблемою захоронення ядерних відходів.
Високоефективна колончатая рідинна хроматографія в поєднанні з лазерною ОА спектроскопией дозволяє отримувати чутливість на рівні 1 ppt при виявленні вітаміну А в біозразків [П. 42].
Аналіз аерозолів, митних і колоїдних розчинів. ОА діагностика аерозолів, митних і колоїдних розчинів важлива для якісного і кількісного аналізів забруднень атмосфери та гідросфери мікрочастинками природного і промислового походження, для контролю за ходом різноманітних біохімічних реакцій, оскільки в порівнянні з традиційно використовуваним для цих цілей абсорбційним методом вона дає можливість визначати малі концентрації мікрочастинок , забезпечує локальність вимірювань і високу точність за рахунок малого впливу ефектів светорассеяния [П. 41, П. 43].
Таблиця 5.2
Граничні концентрації різних барвників, лікарських препаратів і вітамінів, що реєструються ОА методом за допомогою імпульсного N2 лазера (337,1 нм) при температурі 298 К
речовина | розчинник | чутливість, |
Бактеріохлорофіл-а | етанол | 1,0 |
білірубін | » | 20 |
Бнлівердін | вода | 0,9 |
Хлорофіл-а | етанол Відео: Біоуправління: Визначення та застосування технології "биоуправление" | 0,9 |
Хлорофіл-6 | » | 0,3 |
Хлорофіл (водний золь) | вода | 5,0 |
хлорофілін | » | 3,0 |
Копропорфірін III тетроетіл ефір | етанол | 2,0 |
кумарин 120 | » | 1,0 |
цитохром С | вода | 30 Відео: Після 15-річної перерви в клініках СібГМУ відновили операції з пересадки рогівки ока |
еозин | » | 4,0 |
флуоресцеїн двонатрієва | » | 3,0 |
гематин | » | 1,0 |
Гематопорфірин | етанол | 0,3 |
гемоглобін | вода | 70 |
Мезопорфірін IX диметиловий ефір | етанол | 0,5 |
оксазін перхлорат | » | 3,0 |
Протопорфирин IX диметиловий ефір | 0,09 | |
протопорфирин двонатрієва | вода | 1,0 |
Родамін-БЖ | » | 2,0 |
рибофлавін | » | 10 |
Тетрафенілпорфін | будь-який | 6,0 |
Уропорфірін I етиловий ефір Вітамін В12 Відео: ПБК: Відкрили єдину в Балтії лабораторію з вирощування стовбурових клітин | етанол | 2,0 |
Аналіз атмосферних аерозолів ОА методом можна проводити безпосередньо в газовому потоці або з попередньою їх концентрацією на спеціальних фільтрах. Як джерела випромінювання використовують С02, Аг, Ні - Ne, AHr: Nd і HF лазери, а також лазери на барвниках. Застосовують резонансні і нерезонансні спектрофони, диференціальні схеми з двома спектрофонамі, калібрування здійснюють по еталонному молекулярному поглинання в газі. Досліджувалися аерозолі у вигляді атмосферної, азбестового і кварцового пилу, ацетиленових, дизельних і сигаретних димів, вихлопів автомобільних двигунів. Характерні розміри частинок 0,15-3 мкм, поріг виявлення складає 10-у г / м8 на = 514,5 нм (ацетиленові та дизельні дими).
Аналіз колоїдних розчинів на прикладі кількісного визначення часток BaS04 в воді показує значний динамічний діапазон ОА методу (майже три порядки величини) і його високу чутливість 5 нг / мл (30 ppb). Застосування ОА зонда, подібного до представленого на рис. 5.65, при імпульсному її порушенні випромінюванням лазера на барвниках дозволяє вивчати седиментацію частинок молекулярних або макроскопічних розмірів в гравітаційному полі або в центрифузі. Наприклад, при дослідженні седиментации гумінових кислот вдається визначати динаміку осадження частинок різних розмірів (0,08- 0,5 мкм) [12]. За допомогою спектрофона, зображеного на рис. 5.7в, можна реєструвати окремі частинки пилу в надчистих розчинниках.
Аналіз лікарських препаратів і біологічних середовищ у вигляді порошків і тонких плівок. Основні переваги ОА методу - висока чутливість і можливість роботи в умовах значного розсіювання світла - реалізуються при вивченні поглинання світла в середовищах в вигляді порошків твердих тіл і тонких плівок рідин. Найбільш чутливі з розглянутих вище методів реєстрації ОА сигналу дозволяють вимірювати поглинання світла на рівні 10-8-10 ~ отже, для речовин з коефіцієнтом поглинання порядкаада10 `* - 102см-1 можна реєструвати молекулярний моношар поглинає речовини (l = 10-8 см) .
Для аналізу порошків необхідний ретельний вибір технічних умов експерименту, що сприяють усуненню впливу розсіяного випромінювання. Бажано, щоб досліджуваний зразок був оптично досить тонким і не поглинав весь падаючий на нього світло, в іншому випадку з`являється невизначеність в характері залежності інтенсивності світла від глибини його проникнення в зразок, обумовлена як ефектом сильного розсіювання (збільшення інтенсивності в верхніх шарах зразка), так і ефектом насичення і впливом частоти модуляції.
Зазначені недоліки усуваються при використанні ОА детектора (рис. 5.6е), що допускає розміщення порошку у вигляді тонкого шару завтовшки кілька мікрометрів між двома кварцовими пластинами. Для зменшення розсіювання порошок попередньо розмішують в краплі в`язкої рідини, що має показник заломлення, близький до показника заломлення речовини порошку, маса освітлюється порошку менше 0,1 мкг.
Фазовий метод в поєднанні з рідинної осередком відкритого типу дозволяє роздільно вимірювати об`ємне і поверхневе поглинання в рідинах на кордоні з поверхнею твердого тіла. Зокрема, вивчати кінетику процесів абсорбції та десорбції молекул на поверхні, а також дослідити характер протікання фотохімічних реакцій, якщо вони супроводжуються зміною поглинання рідини твердим тілом (підкладкою). Така можливість була продемонстрована на прикладі молекул S-2160 (трипептид), використовуваних при вимірах ферментативної активності речовин (див. [П. 23]).
ОА метод використовується для отримання ІК спектрів поглинання фармацевтичних таблеток, в тому числі аспірину різного виробництва. Так само як і спектри дифузного відбиття, ОА спектри в ближній ІЧ області застосовуються для визначення вмісту білка, жиру і вологи в насінні соняшнику і соєвих бобах. За допомогою газомікрофонной осередки, Аг і Кг лазерів, що працюють на лініях з = 457,9- 488,0- 514,5 і 647,1 нм, вдалося надійно визначити домішки різних речовин в кавовому порошку: подрібненого обпаленої пергаменту (13,8 %), ячменю (16,6%) і кукурудзи (15,1%) [13].
Перспективно застосування ОА методу в тонкошарової хроматографії [П. 41, П. 43]. Для виключення фонових сигналів від хроматографічної пластини зазвичай використовується одночасне опромінення на двох довжинах хвиль. Виявляється можливим забезпечити вимірювання кількісного складу розділених речовин in situ *). Чутливість аналізу в значній мірі визначається матеріалом підкладки (алюміній, скло, кремній) і становить 3-100 нг. Така методика корисна, наприклад, для контролю якості харчових продуктів, зокрема для визначення вмісту синтетичних барвників в кондитерських виробах. Поєднання просторового (по поверхні хроматографічної пластинки) і спектрального (при використанні лазерів на барвниках) сканування дозволяє здійснювати двовимірний ОА аналіз індивідуальних з`єднань при їх неповному поділі [П. 41 - П. 43].
* У природних умовах (лат.).
Цікаво застосування ОА методу для кількісного визначення концентрації глюкози в розчині крові за допомогою спеціальної багатошарової пофарбованої плівки товщиною 400 мкм. Діапазон вимірювань методу 0-2 г / л виявляється достатнім для швидкого і точного діагнозу діабету [14].
Мал. 5.8. ОА спектр интактного зеленого листа [П. 44]
Вивчення структури листя рослин і ефективності фотосинтезу. Вивчення структури листя рослин є одним з найбільш наочних застосувань ОА методу в біологічних дослідженнях. На ОА спектрі зеленого листа (рис. 5.8) чітко видно всі характеристичні смуги поглинання хлоропластів, присутніх в тканини аркуша: смуга Сорі поблизу 420 нм, смуга поглинання каротиноїдів в області 450- 550 нм і смуга, що належить хлорофілу, між 600 і 700 нм. В УФ діапазоні знаходиться смуга поглинання воскообразного шару листа. Застосування фазового ОА методу і зміна частоти модуляції дозволяють здійснювати зондування листя рослин, визначаючи тим самим глибину залягання окремих хромофоров [П. 46].
У інтактних листі під дією модульованого світла відбувається виділення кисню, що змінює характер реєстрованого сигналу. Додаткова фонова засвічення інтенсивним немодульованим білим або червоним світлом може привести до насичення процесів фотосинтезу і також змінити ОА сигнал. Ці явища використовуються для визначення квантового виходу виділення кисню і запасеної фотохімічної енергії, дослідження фотосинтезирующих хроматичних переходів і ефектів посилення Емерсона (збільшення виділення 02 і гасіння флуоресценції) в інтактних листі, виявлення складних перехідних процесів, що залежать від режиму освітлення листа.
Наприклад, визначення квантового виходу виділення кисню листям квасолі за допомогою ОА техніки може служити в якості експрес-методу відбору генотипів квасолі за ознакою їх теплостійкості [22].
Процеси фотосинтезу досліджуються ОА методом не тільки в листі або виділених з них хлоропластних препаратах, а й у водоростях. Зокрема, для зелених водоростей Briopsis maxima виявлено, що внесок кисню, що виділяється під дією модульованого світла, в ОА сигнал незначний. Це обумовлено структурою водоростей.
Метод ОА спектроскопії застосовується також для аналізу змісту вільного хлорофілу в листках капусти, підданих впливу солей металу. Взаємодія хлорофілу з іонами металів контролюють по піку поблизу = 685 нм, активність взаємодії падає в ряду Сі, Pb, Ni, Cd. За допомогою ОА аналізу листя можна визначати ступінь їх токсикації металами. За допомогою випромінювання Кг лазера ( = 647 нм) з псевдослучайной послідовністю імпульсів вдається вивчати динаміку впливу гербіцидів на хлоропласти листя салату [П. 46].
В ферментативних реакціях окислення в живих клітинах бере участь складна органічна сполука НАДН (відновлений нікотинамід-деніндінуклеотід). ОА спектроскопія НАДН є дуже чутливим методом як для звичайних біохімічних аналізів, так і для дослідження складних процесів за участю НАДН (діапазон концентрацій НАДН: 5-10-7-100-5 моль / л, джерело світла - імпульсний азотний лазер, ОА осередок з п`єзоелектричним гідрофоном).
Можна використовувати ОА метод для прогнозування врожайності сільськогосподарських культур. Спектри поглинання листя для цього знімаються в діапазоні поглинання хлорофілу. Їх можна використовувати для пошуку зразка з найбільшою фотохімічної активністю (менший ОА сигнал) в наборі подібних зразків. Рослина, яке має велику фотохимическую активність, в тому числі і на ранніх стадіях росту, здатне дати більший урожай.
Дослідження бактерій, клітин, мікроорганізмів [П. 23, П. 44 - П. 46]. Метод ОА спектроскопії застосовують для дослідження синьо-зелених водоростей. Мікробіологи відносять їх до бактерій і називають ціанобактеріями. В спектрі водної суспензії синьо-зелених бактерій Synechococcus Sp проявляються смуги поглинання хлорофілу (Х «660 нм), фикоцианина ( = 615 нм), смуга Сорі (близько = 420 нм) і протеїнів ( = 280 нм). Об`єктом вивчення були також обложені на нітроцелюлозні фільтри ціанобактерії Anacystis nidulans. Порівняння фотосинтезуючої ефективності пігментів показує, що вона зменшується в ряді: фикоцианин, хлорофіл, каротиноїди.
Є можливість виявлення бактерій і визначення різних станів в їх розвитку. Так в спектрі Bacillus subtilis спостерігається сильно поглинає область близько А, = 410 нм, коли бактерії існують у вигляді спор, і вона відсутня, коли бактерії знаходяться у вегетативному стані. У спеціальних клітках, виділених з ціанобактерій Anabaema 7120, ОА методом вивчені: циклічний транспорт електрона в фотосистемі I, фіксація азоту та дихання.
ОА метод дозволяє вивчати вплив медикаментів на мікроорганізми, наприклад дію антімалярнйного препарату на ліофільні клітини малярійних паразитів. Метод не вимагає спеціальної підготовки таких зразків і дозволяє проводити дослідження in vivo. Ще одне успішне застосування ОА спектроскопії - це дослідження фотоциклу бактериородопсина. Матеріалом для вивчення служать суспензії пурпурних мембран Halobacterium Halo- bium. Дослідження можливі в широкому інтервалі температур (90-300 К). За допомогою частотної залежності амплітуди ОА сигналу можна розрізняти моделі енергетики фотоциклу бактериородопсина.
Ці дослідження з бактеріородопсин можна проводити і методом температурного стрибка, який полягає в швидкому імпульсному лазерному розігріві водних суспензій і розчинів біооб`єктів і спостереженні кінетики фотохімічних процесів [15]. Найкращим чином для цих цілей підходить випромінювання АІГ: Ег лазера з А, = 2,94 мкм, що потрапляє в смугу поглинання води (а «« 104 см-1). Тривалості імпульсів лежать в пико- і наносекундному діапазонах, розігрів біооб`єкту становить від кількох до десятків градусів, товщина розігрівається шару від декількох до десятків мікрометрів.
Дослідження крові. Абсорбційної-трансмісійна спектроскопія при дослідженні крові не дає задовільних результатів через светорассеяния, обумовленого наявністю в плазмі ліпідних матеріалів і червоних кров`яних клітин. Такі дослідження можливі лише при значному ускладненні методики вимірювань, що враховує ефекти розсіювання. В ОА спектроскопії розсіювання світла не грає вирішальної ролі. Дослідження цільної крові, в тому числі і з додаванням токсичних речовин, ОА методом дозволяє вивчати процес осадження та судити про хімічних реакціях в зразках [16]. Як джерело світла використовувалися Аг лазер (потужністю 30-300 мВт) або ксенонова лампа (300 Вт). ОА осередок мала сапфірове вікно, через яке здійснювалося освітлення і яке служило звукопровода. На одній кромці цього вікна монтувався п`єзоелектричний кристал.
В ОА спектрі крові легко реєструються зміни, викликані різним ступенем насичення її киснем | П. 44, 16]. За допомогою ОА спектроскопії цільної крові і виділених з неї еритроцитів показана можливість діагностики лейкемії та ряду серцево-судинних захворювань (рис. 5.9) [17].
У природних умовах (лат.).
Аналіз биотканей, визначення вологості [П. 23, П. 41, П. 44 - П. 46]. Перші дослідження в дерматології ОА методом були виконані в основному на вирізаних епідермічний зразках тканин людини і тварин. У цих дослідженнях була виявлена смуга поглинання протеїнів в області 280-290 нм, а також отримана
Мал. 5.9. ОА спектри цільної крові здорової людини (/) і хворих на лейкемію (2, 3)
залежність амплітуди ОА сигналу від вмісту води в зразку. Цікаві експерименти з виявлення медикаментів в тканинах, вивчення їх дії на шкіру, визначенню швидкості їх дифузії.
Вдалося зафіксувати зміни гідратації тонкого рогового шару (9-13 мкм). Зміни гідратації рогового шару змінюють характер УФ поглинання проби за рахунок зміни його теплових властивостей. Для визначення вологості можна обмежитися тільки однієї довжиною хвилі наприклад в максимумі поглинання (Х = 280 нм), оскільки збільшення вологості призводить до зниження амплітуди ОА сигналу у всьому спектрі.
Інший підхід до визначення водного змісту в тканинах пов`язаний з використанням спектра поглинання води в ближній ІЧ області. Методика визначення вологості твердих матеріалів апробована на прикладі синтетичного протеїну, паперу, порошку молочного сурогату. За допомогою ОА спектрометра виявляється можливим визначати наявність вільної води, пов`язаної або те й інше при вимірюванні поглинання на &lsquo-к = 1,9- 2,2 або 1,4 мкм. Ця методика визначення вологості відрізняється швидкістю проведення аналізу, нечутливістю до змін в масі зразка і в розмірах частинок.
Головні труднощі шкірних ОА вимірювань in vivo - чутливість мікрофона до рухів тіла (м`язова активність, потік крові, нервові імпульси). Для подолання цих труднощів розроблений спектрометр з диференціальної ОА осередком з відкритим кінцем для вимірювання in situ (рис. 5.6з). Світло на зразок надходить по световоду, тому можна прикріплювати осередок до досліджуваного зразка в будь-якому зручному місці. Отримано ОА спектри шкіри черевної порожнини щура, шкіри передпліччя добровольця, обробленої мерброміном. Ці експерименти показали, що ОА сигнали можуть бути зареєстровані з задовільним ставленням сигнал / шум. вимірювання глибини
Мал. 5.10. ОА спектри нормального (1) і ураженого катарактою (2) кришталиків [П. 44]
проникнення світлозахисних лікарських препаратів в шкіру людини in vivo і in situ можна здійснити за допомогою резонансного спектрофона відкритого типу (рис. 5.6а) шляхом зміни частоти модуляції світла в широких межах 0,18-1,2 кГц [П. 46].
ОА спектроскопія може бути особливо корисною в офтальмології. За допомогою ОА методики можна отримати спектр поглинання кришталика, не руйнуючи його (рис. 5.10). Максимум поглинання при = 280 нм обумовлений поглинанням тирозину і триптофану. Кришталик, вражений
катарактою, має більш сильне поглинання не тільки в області 280 нм, але і у видимій та ІЧ областях спектру. Однак це поглинання не визначає прозорість кришталика, яка у видимій області залежить головним чином від светорассеивающих властивостей кришталика, ураженого катарактою (гл. 2).
Імпульсна ОА спектроскопія з великим тимчасовим дозволом (близько 4 ні) на трьох довжинах хвиль (ексимерні лазери: KrF (31 = 248 нм) і ХеС1 ( = 308 нм), друга гармоніка АІГ: Nd лазера (А, = 532 нм)) дозволяють ефективно досліджувати оптичні, теплофізичні і акустичні властивості нормальної і перероджень тканини аорти людини, визначати поріг руйнування тканини по енергії і тимчасової експозиції [1.26,9]. Ці дослідження важливі для реалізації методів лазерної ангіопластики, а також виявлення механізмів абляції биотканей під дією імпульсного УФ випромінювання [23]. Так, в [23] на прикладі вивчення тонких (близько 30 мкм) зрізів рогівки очей кролика при опроміненні випромінюванням ArF лазера (Л. = 193 нм) визначена тривалість процесу абляції (близько 30 не хотіли). Мінімальна тривалість процесу вказує на те, що механізм абляції биоткани під дією імпульсного УФ випромінювання має не теплову, а фотохимическую природу.
Значні можливості у вивченні оптичних і теплофізичних параметрів біотканин має метод імпульсної оптико-термічної радіометрії [18, 21]. Цей метод також виявився досить ефективним при вимірах коефіцієнтів поглинання здорової і патологічної тканини артеріальної стінки і атеросклеротичних бляшок [21]. Частково дані [21] представлені в табл. 1.1. При порушенні таких биотканей, як дентину зуба, зрізи картоплі і шкіри пальця людини, випромінюванням АІГ: Ег лазера ( = 2,94 мкм) і реєстрації їх теплового випромінювання в діапазоні 4-9 мкм виявляється можливим визначати коефіцієнти поглинання світла на довжині хвилі лазера і в спектральному діапазоні випромінювання тканини, а також температуропровідність і об`ємну теплоємність зазначених тканин [18].
Фотоакустична мікроскопія і візуалізація. Основні принципи фотоакустичної мікроскопії (ФАМ) досить прості [П. 41]. Сканування сфокусованого лазерного пучка по поверхні об`єкта і реєстрація за допомогою мікрофона або пьезодатчика акустичного сигналу дозволяють отримувати локальну інформацію
про оптичні, теплових і акустичних властивостях біооб`єкту. Так як амплітуда ОА сигналу залежить від інтенсивності поглиненого світла, то ФАМ повинна давати інформацію не тільки про характер поглинання світла речовиною, але і про локальну структуру, як поверхні і інших параметрах об`єкта, одержуваних за допомогою звичайної оптичної мікроскопії. Одночасне сканування довжини хвилі випромінювання дозволяє отримувати локальні спектри поглинання. Оскільки амплітуда ОА сигналу пов`язана зворотною залежністю з інтенсивністю люмінесценції досліджуваного речовини, то існує можливість побудови аналога люмінесцентного мікроскопа, а також можливість вивчення локалізованих в просторі фотовольтаїчні і фотохімічного процесів.
За допомогою ФАМ можна забезпечити сканування об`єкта по його глибині. Змінюючи довжину хвилі лазера, можна регулювати глибину проникнення світла в речовину і порушувати ОА сигнал на різних глибинах. Інший шлях - зміна частоти модуляції лазерного пучка. Ця властивість є унікальним і виділяємо ФАМ з інших способів мікроскопії. Глибина зондування визначається термодифузійною довжиною для даної частоти модуляції. Наприклад, для непрозорого зразка (а = 10 + 6 см-1) ОА сигнал можна порушити на глибинах від 0,1 до 10® мкм, якщо змінити частоту модуляції від 100 МГц до 1 Гц.
Технічні рішення в області застосування ФАМ проаналізовані в [П. 41]. Досягнута роздільна здатність ФАМ у видимій області спектра не перевищує 7-15 мкм. Однак по інформативності ФАМ істотно перевершує оптичну мікроскопію, оскільки дозволяє візуалізувати деталі мікроструктури непрозорих для світла об`єктів, тим самим доповнює і розширює традиційні методи мікроспектрального аналізу і має перспективи застосування в біології та медицині.
Наприклад, ефекти збудження акустичних хвиль потужним лазерним імпульсом короткої тривалості можна використовувати для діагностики катаракти, а також внутрішньоочних новоутворень (П. 14, 20]. Промисловий лазерний фотоакустичний мікроскоп типу ФМ-ЗМ, призначений для вивчення широкого класу біооб`єктів і биотканей (візуалізації структурних дефектів і особливостей будови), описаний в [20]. Дані по візуалізації і визначення теплофізичних параметрів тонких зрізів (близько 5 мкм) деяких биотканей (тканини ока і нирок тварин), отримані фазовим методом при опроміненні зворотній поверхні об`єкта, представлені в [24].
