Діагностика біологічних об`єктів на основі вимірювання коефіцієнтів дифузії - лазерна діагностика в біології та медицині
Діагностика біологічних об`єктів
на основі вимірювання коефіцієнтів дифузії
Трансляційна дифузія. До теперішнього часу найбільше число робіт по застосуванню лазерної спектроскопії квазіпружного розсіювання в біології відноситься до діагностики макромолекул: білків, нуклеїнових кислот, їх фрагментів і комплексів, а також різних надмолекулярних і клітинних структур, вірусів, фагів. У табл. 3.1 наведені деякі характерні приклади результатів значень гідродинамічного радіуса деяких біологічних частинок, взятих з робіт [1, 3, 9]. Всі вимірювання проводилися за допомогою монодінних спектрометрів. Звертає на себе увагу мала похибка вимірювань, що становить близько 1%. Випадки більшої похибки при дослідженні стаціонарних об`єктів пов`язані, як правило, не з помилкою методу, а з недостатнім очищенням зразка. Наявність в ньому сторонніх часток (наприклад, порошинок) або. агрегатів призводить до збільшення похибки.
Таблиця 3.1
Коефіцієнт трансляційній дифузії і гідродинамічний радіус деяких біологічних макромолекул
Вимірювання стаціонарних значень коефіцієнтів дифузії, гідродинамічних радіусів і навіть маси не є кінцевою метою діагностики. Ці параметри дуже чутливі до змін умов навколишнього середовища (розчину). Тому в більшості робіт реєструються зміни параметрів DT і ГГЛ в цілях діагностики різних змін властивостей частинок під дією зовнішніх чинників. До таких змін відносяться: денатурація, агрегація, імунні реакції, конформационная рухливість і ін.
Зміна DT частинок в розчині може відбуватися навіть під дією зондуючого пучка [17]. Це стосується головним чином до сильно поглинає світло розчинів, прикладом яких є розчин гемоглобіну. Вимірювання, що проводилися на монодінном спектрометрі при куті розсіювання 0 = 90 ° з обробкою сигналу на 20-канальному аналізаторі спектра реального часу з похибкою визначення DT не вище 0,5%, дозволили отримати методично важливі залежності півширини лоренцевского спектра від потужності зондуючого пучка для молекул гемоглобіну з різним ступенем оксигенації (рис. 3.5). Видно, що, екстраполюючи отримані залежності в бік менших інтенсивностей зондуючого пучка, отримують таке значення інтенсивності, при якому можна проводити вимірювання, не вносячи змін в досліджуваний об`єкт.
Мал. 3.5. Залежність ширини спектра сигналу МС від потужності зондуючого пучка при вимірюванні в розчинах деоксігемоглобіна (1) і оксигемоглобіну (2) [17]
Кінетику оборотних змін коефіцієнта дифузії молекул гемоглобіну при їх агрегації в комплекси внаслідок деоксигенації вдається реєструвати навіть не в розчині, а всередині інтактних червоних клітин крові - еритроцитів [18]. Для цього використовується спектрометр, виконаний на базі серійного мікроскопа, що дозволяє здійснювати кореляційний спектроскопію флуктуацій інтенсивності в обсязі близько 8 мкм3. На такому мікроскопе- спектрометрі спостерігалася агрегація гемоглобіну в еритроцитах крові хворих серповидної анемією, рух протоплазми всередині дуже маленьких (близько 10 мкм) живих клітин (про це докладніше див. 3.5). Подібна апаратура `може бути з успіхом використана, наприклад, при вивченні процесів, що відбуваються зі зміною розмірів білків в процесі біосинтезу і при диференціації клітин.
Цікавим є вивчення залежності агрегації молекул від температури. Сильна температурна залежність швидкості росту агрегатів була показана, наприклад, при дослідженні процесів агрегації мономерів імуноглобуліну [19]. При 39 ° С ніякої зміни радіуса- мономерів (5,8 нм при концентрації 15,4 мг / мл) не спостерігалося навіть протягом 60 годин. У той же час радіус агрегатів досягав 100 нм за 4 години при нагріванні розчину до 62 ° С.
Вимірювання кінетики полімеризації тубуліну і самозборки микротрубочек in vitro при квазістатичному зміні температури показало [20], що при концентрації тубуліну в розчині 1,1 мг / мл середній коефіцієнт дифузії gt; т починає різко, але можна зупинити зменшуватися при температурі 20-25 ° С . При цьому починає оборотно збільшуватися полідисперсність. Істотні і вже незворотні зміни розчину починаються в діапазоні температур 45-60 ° С, що, мабуть, свідчить про денатурації білка. Стрибкоподібне підвищення температури з 7 до 37 ° С призводить до зміни gt; т і ступеня полідисперсності більш ніж в три рази за 20 хвилин. Додавання в розчин 100 мкмоль колхіцину, що перешкоджає полімеризації, робить розчин не чутливим до температури.
Іншим прикладом застосування методу для дослідження реакції полімеризації, які мають велике значення в біомедичної діагностики, є перехід фібриногену в
Мал. 3.6. Тимчасові залежності інтенсивності світлорозсіювання (1) і гідродинамічного радіуса молекул фібриногену (2) після додавання в розчин тромбіну (в момент часу t-0)
фібрин і агрегація фібрину. При появі на тілі рани стійкі молекули фібриногену за участю ферменту тромбіну переходять в нестійку форму, звану фибрином. Фібрин починає полимеризоваться з утворенням щільної сітки агрегатів, що сприяє загоєнню рани.
На рис. 3.6 в напівлогарифмічному масштабі зображена тимчасова еволюція середньої інтенсивності розсіяного світла Iv (t) і середнього гідродинамічного радіуса ГГД (t) молекул фібриногену в розчині з концентрацією 1 мг / мл після додавання 0,0033 од / мл тромбіну. Вимірювання проводились на МС з 60-канальним фотонним коррелятором, зв`язаних з ЕОМ, при 0 = 90 °, 7 = 37 ° С. Дослідження кінетики цієї реакції аж до переходу в гель стан (через 6 годин) дозволило побудувати модель взаємодії молекул і всього процесу полімеризації [21].
Ще один важливий приклад відноситься до діагностики очних захворювань. На основі теорії пружного світлорозсіювання було показано, що помутніння кришталика ока відбувається через розсіювання світла на конгломератах високомолекулярних протеїнів [22, 23]. До теперішнього часу за допомогою спектроскопії квазіпружного розсіювання проведені численні дослідження дифузійної рухливості протеїнів в кришталиках людини і тварин як in vitro, так і in vivo [24, 25]. При дослідженнях на об`єктах in vitro розсіяне світло Ні-Ne лазера (^ = = 632,8 нм) потужністю 1-5 мВт збирався під кутами 45 або 90 ° на ФЕУ, звідки надходив на цифровий коррелятор, що містить не менше 100 каналів, і далі на ЕОМ для подальшої обробки кореляційної функції.
Виявлено, що в нормальному кришталику ока людини основними розсіювачами є конгломерати протеїнів діаметром близько 0,5 мкм і Полідисперсні набором частинок з діаметрами від 1 до 6 мкм [26, 27]. В роботі [28] проведено вивчення розподілу конгломератів протеїнів в кришталиках свині. Показано, що середній діаметр частинок першого компонента розподілу становить 15-23 нм, другого - близько 0,1 мкм, третього - близько 1 мкм і, нарешті, четвертого - 30-70 мкм. При цьому розподіл кожного типу конгломератів за обсягом кришталика носить досить складний характер.
Таким чином, методом динамічної спектроскопії можна спостерігати за зміною структурного складу кришталика, який проявляється в зміні його светорассеивающих властивостей. Однак слід зауважити, що для отримання надійних результатів при потужності зондуючого випромінювання близько 1 мВт час вимірювання у всіх експериментах становило від декількох до десятків хвилин, що є абсолютно неприйнятним в клінічній практиці. Тому необхідні подальші дослідження з метою підвищення чутливості методу.
Як приклад дослідження кінетики агрегації в процесі імунологічної реакції можна привести вивчення реакції аглютинації, що проводиться для експресного визначення вмісту бактерій [29]. Якщо при візуальному контролі перше спостереження цієї реакції реєструється через 18 годин, то за допомогою фотон-кореляційного спектрометра вже через кілька хвилин можна побачити початок прогресуючого зменшення крутизни спадання кореляційної функції, що свідчить про збільшення середнього розміру часток і, отже, про протікання реакції.
Використання фотон-кореляційної спектроскопії дозволяє також вимірювати розподілу за розмірами агрегатів, що утворюються бактерій, в тому числі і при розведеннях, великих титру, вже на первинних стадіях реакції, т. Е. При агрегації всього двох або кількох бактерій. Очевидна важливість прикладного аспекту цих робіт. Подібні дослідження проводяться також при вивченні і таких імунологічних реакцій, як реакція преципітації [30] і реакції антиген - антитіло [31].
Обертальна дифузія. У всіх розглянутих прикладах мова йшла про вимірювання коефіцієнта трансляційній дифузії. Однак в тих випадках, коли форма розсіюють частинок ближче немає сферичної, а до аксіально симетричною або ж сферичні частинки сильно анізотропні, в спектр флуктуацій розсіяного поля, як уже говорилося, вносить вклад також орієнтаційна, або обертальна, динаміка. Це відбивається на кореляційної функції таким чином, що вона розкладається в ряд експонент, в показники яких крім DT входить також DB - коефіцієнт обертальної дифузії. При певному виборі кута розсіювання число значущих членів ряду можна редукувати до двох, що дає можливість обчислити по експериментальній кривій коефіцієнтів [1, 9].
Інший спосіб вимірювання DB складається в реєстрації спектра флуктуацій інтенсивності деполяризованого компонента розсіяного світла [32]. Це пов`язано з тим, що саме при розсіянні на анізотропних частинках виникає цей компонент. Реєструючи деполяризованого світло при малих кутах розсіювання, коли внесок трансляційній дифузії мізерно малий (вираз (3.4)), можна виміряти DB з великою точністю. Природною труднощами в цьому підході є те, що інтенсивність деполяризованого компонента розсіяного світла зазвичай на кілька порядків нижче інтенсивності поляризованого компонента. Однак застосування техніки лічби фотонів робить ця обставина не дуже важливим. спільні вимірювання
DT і DB дають додаткову інформацію про форму розсіюють частинок.
Крім обертання анізотропних макромолекул певний внесок в спектр сигналу вносять швидкі конфігураційні внутрішньо-молекулярні руху: ізгібние коливання довгих молекул або філаментів, динаміка полімерних клубків і т. Д. Методи розрахунку спектрів розсіяного світла, що враховують ці рухи, в даний час посилено розвиваються [9]. Отримувані паралельно експериментальні дані використовуються для перевірки різних гіпотез і моделей.
