Абсорбційної-трансмісійний аналіз з використанням перебудовуються лазерів - лазерна діагностика в біології та медицині
АБСОРБЦІЙНІ І калориметрических методів
ДІАГНОСТИКИ
При вирішенні цілого ряду діагностичних завдань в біології та медицині добре себе зарекомендували абсорбція методи, які зазвичай застосовуються в лазерної аналітичної спектроскопії або спектроскопії ультрашвидких процесів, [П. 1 - П. 3, П. 40 - П. 43, 1.12, 1]. Ці методи відносяться до методів мікродіагностікізастосовується, оскільки в них використовується інформація про атомну і молекулярну структуру досліджуваного речовини біооб`єкту. Схематичне уявлення деяких методів мікродіагностікізастосовується дано на рис. 5.1. У загальному випадку до абсорбції методів належать як абсорбційної-трансмісійні, засновані на вимірі інтенсивності падаючого / »і минулого / світла різних довжин хвиль, так і методи, засновані на реєстрації поглиненої енергії шляхом вимірювання температури АТ нагріву біооб`єкту (оптико-калориметричні методи) або інтенсивності / ф його флуоресценції (лазерний флуоресцентний аналіз).
Оскільки лазерний флуоресцентний аналіз в застосуванні до біології отримав досить широке поширення і має самостійне значення, він буде розглянутий в окремому розділі, а тут будуть обговорені можливості абсорбційної-трансмісійних методів, а також перспективи застосування оптико-калориметричних методів. Класифікація абсорбційних методів діагностики і деякі їх модифікації дані на схемі 2.
Абсорбційної-трансмісійний аналіз
з використанням перебудовуються лазерів
Методика вимірювань, гранична чутливість. Вимірювання спектра пропускання речовини в різних агрегатних станах є основою спектрофотометрического способу, який успішно застосовується протягом багатьох років в різних областях науки, в тому числі в біології та медицині. Його відрізняє надзвичайна простота, універсальність, порівняно висока чутливість і точність аналізу, цілком достатні при вирішенні багатьох завдань біомедицини.
2. Класифікація абсорбційних методів діагностики і деякі їх модифікації
Мал. 5.1. Схематичне уявлення ряду методів мікродіагностікізастосовується
Вимірювання спектра пропускання засноване на реєстрації інтенсивності падаючого (/ 0) і інтенсивності минулого в поглинає середовищі шлях г світла (/) в залежності від довжини хвилі до:
(5.1)
(5.2)
де а (А,) - коефіцієнт поглощенія- а ( ,) - ефективний перетин поглинаючих частинок (см2) - N - їх концентрація (див-3). Передбачається, що інтенсивність падаючого світла дуже мала. Для невеликих коефіцієнтів поглинання, коли ехр (-az) «l-аг, легко знайти, що
(5.3)
У нелазерних спектрофотометрах використовуються широкосмугові джерела світла, а перебудову по довжинах хвиль здійснюють за допомогою призм або дифракційних решіток. Для вузьких ліній поглинання чутливість залежить не тільки від здатності приладу зареєструвати малі зміни А / на тлі значного минулого сигналу, але і від роздільної здатності приладу. Зазвичай гранична чутливість досягається при А /// gt; 10-4- 10-5.
Використання лазерів дозволяє: 1) істотно підвищити спектральну роздільну здатність методу, визначити форму і структуру ліній поглинання молекул- 2) для вузьких ліній поглинання кілька підвищити чувствітельность- 3) в деяких випадках спростити і здешевити експериментальну установку, оскільки монохрома- гір (зазвичай становить найбільш об`ємну і дорогу частину установки) при наявності лазера виявляється непотрібним (слід пам`ятати, що деякі перебудовувані лазери також є технічно складні і дорогі пристрої) - 4) за рахунок високої спектральної щільності випромінювання лазерів знизити вплив шумів фотоприймального пристрої (сам лазер за рахунок нестабільності вихідний потужності і частоти може внести похибки в результати вимірювань, тому необхідний контроль або стабілізація параметрів лазера, що досить просто реалізується на практиці) - 5) за рахунок високої спрямованості і просторової когерентності лазерного випромінювання здійснити дистанційні та трасові вимірювання поглинання. У разі вимірювання слабких поглинань в газах і рідинах можна застосовувати багатоходові кювети, що налічують до 30-100 проходів [П. 42], а також порожні скляні і кварцеві оптичні волокна довжиною до 150 м [П. 43].
Переваги лазерних джерел світла особливо проявляються в ІК області спектра при дослідженнях окремих обертальних ліній коливальних смуг, які звичайними спектральними приладами не дозволяються.
Отже, гранична чутливість абсорбційного методу визначається здатністю реєструючої апаратури визначати найменше значення відносини A / min / 7. Чутливість методу може бути охарактеризована по- Різному [П. 42]. Порогова чутливість по оптичної щільності
або за коефіцієнтом поглинання
де I - довжина зразка. Зазвичай система реєстрації з використанням лазерів забезпечує значення A / min // = 10-5.
Мінімальна кількість детектіруемих на шляху лазерного пучка радіусу w молекул
їх концентрація
а також мінімально обнаруживаемая концентрація домішкових молекул
При аgt; = 0,6 см, сг = 10-17 см2, / = 10 см, N0 Ф = 1018 см-3 (повне число молекул) і Д / т1п // = 1 та-6 маємо Afmln «1012- Nmin« 10u см-3gt; ` «Min« 10-® см-1 Cmin «10-7 (100 ppb) [П. 42]. Це характеристика слідів одного речовини в іншому: ррш (млн-1, частин на мільйон, мкг / г) - ppb (млрд-1, частин на мільярд, нг / г) - ppt (трлн-1, частин на трильйон, пг / г).
Застосування багатоходових кювет, модуляційних і диференціальних методик вимірювання корисного сигналу, дозволяють істотно підвищити чутливість методу. Якщо амплітуда модуляція інтенсивності зондуючого випромінювання і модуляція поглинання можуть бути реалізовані для різних джерел світла, то багаторазове проходження середовища (до 100 разів) і частотну модуляцію зондуючого випромінювання можна отримати тільки при використанні лазерів. Таким чином була реалізована рекордна для ІК спектрометрів на інжекційних лазерах порогова чутливість amln »3-10-10 см-1. Для лазерних спектрометрів через високу когерентності світла сильним фактором, що заважає є інтерференційні ефекти в оптичній схемі пристрою. Цим в основному і визначаються досягнуті значення аю1п [П. 42].
Істотно підвищити чутливість методу (в 102- 10Б раз) можна при використанні внутрірезонаторними поглинання, коли кювету з досліджуваним речовиною розміщується всередині резонатора [П. 42, П. 43, 1.12]. Це підвищення відбувається за трьома основними причин. По-перше, автоматично реалізується велика кількість проходів (до декількох сотень, якщо досліджуваний об`єкт не вносить значних втрат). По-друге, завдяки характерній для лазерів залежності вихідної потужності від втрат в резонаторі усувається основна причина малої чутливості абсорбційного методу, оскільки фактично вимірюється не відношення А ///, а саме значення А /. І по-третє, в режимах генерації зв`язаних хвиль (багатомодовий двухзеркальной лазер або кільцевої лазер) ефекти конкуренції пов`язаних хвиль істотно підвищують чутливість лазерів до змін втрат всередині резонатора.
Внутрірезонаторними метод перспективний для реєстрації дуже слабких ліній поглинання речовин, що забруднюють атмосферу, короткоживучих продуктів хімічних (біохімічних) реакцій, радикалів і нестабільних молекул. Для створення високочутливих спектрометрів, що працюють на принципі вимірювання внутрірезонаторними поглинання, в більшій мірі підходять перебудовувані лазери з широкими лініями і значним запасом по посиленню. У видимій області - це лазери на барвниках, в ІК області - лазери на центрах забарвлення.
Основні області застосування в біології та медицині. Абсорбційної-трансмісійний аналіз досить універсальний і може бути з успіхом застосований при дослідженні газів, рідин і твердих тіл. Дослідження середовищ в різних агрегатних станах є предметом біомедичної діагностики. Газовий аналіз, наприклад, необхідний при визначенні газоподібних компонентів життєдіяльності живих організмів, визначенні слідів концентрацій забруднюючих речовин (завдання санітарії та профпатології) та ін.
Для лазерного контролю забруднень атмосфери розроблені численні засоби, багато з яких засновані на вимірі поглинання [П. 40, П. 42]. Контроль здійснюють шляхом відбору проб з наступним абсорбційним аналізом в багатоходових кюветах зниженого тиску. Проводять трасові вимірювання поглинання забруднюючих компонентів із застосуванням рознесених джерела світла і фотоприймача, віддалених дзеркального відбивача або природного розсіювача, використовуючи при цьому диференціальні методики вимірювань. Застосовують також гетеродинні вимірювання.
Зазвичай забруднювачі мають характерні лінії поглинання в ІЧ області спектра, тому найбільш часто використовуються лазерні спектрометри на основі інжекційних і молекулярних СО і С02 лазерів, що забезпечують необхідну перебудову в діапазоні 2,5-46,2 мкм.
З інжекційним лазером поріг виявлення таких забруднювачів повітря, як SO2, N20, NH3 і N02, знаходиться в межах від 1 ррb до 10 ppt, а для НСl - 0,1 ppm, HF - 0,5 ррш. Можна визначати зміст HCN, Н20, СН4, С2Нв в сигаретному димі, а також вміст токсичних
домішок у вихлопних газах автомобілів, наприклад бензолу, на рівні 1 ppm [П. 42]. Для С02 лазера з дискретної перебудовою частоти вимірювання при атмосферному тиску методом диференціального поглинання (зондування атмосфери на двох довжинах хвиль) дають поріг виявлення типових органічних молекул забруднювачів порядку 2,5-10-7-5,5 * 10-5% на одному кілометрі [ П. 40].
Біологічні об`єкти здебільшого представляють собою конденсовані середовища - рідини або тверді тіла. Лінії поглинання таких середовищ значно розширені, тому в принципі не потрібна висока ступінь монохроматичности лазерного випромінювання. Однак лазери і в цих випадках виявляються дуже корисними. По-перше, вузька лінія їх випромінювання дозволяє відбудовуватися від центру лінії поглинання середовищ з високою оптичною щільністю і тим самим забезпечувати лінійну залежність поглинання від концентрації. По-друге, висока спектральна яскравість лазерів дозволяє проводити вимірювання поглинання в оптично щільних зразках. Наприклад, для інжекційних лазерів Dmax = (a /) max «12 [П. 42].
Біологічні середовища - це оптично неоднорідні середовища, тому вони, як правило, сильно розсіюють світло. Ця обставина значною мірою ускладнює або навіть унеможливлює вимір спектрів пропускання, викликає необхідність переходити до інших способів вимірювання спектрів поглинання. При наявності розсіювання коефіцієнт а (А,) з (5.1), (5.2) має вже значення коефіцієнта ослаблення і визначається концентрацією не тільки поглиначів, а й розсіювачів на шляху лазерного пучка. Вирази (5.1) і (5.2) зберігають свою форму, проте а = Ст0. Ефективний переріз ослаблення враховує як поглинання, так і розсіяння:
Сферичний радіуса а
коефіцієнти Qn і Qp в загальному випадку визначаються на підставі теорії Мі. Максимальне значення цих коефіцієнтів досягається при і становить 1-5 [П. 40]. При наявності багатьох компонентів, які поглинають і розсіюють світло, що також характерно для біосистем, (5.2) має вигляд
де а0 * = стпг + огрг, Nt - концентрація частинок t-ro компонента.
Очевидно, що в таких умовах у рамках спектрофотометрической методики поглинання вже не може бути визначено без залучення характеристик розсіювання. Для порівняно прозорих середовищ використовують комбіновані методики, в основі яких лежить вимір спектрів дифузного відбиття біооб`єктів і спектрів пропускання. Наприклад, при дослідженнях параметрів крові (визначення процентного вмісту кисню в цільної крові, концентрації загального (тотального) гемоглобіну крові, концентрації метагемоглобін) представляє великий інтерес метод, який використовує вимір дифузного коефіцієнта відображення Rn і відносного пропускання шарів крові двох товщин Т12 [2, 3] . В цьому випадку показник поглинання одиничної товщини
де / 2 і / х - товщини двох слоев- у - параметр, який визначається за измеряемому коефіцієнту відображення
Лазери досить успішно використовуються для діагностики різних захворювань, хоча поки лазерні методи не набули належної популярності. В [П. 39] представлений короткий огляд методів медичної діагностики, написаний в основному за матеріалами зарубіжних патентів, багато з яких використовують абсорбції або комбіновані методики вимірювань. Наприклад, пропонується простий і швидкий спосіб підрахунку еритроцитів і тромбоцитів, заснований на вимірюванні інтенсивності минулого і розсіяного світла на довжинах хвиль сильного поглинання еритроцитів (415 або 540 нм). Частинки крові проходять по одній через область, освітлювану випромінюванням. Як джерела світла може бути взятий або лазер на барвниках, або Ат лазер з А = 413,1 нм. Перспективний для цих цілей і Нє - Ne лазер з , = 543,3 нм.
Можна реалізувати підрахунок і класифікацію частинок крові за розміром і їх життєздатності при вимірах інтенсивності поглиненого часткою випромінювання Нє - Ne лазера з , = 632,8 нм. З використанням цього лазера можна також визначати концентрацію життєздатних тромбоцитів в пробі крові, призначеної для переливання. Огляд оптичних методів і пристроїв для рахунка часток, в тому числі і біологічного походження, зважених
в рідких середовищах, дан в [П. 48]. Розглянуто методи, засновані на поглинанні і розсіянні світла, а також тіньові і дифракційні.
Вміст кисню, вуглекислого газу, окису вуглецю та інших речовин, включаючи різні продукти метаболізму (сечовина, глюкоза, етиловий спирт, поліпептиди та ін.), Розчинених у крові людини, є найважливішою інформацією про життєво важливих процесах, що відбуваються в організмі. Вимірювання ступеня насичення крові киснем засноване на значні зміни в спектрах поглинання насиченою і не насиченої киснем крові.
З даних табл. 1.1 випливає, що зменшення насиченості крові киснем призводить до майже триразовому зростанню коефіцієнта поглинання поблизу А = 620 нм. Звідси випливає простий метод оцінки вмісту кисню в крові при використанні самого доступного Чи не - Ne лазера з Л = 632,8 нм. Однак точні вимірювання з похибкою 1-5% можуть забезпечити тільки більш складні методики [2, 3], що використовують вимір як минулого, так і дифузно відбитого світла на кількох довжинах хвиль, включаючи ізобестіческую довжину хвилі Х = 805 нм, для якої коефіцієнти поглинання насиченою і не насиченої киснем крові збігаються (табл. 1.1).
Переваги лазерів в повній мірі розкриваються при вимірюванні концентрації розчинених в крові газів і продуктів метаболізму безпосередньо через шкіру людини [П. 39]. Метод заснований на тому, що окис вуглецю, кисень, вуглекислий газ і різноманітні органічні речовини добре поглинають в ІЧ області спектра, де працюють перебудовувані СО, С02 і інжекційні лазери. Наприклад, для крові з великим вмістом СО, С02 і 02 максимуми поглинання спостерігаються на довжинах хвиль 4,3 5,13 і 9 мкм. Для глюкози характерні лінії поглинання знаходяться на 2,8- 4,8 і 6,1 мкм.
Техніка вимірювань може бути різною. Можна вимірювати коефіцієнт пропускання тонкого шару тканини в області між великим і вказівним пальцями людини, у вушній раковині і т. Д. Або використовувати пластинку повного внутрішнього відображення, по якій пропускається світло (5 відображень) і яка прикладається до досліджуваного об`єкта (шкіра, мова і пр.). При дослідженні внутрішніх органів можна використовувати волоконно-оптичний катетер. Для визначення кількісного вмісту зазначених речовин в крові необхідна попередня калібрування пристроїв за допомогою еталонних проб. Точність істотно залежить від стабільності випромінювання лазерів. Багато із запропонованих пристроїв можуть бути використані і в лабораторній діагностиці проб крові та інших біологічних рідин, наприклад сечі.
Вимірювання коефіцієнтів відбиття биотканей в процесі їх коагуляції необхідно для контролю термохімічних процесів у вогнищі коагуляції, що визначають кінцевий результат впливу. Такий контроль, зокрема, застосовують в офтальмології для коагуляції тканин очного дна 14]. Виявлено, наприклад, сильне збільшення відображення випромінювання на = 441,6 нм від тканин очного дна при коагуляції сітківки випромінюванням аргонового лазера (514,5 нм).
Спеціально для медичних застосувань розроблені лазерні біофотометри, призначені для визначення відбитої, поглиненої і пройшла енергії біотканямі поверхневих і внутрішніх органів [П. 28, П. 37]. У поєднанні з перебудованого лазера (або набором лазерів різних довжин хвиль), волоконно-оптичними пристроями каналізації випромінювання і обробкою результатів вимірювань на ЕОМ такі фотометри виявляться корисними для діагностики патологічних тканин у багатьох розділах медицини (наприклад, стоматології, офтальмології та ін.).
При дослідженні оптично щільних біологічних зразків єдиним інформативним параметром залишається коефіцієнт дифузного віддзеркалення, який несе інформацію про спектр поглинання речовини. Прикладами таких досліджень є експресні методи аналізу біологічної цінності зерна різних сільськогосподарських культур, успішно реалізовані в пристроях з тепловими джерелами, в яких селекція по довжинах хвиль здійснюється за допомогою набору вузькосмугових фільтрів [5]. Зондування зразка (цілого, розмеленого зерна (шроту або борошна)) на характерних довжинах хвиль в діапазоні 1,5-2,5 мкм при відповідній калібрування і математичної обробки результатів на ЕОМ дозволяє визначати вміст в ньому білка, жиру і вологи.
Калібрування, що є найбільш трудомісткою частиною методики, полягає у встановленні кореляційної залежності між спектром аналізованого компонента і спектром відображення цілого і розмеленого зерна з подальшим перебуванням функціональної залежності змісту компонента, що визначається хімічним шляхом і з спектрів відбиття на окремих довжинах хвиль. Калібрування проводиться на великому масиві зразків (30-60). Типові значення коефіцієнтів кореляції на робочих довжинах хвиль для різних культур лежать в діапазоні 0,78- 0,99. Середньоквадратичне похибка спектрофотометрического аналізу зазвичай становить 10-25% при вірогідності 90-98%. Аналогічні дослідження у видимій області (410-500 нм) дозволяють визначати вміст каротиноїдів в крупці пшениці (середньоквадратичне похибка 24% при вірогідності 90%, коефіцієнт кореляції 0,9).
Застосування лазерів в рамках даної методики, крім збільшення відносини сигнал / шум, має забезпечити високу локальність аналізу, аж до дослідження окремого зерна і навіть окремих малих областей цілого зерна, що можна використовувати в селекційній роботі при розбракуванню насіння.
