Проточні аналізатори мікрочастинок - лазерна діагностика в біології та медицині
Відео: Хайдуков С. В. ДОСЛІДЖЕННЯ субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові
Проточні аналізатори мікрочастинок
Загальні відомості. В лабораторно-діагностичної практиці при роботі з біологічними рідинами, що містять частинки неорганічного або органічного походження, дослідників зазвичай в першу чергу цікавлять концентрація, склад і розміри частинок. Ці питання, як правило, виникають при аналізі крові, спермі, опадів сечі і т. П. До медичного аналізатору мікрочастинок пред`являються специфічні вимоги, основні з яких - малий обсяг проби, високі концентрації і полідисперсність розмірів аналізованих частинок. В даний час випускається значна кількість приладів для визначення концентрації мікрочастинок в рідинах [П. 48, 50]. Однак приладів, придатних для застосування в медичній практиці, відомо порівняно небагато.
Оптичні методи дослідження біологічних рідин можуть грунтуватися на явищах дифракції, ослаблення світла, на основі зображує техніки і ін. Найчастіше на основі ослаблення світла будуються аналізатори, істотні переваги яких - широкий діапазон реєстрованих розмірів, відсутність попередньої обробки досліджуваної проби. Для цього визначається відгук фотоприймача, реєструючого мікрочастинки по інтенсивності світлорозсіювання, з урахуванням кутів збіжності падаючого і приймального світлових пучків. Залежно від значення кута спостереження 0 реалізуються різні способи вимірів: при 0 = 0 ° говорять про фотометричні методи дослідження, якщо кути спостереження близькі до нуля, по прямій світло не враховується, то реалізуються малокутових або дифракційні методи, при 180 ° маємо лідарні методи. Для біологічних досліджень використовується найчастіше малокутової спосіб реєстрації випромінювання.
Характеристики лазерних аналізаторів частинок. В СРСР розроблений і серійно випускається прилад Ампл-1 (аналізатор мікрочасток проточний лазерний), заснований на методі визначення розмірів мікрочастинок за інтенсивністю малоуглового светорассеяния [511. Прилад призначений для визначення концентрації мікрочастинок в суспензіях, побудови і аналізу гістограм розподілу мікрочастинок за розмірами за допомогою мікро-ЕОМ.
Функціональна схема приладу приведена на рис. 2.7, де зображені пристрої введення буферної рідини (БЖ), введення проби (П), оптико-електронного блоку (ОЕ) і системи електронної обробки інформації (ЕО). Досліджуваний препарат подається зі шприца 13 пристрою П разом з буферної рідиною з ємності 1 пристрою БЖ в проточну камеру 2 з плоскими вікнами блоку ОЕ. Луч Ні-Ne лазера (Х = 632,8 нм) 9 фокусується лінзою 10 в вимірювальний рахунковий обсяг 11 діаметром 100 мкм, через який послідовно пролітають частинки, генеруючи імпульси светорассеяния. Пряме нерозсіяних випромінювання пригнічується фільтром-ножем Фуко 12. Сигнал з фотоприймача 5 надходить на багатоканальний аналізатор амплітуди імпульсів 7 і далі на мікро-ЕОМ 8 системи електронної обробки інформації ЕО. Управління режимом аналізу проби здійснюється за допомогою блоку сполучення 6,
сигнал з якого управляє двигуном приводу 3 дозатора 13 за допомогою спеціальної електронної схеми 4 блоки П1. Обсяг аналізованої проби становить 20-500 мм 3 при витраті буферної рідини 1 см3 / с.
Мал. 2.7. Блок-схема аналізатора Ампл-1 [П. 51]
Велику увагу приділено конструкції проточної камери з гідродинамічної фокусуванням потоку з досліджуваної рідиною і аналізом її в повітрі. Плоскі вікна проточною камери дозволяють уникнути небажаної рефракції від скляних трубок, які звичайно використовуються в подібних системах. Найбільші помилки у визначенні гістограм розподілів мікрочастинок викликаються нерівномірністю інтенсивності лазерного випромінювання, зміщенням зонда щодо центру струменя з пробою внаслідок тозі, що частинки, проскакивающие через різні області вимірювального об`єму, знаходяться в різних умовах освітлення. Діапазон розмірів вимірюваних часток від 0,5 до 100 мкм, максимальна швидкість рахунку - 10 с.
Похибка вимірювання приладом концентрації полі- стирольно латексу діаметром 4,1 мкм становить 10- 15%. Проте слід зазначити, що даного приладу притаманний ряд недоліків, які характерні для методів реєстрації інтенсивності за допомогою малокутового светорассеяния. Основний з них - це залежність результатів вимірювань від показника заломлення досліджуваного об`єкта, що особливо має місце при де робочі характеристики лічильників частинок максимально схильні до осциляцій (поява ділянок типу плато або западин) [50]. Це може призводити до того, що робочі характеристики можуть бути неоднозначними (особливо в діапазоні 0,5-2,0 мкм). Тому в цих випадках необхідно мати апріорну інформацію про досліджуваний об`єкт і використовувати калібрувальні криві.
В роботі [52] описаний лазерний аналізатор біологічних рідин, також побудований на основі реєстрації світла, розсіяного об`єктами. Однак на відміну від вищеописаного приладу світло реєструється у вузькому вугіллі, рівному 20 °, а кут спостереження 0 = 30 °. Така схема дозволяє впевнено реєструвати частинки з відносним показником заломлення в діапазоні 1,01-1,50. Сигнал з фотоприймача реєструється також аналізатором амплітуди. Для гідродинамічної фокусування досліджуваної рідини використовується камера зі скляною трубкою, яка хоча і є найбільш простий з відомих камер, але володіє підвищеними вимогами до якості виготовлення малого внутрішнього діаметру і оптичним характеристикам матеріалу. Розмір вимірювального об`єму становить 200 мкм. Проведені експериментальні дослідження приладу показали, що надійно можна реєструвати частинки з розмірами, великими 1 мкм, при діапазоні вимірюваних концентрацій 10 * -5-106 мл-1. Проведено дослідження на розведених суспензіях біологічних об`єктів розмірами 3-10 мкм.
Слід зауважити, що для даного типу лічильників частинок показання приладу будуть сильно залежати від показника заломлення досліджуваного об`єкта і в діапазоні 1-2 мкм можлива поява на робочих характеристиках ділянок типу плато або западин, т. Е. Також необхідно мати апріорну інформацію про досліджуваних об`єктах.
Багатопараметрична прольотна цитометрия. У серії робіт [53] розвивається багатопараметричний підхід до лазерної пролітної цитометрії, заснований на Светорассеяніє, іноді в поєднанні з мікрофлуоріметріей. Одночасно вимірюється ряд сигналів від окремої клітини, наприклад інтенсивності розсіювання вперед і під кутом 90 ° - повна інтенсивність ортогонального розсіювання і інтенсивність його компонента, поляризованого в площині, перпендикулярній площині поляризації падаючого випромінювання і напрямку прольоту клітин, так званого деполяризованого компонента, Iх `, інтенсивності розсіювання в діапазонах кутів 1,0-2,6 ° і 3,0-11,0 ° - інтенсивності бічного розсіювання випромінювання двох довжин хвиль. Можливі й інші комбінації сигналів.
Такий підхід дозволяє досить ефективно диференціювати клітини крові по їх морфології. Наприклад, еозинофільні гранулоцити можуть бути відокремлені від нейтрофілів. Така можливість важлива як для практики, так і для теоретичних досліджень в області-імунології. У цьому випадку інформація про тип клітини визначається співвідношенням інтенсивності ортогонального розсіювання і її деполяризованого компонента. При цьому абсолютні значення коефіцієнта деполяризації / j _ / (/ _ l + / ii) при великому розкиді кутів прийому розсіяного випромінювання (14,5 °) вживаються у такому значенні: 0,044 (еозинофільні гранулоцити) - 0,013 (нейтрофіли) - 0,007 (моноцити) - 0,008 (лімфоцити). Важливо, що еозинофіли, що мають велике число малих внутрішньоклітинних частинок (гранул, дають відносно великі коефіцієнти деполяризації. Це підтверджує той факт, що в процесі деполяризації випромінювання не останню роль відіграє багаторазове розсіювання.
З точки зору апаратурною реалізації багатопараметрична цитометрия може бути здійснена за допомогою стандартних прогонових цитометров з прямокутним кварцовим капілярів або струменем на повітрі при опроміненні світлом лазерів невеликої інтенсивності (наприклад, Ні-Ne, Аг (100 мВт)), включаючи багатохвильові лазери, або світлом спектральних ламп (ртутна лампа) при невеликій модифікації цитометра для прийому розсіяного випромінювання.
Важливо, що результати вимірювань подаються у вигляді двопараметричних карт на екрані дисплея мікро- ЕОМ, що відображають щільність просторово розділених областей зафіксованих клітин різних типів. Очевидно, що можливо і тривимірне представлення результатів при одночасному вимірі трьох параметрів розсіювання. В цьому випадку слід очікувати ще більшої диференціації клітин.
Двопараметричного карти інтенсивності ортогонального розсіювання і розсіювання вперед розчинених клітин крові людини показують з хорошим дозволом області розсіювання гранулоцитами, моноцитами, лімфоцитами і еритроцитами з залишками клітин. Аналогічне поділ можливо при одночасному спостереженні бічного розсіювання на довжинах хвиль 405 і 577 нм. В даному випадку поділ області відгуку цитометра на лімфоцити і моноцити від області відгуку на еритроцити обумовлено малою інтенсивністю розсіювання випромінювання з Х = 405 нм еритроцитами.
Побудований авторами [53] простий пролітний цитометр на базі Ні-Ne лазера потужністю 5 мВт з одночасною реєстрацією чотирьох параметрів розсіювання виявився цілком надійним приладом для диференціального рахунки чотирьох типів білих клітин крові. Порівняння результатів рахунки, виконаних на цьому приладі, і за допомогою випускається промисловістю прогонової цитометра «Technicon Н-6000», показало хорошу їх кореляцію. Коефіцієнт кореляції виявився рівним: 0,99 для лімфоцитів, 0,76 для моноцитів, 0,99 для нейтрофілів і 0,98 для еозинофілів. Відзначимо, що промислові цитометрия є досить складними приладами, які вимагають попередньої цитохімічної підготовки об`єкта дослідження.
В [531 показана перспективність розвиненою методики вимірювань і аналізу результатів для експрес-діагностики різних видів лейкемії. При цьому найбільша інформація може бути отримана з одночасних вимірювань характеристик світлорозсіювання і иммунофлуоресценции.
