Лазерна допплерівська спектроскопія живих клітин - лазерна діагностика в біології та медицині
Лазерна допплерівська спектроскопія живих клітин і діагностика внутрішньоклітинної рухливості
Загальні відомості. До теперішнього часу виконано велику кількість досліджень з розробки методів і практичної реєстрації рухливості живих клітин в суспензіях: бактерій, сперматозоїдів тварин і людини, водоростей і ін. (Див., Наприклад, [50-54]). Ця рухливість має характер НЕ теплової дифузії, а випадкових блукань з елементами прямолінійного, обертального і спірального рухів. Кожне з цих видів рухів вносить свою лепту в доплеровское розширення спектрів. Тому точний опис светорассеяния виливається в складні многопараметрические математичні моделі. Проте розроблені процедури дозволяють отримувати з експериментально виміряних спектрів розподілу швидкостей, відносне число рухомих і нерухомих клітин і ряд інших параметрів.
З огляду на, що з цього питання опубліковано велику кількість оглядових робіт (див., Наприклад, [53, 54]), ми не будемо зупинятися на ньому детально, а перейдемо до обговорення досліджень внутрішньоклітинної рухливості, в яких застосування лазерної допплерівської спектроскопії (ЛДС) є вельми багатообіцяючим [55, 56].
Перше використання цього методу для вирішення завдань реєстрації спрямованої внутрішньоклітинної рухливості в великих рослинних клітинах відноситься до 1974 г. [57]. Були отримані чіткі доплеровские спектри, що характеризують розподіл швидкостей стаціонарного руху светорассеивающих частинок, складових протоплазму цих клітин (ядер, мітохондрій і ін.). У наступній серії робіт [58-64] була продемонстрована висока ефективність ЛДС як регулярного методу вирішення завдань біофізики рухливості, що дозволяє здійснювати реєстрацію нестаціонарних відгуків клітини на зовнішній вплив, що важливо при вивченні механізмів просторово-часової організації клітинної рухливості, її регуляції та ін.
Особливістю лазерного зондування одиночних нерухомих живих клітин є те, що світло розсіюється не тільки рухомими внутрішньоклітинними органоидами, але також і нерухомими клітинними стінками. У першому випадку в розсіяному світлі з`являються доплеровские зрушення частоти, в той час як у другому частота розсіяного світла не змінюється.
Цей другий компонент розсіяного світла неминуче потрапляє на фотоприймач, що дозволяє використовувати цей компонент в якості опорного випромінювання для перенесення доплеровских зрушень частоти в низькочастотну область шляхом гетеродінірованія. Таким чином, однолучевой схемою зондування можна в принципі забезпечити гетеродинний режим вимірювання швидкостей руху внутрішньоклітинних частинок. При цьому, звичайно, повинні бути виконані вимоги ефективного ОС і гетеродінірованія, що в деяких випадках відбувається автоматично, а в деяких вимагає додаткових зусиль.
Мал. 3.11, Блок-схема вимірювально-обчислювального комплексу на базі однолучевого ЛДС
Опис установки. На рис. 3.11 зображена схема вимірювально-обчислювального комплексу, створеного для вивчення внутрішньоклітинної рухливості [65]. Випромінювання Ні-Ne лазера типу ЛГ-38 (/), ослаблене набором фільтрів (2), фокусується лінзою (5) на клітину (4), закріплену в кюветі (5) в спеціальних власниках (6). Розсіяне світло надходить через систему лінз і діафрагм (7) на ФЕУ (8), що працює в струмовому режимі. Сигнал після посилення і фільтрації в НЧ підсилювачі (9) надходить паралельно на осцилограф (10) для візуального контролю, на аналізатор спектру реального часу типу СК4-72 (11), що має крім електронно-променевого індикатора цифровий вихід, і на аналого-цифровий перетворювач (АЦП) (12), що перетворює аналоговий сигнал в дискретні вибірки з програмно встановлюється частотою дискретизації і тривалістю. Ці вибірки надходять на ЕОМ (13) для спектральної обробки, яка виконується по ходу або після запису вибірки в пам`ять.
Всі наведені нижче результати отримані шляхом обробки сигналу на ЕОМ ЄС-1010, хоча замість неї могла бути використана будь-яка інша машина того ж класу. На цю ж машину можуть подаватися оцифровані спектри з виходу аналізатора і вихідні сигнали інших датчиків (наприклад, вимірювачів температури, мембранного потенціалу або ін.) (14). ЕОМ забезпечена зовнішніми пристроями: алфавітно-цифровим (15) і графічним (16) дисплеями, графопостроителем (17) і печаткою (18). Складовою частиною комплексу є пакет програм для збору і обробки даних, а також для управління експериментом.
В якості основних характеристик комплексу, визначених в чому специфікою вирішуваних завдань і властивості-
досліджуваних об`єктів, можна назвати: час отримання усередненого доплерівського спектра з задовільною
Мал. 3.12. Доплеровский спектр, отриманий від живої клітини ХАРОВІ зі стаціонарним перебігом протоплазми- 0 = 45 °, т = 10 с, Г = 20 ° С
похибкою (зазвичай в межах 10%) т = 1-6 с- межі вимірювання швидкостей спрямованого руху до = 10 -1000 мкм / с- апаратне розширення спектра А / а = 0,5 -2 Гц-локальність вимірювання L = 100 -500 мкм- можливе число каналів доплеровских вимірювань п = 4 (крім цього, можливе введення в ЕОМ декількох повільно мінливих сигналів від інших датчиків) - щільність потужності випромінювання в зондіруемой області клітини W = l-100 Вт / см3. Точне значення порога невозмущающего впливу встановлюється для кожного виду клітин до початку експерименту про урахуванням тривалості вимірювань, коефіцієнта поглинання і ряду інших чинників.
Результати вимірювань. На рис. 3.12 зображений в напівлогарифмічному масштабі характерного вигляду доплерівського спектра, одержуваного при вимірах на великих клітинах ХАРОВІ Nitella, що не піддаються зовнішнім впливам. Форма цього спектра визначається головним чином розподілом швидкостей в вимірювальному об`ємі і свідчить про те, що більшість частинок рухається зі швидкістю tgt; = 40 мкм / с, що відповідає частоті максимуму в спектрі. У стаціонарному стані флуктуації швидкості течії протоплазми в цих клітинах малі, так що усереднення спектра можна проводити протягом тривалого часу (порядку декількох хвилин), що призведе до зменшення розкиду спектральних компонентів. Однак такі вимірювання мають чисто методичний інтерес, так як оцінку швидкості стаціонарного руху можна зробити і за допомогою візуального спостереження через оптичний мікроскоп.
Істотно більший інтерес з урахуванням перерахованих вище біофізичних завдань представляє спостереження перехідних режимів з характерним часом квазістаціонарності не менше 1 с. Однак при цьому доводиться задовольнятися значним розкидом значень спектральної щільності потужності сигналу, що призводить до великих погрішностей в вимірі.
У живих клітинах Nitella нестаціонарні внутрішньоклітинні руху мають місце при зовнішніх впливах: світлових, механічних, електричних, хімічних та ін. Так, наприклад, електрична стимуляція шляхом подачі електричного імпульсу напругою ії = 100 мВ, тривалістю ти = 1 с на зовнішню збудливімембрану призводить до генерації потенціалу дії і до подальшої швидкої зупинки потоку протоплазми з подальшим його відновленням [64]. Відповідне цього процесу зміна форми доплеровских спектрів зображено на рис. 3.13.
При зупинці руху (рис. 3.13а) доплеровській компонент спектра зникає і залишається лише розширена лінія, яка відображає наявність дифузійного та іншого ненаправленного руху в клітці. Згодом у міру відновлення течії протоплазми відновлюється і доплеровській компонент спектра (рис. 3.136 - г). Залежно від параметрів зовнішнього впливу час досягнення початкового значення швидкості потоку може становити 5-10 хвилин і більше, причому в ряді випадків можливі тривалі процеси встановлення, мають коливальний характер.
Мал. 3.14. Три приклади процесу відновлення спрямованого течії протоплазми в клітці після швидкої зупинки (момент зупинки позначений стрілкою)
Мал. 3.13. Кінетика відновлення форми доплерівського спектра після тимчасової зупинки течії протоплазми
Різні кінетики відновлення спрямованої внутрішньоклітинної рухливості представлені на рис.3.14.
Слід зауважити, що спостерігаються коливання швидкості не є проявом патологічного стану клітини. Періоди коливань, постійні для кожної конкретної клітини, приймають значення в інтервалі від 5 до 10 хвилин, причому форма коливань може бути як квазігармоніческіх, так і близькою до релаксаційної. Цікаво, що коливання швидкості супроводжуються коливаннями мембранного потенціалу, проте їх періоди відрізняються в два рази [64]. Характер відновлення швидкості залежить від умов освітленості в період, що передує стимуляції.
Були спроби виділення на загальному тлі всього розсіяного світла сигналу від певних частинок, що грають важливу роль в механізмі генерації рушійної сили. Зокрема, такими частками відповідно до деякими гіпотезами є сферосоми - сферичні частинки, що містять міозин і мають діаметр 0,2 0,8 мкм. Передбачається, що ці частинки здійснюють коливальні рухи в площині, ортогональної напрямку основного потоку протоплазми. Такі їх руху повинні призводити до виникнення в спектрі сигналу ЛДС еквідистантних максимумів шириною, пропорційній часу реєстрації кожного спектра. Відстань між ними по осі частот відповідно до розрахунку має дорівнювати середній частоті коливань частинок. Для того щоб виділитися поміж сильного доплерівського сигналу, пов`язаного з спрямованим рухом протоплазми уздовж клітини, вимірювання проводились так, щоб вектор розсіювання q був орієнтований ортогонально основному потоку. Таким чином, в спектр сигналу крім шуканих компонентів вносили вклад ортогональні складові швидкості, що виникають, можливо, при зіткненнях часток, що рухаються, а також складові дифузійного руху.
На рис. 3.15 наведено доплеровській спектр, отриманий за цією схемою в тому ж експерименті і з того ж вимірювального об`єму, що і спектр, зображений на рис. 3.12. Спектр побудований чисельним методом за допомогою алгоритму • швидкого перетворення Фур`є по дискретним вибірках сигналу, що пройшов попередню цифрову фільтрацію для усунення більш високочастотних компонентів, які могли б спотворити шукані компоненти внаслідок ефекту накладення частот. Дозвіл по частоті складає 0,1 Гц, час отримання одного спектра - 55 с, що не перевищує часу квазістаціонарного руху частинок в клітці.
Після обробки та запам`ятовування 90 спектрів будувалися гістограми значень частот, відповідних добре помітним максимумів. Статистична обробка отриманих результатів, що проводилася методами перевірки гіпотез, показала, що зареєстровані максимуми статистично достовірні, причому виявлена дискретність в спектрі із середнім відстанню між гармоніками 3,6 ± 0,6 Гц відповідає теоретичному розрахунку.
Мал. 3.15. Доплеровский спектр, отриманий при реєстрації розсіяного світла в площині, ортогональної напрямку основного потоку протоплазми
У той же час з отриманих результатів поки не випливає їх явна зв`язок з коливальним рухом Сферос. Для отримання такого зв`язку необхідно було б виділити світло, розсіяне тільки сферосомамі, що не представляється можливим, або ж виключити періодичні руху інших розсіюють структур. Дослідження в цьому напрямку тривають.
На основі великого експериментального матеріалу, отриманого за допомогою ЛДС, побудований ряд моделей механізму генерації рушійної сили, що приводить в рух протоплазму харових водоростей [66].
Інший приклад застосування ЛДС для дослідження нестаціонарної внутрішньоклітинної рухливості відноситься до реєстрації руху протоплазми в слизовому грибі Physarum polycephalum [56, 59, 61, 67-70]. Цей об`єкт суттєво відрізняється від розглянутого вище по морфології, характеру рухливості і оптичними властивостями. У тяжах, що представляють собою тонкі (100-500 мкм) і довгі (1-2 см) трубочки, внаслідок періодичної скорочувальної активності стінок має місце знакозмінні протягом протоплазми з квазіперіодом Tv = 1-2 с.
На рис. 3.16 наведені три спектра, отримані від тяжів при різній швидкості течії протоплазми. Спектр 1 отриманий при- мінімальної швидкості течії, спектр 3 - при максимальній. Звертає на себе увагу істотна відмінність спектрів, характерних для цього об`єкта, від спектрів, що реєструються від клітин водорості. Як показали розрахунки і вимірювання на модельних капілярах [71], форма спектрів визначається не тільки профілем швидкостей в вимірювальному об`ємі, але і статистичними параметрами оптичних светорассеивающих неоднорідностей стінки, що обмежує потік. Що стосується даному об`єкту другий з цих факторів робить переважаючий вплив.
Г, КГц
Мал. 3.16. Три доплеровских спектра, отримані від плазмодія міксоміцетів і відповідають різним швидкостям течії протоплазми: »(/) lt;» (2)
Мал. 3.17. Тимчасова залежність ширини допплерівського спектра, отримана від плазмодія міксоміцетів з човниковим плином протоплазми
Проте зміна в часі цього параметра відображає кінетику внутрішньоклітинного транспорту протоплазми.
На рис. 3.17 приведена типова тимчасова залежність модуля функції ІЕФ (i), що реєструється на однопроменевому
спектрометрі. Кожна точка цієї кривої відповідає напівширину спектра, отриманого в результаті усереднення по 64 «миттєвим» спектрами, із загальним часом вимірювання 5 с.
Зауважимо, що подібні криві, одержувані методом ЛДС, і якісно, і кількісно відповідають даним, одержуваним шляхом візуальних вимірювань і кінозйомки через оптичний мікроскоп, проте відрізняються великою роздільною здатністю і не містять елементів суб`єктивності. Важливим є також те, що обробка і представлення даних здійснюються в реальному масштабі часу і після закінчення експерименту криві зберігаються в пам`яті ЕОМ у вигляді масивів чисел, готових до подальшої додаткової обробки.
Аналіз подібних кривих, отриманих при різних умовах проведення експерименту, в тому числі в результаті многоточечного зондування на багатоканальному варіанті спектрометра [8, 56], дав велику інформацію, яка використана при побудові моделей внутрішньоклітинної рухливості [66, 68, 72, 731. Зокрема , досліджено вплив квазістаціонарних і імпульсних температурних впливів, що змінюють період коливань швидкості потоків Tv, показані можливості синхронізації цих коливань зовнішнім впливом [2, 69], отримані дані про можливу природу фактора, Сінхронізуется внутрішньоклітинні осцилятори (задатчики ритму) [8, 67], показано наявність активної скоротливої роботи тяжів, що приводить в рух протоплазму, [68] і т. д.
Лазерна допплерівська мікроскопія. У наведених вище прикладах застосовувався для вимірювань спектрометр забезпечував локальність зондування близько 100 мкм, що було досить у зв`язку з порівняно великими розмірами досліджених об`єктів. При роботі з маленькими клітинами необхідно більш високу просторову роздільну здатність - близько кількох мікрометрів. Цього вдається досягти в так званих лазерних доплеровских мікроскопах (ЛДМ) завдяки використанню короткофокусної оптики і спеціальної геометрії розташування елементів [74-84]. У більшості випадків ЛДМ виконують на базі серійних оптичних мікроскопів, що робить їх компактними, легко налаштованим приладами.
На рис. 3.18 приведена блок-схема ЛДМ, виконаного на основі мікроскопа «Люмам» (1), сполученого з мікро- ЕОМ (2) і забезпеченого для зручності настройки телекамерою (3) і телемонітора (4) [84]. Конструкція мікроскопа дозволила реалізувати як диференціальну, так і однолучевую схеми (шляхом перекриття одного з пучків) з підведенням зондирующих пучків до об`єкту або знизу (/), або зверху (//). У першому випадку фотоприймач (5) реєструє світло, розсіяне вперед, у другому - тому.
Мал. 3.18. Блок-схема лазерного доплерівського мікроскопа
Вимірювальний об`єм формується фокусирующим (б) і прийомним (7) об`єктивами і точкової діафрагмою (8), розташованої перед фотоприймачем в площині зображення. Так, при збільшенні об`єктивів 15 х і 30 х і розмірі діафрагми 150 мкм подовжній розмір вимірювального об`єму ALj = 7,5 мкм, а поперечний AL2 = 2,5 мкм. Масштабний коефіцієнт, що зв`язує вимірювану швидкість з доплерівським зсувом частоти, становить 1,3 мкм / (с * Гц).
До попадання на фокусує об`єктив обидва пучка проходять через керовані акустооптичні модулятори (9),
в результаті чого вони набувають відносний зсув частоти Л /, який може регулюватися в межах від 102 до 105 Гц. Наявність різниці частот у зондирующих пучків робить ЛДМ чутливим до напрямку досліджуваного потоку і дозволяє відбудувати від малоінформативних низькочастотних компонентів допплерівського сигналу [14].
Схема обробки фотоструму після підсилювача (12) включає в себе аналізатор реального часу типу С4-72 (13) і / або ЕОМ (2), забезпечену дисплеєм (15), дисководами з гнучкими магнітними дисками (16) і плотером (17). Сигнал на ЕОМ подається після дискретизації через інтерфейсні блоки (14), виконані в стандарті КАМАК- Мікроскоп забезпечений також відеомагнітофоном (18) для запису телезображень об`єкта.
Описаний ЛДМ призначений головним чином для дослідження спрямованих рухів в клітинах, однак він має більш широку область застосувань.
За допомогою лазерних доплеровских мікроскопів отриманий цілий ряд унікальних результатів. Зокрема, зареєстровано спрямований рух частинок всередині одиночних соматичних клітин [82], проведено пряме спостереження накопичення б-Кристаллин в кришталиках ембріона курчати [83]. На тлі інтенсивного спрямованого течії протоплазми в клітинах водорості виявлена анізотропія коефіцієнта трансляційній дифузії частинок за різними напрямками всередині клітини [80, 81].
Ці та цілий ряд інших результатів показують, що ЛДС і ЛДМ вже стали ефективним засобом, здатним вирішувати широке коло завдань клітинної біофізики.
