Взаємодія лазерного випромінювання з біологічними системами - лазерна діагностика в біології та медицині

Глава 1
Загальні відомості про лазери,
ОБЛАСТЯХ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ В БІОЛОГІЇ ТА МЕДИЦИНІ
У цьому розділі коротко обговорені загальні закономірності взаємодії світла з біологічними сістемамі- проаналізовані властивості лазерного випромінювання і особливості його взаємодії з біологічними об`ектамі- розглянуті принципи лазерної терапії, хірургії та діагностікі- наведені найбільш типові приклади із зазначених областей застосування лазерів. Представлені також відомості про принципи роботи та параметрах лазерів і лазерних систем. На закінчення обговорені питання техніки безпеки при роботі з лазерами.
Особливості взаємодії лазерного випромінювання
з біологічними системами
Загальні принципи і закономірності взаємодії світла з біооб`єктами. Застосування лазерів в біології та медицині засновано на використанні широкого кола явищ, пов`язаних з різноманітними проявами взаємодії світла з біологічними об`єктами [П. 1, П. 26, П. 33]. Лазерне випромінювання, так само як і звичайний світло, може відображатися, поглинатися, розсіюватися, перєїзлучать біологічної середовищем, і кожен з цих процесів несе інформацію про мікро- і макроструктуру цього середовища, русі і формі окремих її складових. Відомий і УФ світло можуть надавати фотобіохіміческое дію. Яскравими прикладами цього є фотосинтез рослин і бактерій, а також механізм зору [П. 1 - П. 3, 1]. Високоінтенсивне світлове випромінювання УФ, видимого та ІЧ діапазонів довжин хвиль завдає руйнівної (деструктивне) дію на біологічні об`єкти. Необхідні інтенсивності можна створити і не тільки за допомогою лазерів. Існують, наприклад, фотокоагулятор тканин ока на основі потужних ксенонових ламп [П. 22, П. 32].
Таким чином, процеси, що характеризують види взаємодій лазерного випромінювання з біооб`єктами, можна розділити на три групи. До першої відносяться всі невозмущающіе взаємодії (по крайней мере, в межах похибок вимірювань не роблять помітного впливу на біооб`єкт), до другої - процеси, в яких проявляється фотохімічні дію, і до третьої - процеси, що призводять до фоторазрушенію. На схемі 1 представлена класифікація основних принципів застосування лазерів в біології та медицині, що враховує зазначені групи процесів.
Оскільки ми маємо справу з живими об`єктами, то крім фізико-хімічних проявів дії лазерного випромінювання необхідно враховувати його вплив і на функціонування живої матерії [П. 34, 1]. Его вплив визначається ступенем гомеостазу живого об`єкта. Ступінь гомеостазу характеризує стану і процеси, що забезпечують стійкість організму до зовнішніх збурень, вона є функцією еволюційного розвитку і виявляється найнижчою у біологічних молекул і найвищої у хребетних тварин. Світло малої інтенсивності не ініціює адаптаційні механізми біосистеми. У міру зростання інтенсивності спочатку порушується гомеостаз живої системи на локальному рівні, потім включаються загальні адаптаційні і регуляційні механізми системи, повністю її відновлюють, далі вони вже не справляються з повним відновленням і частково відбуваються незворотні процеси, які наростають і призводять до руйнувань в системі. Однак об`єкт можна ще вважати «живим». При високих інтенсивностях руйнування виявляються настільки значними, що об`єкт уже не може вважатися «живим».
З точки зору застосування фізичних методів дослідження найбільший інтерес представляють області дуже малих і дуже великих інтенсивностей. У першій з них можливе застосування ряду найбільш чутливих фізичних методів дослідження, які не потребують сильних світлових потоків і, отже, не вносять перекручувань в результати вимірювань за рахунок гомеостазу живої матерії навіть на локальному рівні. Друга область цікава тим, що результати вимірювань також виявляються неспотвореними за рахунок регуляторних механізмів біосистеми, оскільки вона вже «нежива».

1. Класифікація основних принципів застосування лазерів в біології та медицині

Однак дослідник в цьому випадку має справу лише з органічною матерією, склад і властивості якої відповідають моменту припинення життєдіяльності.
Для взаємодії світла з біологічними об`єктами виявляється важливою і тривалість опромінення. У цьому також може проявити себе гомеостазная природа живої матерії. Залежно від довжини хвилі і інтенсивності світла гранична тривалість опромінення, при якій починають відбуватися морфологічні зміни, може бути дуже різною для одного і того ж об`єкта. При цьому в залежності від періодичності світлових імпульсів можливі резонансні явища, оскільки відомо, що період коливань фотооткліка біологічних систем змінюється в межах від 10-8 до 10 + 8 з [П. 34, 1].
Поглинання світла є однією з характеристик ефективності взаємодії світла з досліджуваним біологічним об`єктом. Спектри поглинання біооб`єктів визначаються типом домінуючих поглинаючих центрів, так званих хромофоров, і що міститься в них водою.

Мал. 1.1. Залежність частки світлової енергії ДЕ / Е, поглиненої кровенаполненной біотканиною товщиною 1 мм, від довжини хвилі [2]
У білків хромофорами є різні залишки амінокислот, які поглинають в УФ області (А, = 200-300 нм), нуклеїнові кислоти також поглинають в цій області. Поглинання видимого випромінювання обумовлено такими биомолекулами, як гемоглобін, хлорофіл, флавін, каротиноїди, фікобіліни і фітохром [П. 71.
Як приклад на рис. 1.1 показаний спектр поглинання типовою кровенаполненной біологічної тканини товщиною 1 мм [2]. Світло з довжинами хвиль 0,6-1,5 мкм відносно слабко поглинається і досить глибоко проникає в біотканини. Наприклад, випромінювання з А, = 1,06 мкм проникає на глибину в 1 см. Однак в спектральному діапазоні 2-12 мкм через поглинання води, що міститься в биоткани, світло слабо проникає в глиб тканини. В області довжин хвиль 4-6 мкм глибина проникнення порядку 100- 150 мкм, а в області 7-12 мкм порівнянна з довжиною хвилі світла. На = 0,45-0,50 мкм поглинання визначається гемоглобіном крові, а в УФ діапазоні багато биоткани сильно поглинають за рахунок містяться в них білків.
Таблиця 1.1
Коефіцієнти поглинання а деяких биотканей на окремих довжинах хвиль X [П. 26, П. 32, 3)

Коефіцієнти поглинання деяких биотканей на окремих довжинах хвиль представлені в табл. 1.1, вони лежать в межах 10"1-104 см-1.
Слід зазначити, що тканини передньої частини ока є у видимій області надзвичайно прозорими і поглинання в них дуже мало [П. 32, П. 35, 4]. У той же час спектр пропускання в області коротких довжин хвиль визначається світлорозсіювання. Розсіювання світла біооб`єктами - це одне з найхарактерніших для них явищ. Воно пов`язане зі структурою біосистем, які, як правило, складаються з великого числа випадково розподілених в об`ємі розсіюючих центрів (виняток становлять лише деякі типи тканин, наприклад прозорі тканини ока, в яких ця структура впорядкована (гл. 2)).
Для багатьох типів біотканин в УФ та ІЧ діапазонах довжин хвиль переважає поглинання, а розсіювання виявляється істотним у видимій та ближній ІЧ областях: для довжин хвиль 0,45-0,59 мкм поглинання і розсіяння дають приблизно рівні внески в коефіцієнт пропускання тканини, а для довжин хвиль 0,59-1,5 мкм розсіювання превалює над поглинанням [5].
Важливою оптичної характеристикою біооб`єкту є також коефіцієнт відображення. Наприклад, для більшості внутрішніх органів тварин коефіцієнт відображення на окремих довжинах хвиль у видимій та ближній ІЧ областях становить 10-30%, шкірний покрив людини відображає у видимій області 10-60% світлової енергії, а коефіцієнт відбиття очного дна людини змінюється від 2 до 20 % при зміні довжини хвилі від 0,4 до 1,0 мкм [П. 26, П. 35, 61. Відображення обумовлено як стрибком показника заломлення на кордоні біооб`єкт - повітря (Френелевскую відображення, зазвичай 4-5%), так і зворотним розсіюванням від глибинних шарів тканини. При цьому на глибині 4-5 мм, що дорівнює приблизно трьом оптичним толщинам тканини, коллімірованний лазерний пучок дає сферично симетричним, близьке до ізотропному випромінювання [5].
Слід зазначити, що характер відображення, поглинання, розсіювання і флуоресценції біооб`єкту можна ефективно змінювати різноманітними штучними прийомами. Наприклад, фарбуванням можна змінювати спектри відображення і поглинання. Такі біооб`єкти називаються сенсибілізованими, т. Е. Їх чутливість до світла змінена. Сенсибілізацію біологічного матеріалу широко використовують при вивченні механізмів взаємодії світла з окремими компонентами цього матеріалу, а також в практичній біомедицині для діагностики та селективної фотодеструкции окремих компонентів біооб`єкту.
Для м`яких кровонаповнення біологічних тканин можна істотно, до 40 разів, збільшити їх пропускання за рахунок несильного здавлювання [7]. «Просвітлення» живий
тканини пов`язано з підвищенням її оптичної однорідності за рахунок ущільнення розсіюючих центрів (колагенових волокон м`язової тканини) і витіснення крові з області натискання, що сприяє підвищенню показника заломлення базового речовини, який стає порівняємо з пoкaзaтeлeм заломлення м`язової тканини [4]. Вирівнювання показників заломлення светорассеивающих центрів і базового речовини можна здійснити і за рахунок введення в тканину відповідних препаратів. Таке «просвітлення» склери ока описано в [41.
Властивості випромінювання і особливості його взаємодії з біологічними системами. Традиційна фотобіологія з використанням звичайних (теплових) джерел світла досить успішно розвивалася протягом багатьох років (є свідчення про те, що ще в Давньому Єгипті та Індії тисячі років тому застосовувалася фототерапія за допомогою сонячного світла та лікарських препаратів, виготовлених з фруктів і рослин) з виходом в практичну фотомедицини за трьома головними напрямами: діагностика, терапія та хірургія [П. 19, П. 22, П. 34, 81. Багато чого було зроблено для розуміння процесів фотосинтезу рослин і бактерій, з`ясування природи зору, фотоперіодичних явищ тощо. За допомогою цих джерел світла [П. 1, П. 2, П. 12, 1, 9]. Поява принципово нового інструменту - лазера підняло всі ці дослідження і додатки на новий, більш високий рівень, стимулювало постановку і успішне вирішення таких проблем, які раніше або зовсім не ставилися, або вирішувалися непрямим шляхом.
Перш ніж обговорювати особливості взаємодії лазерного випромінювання з біологічними об`єктами і ті нові можливості, які воно дає в фотобиологии і фотомедицини, необхідно розглянути властивості лазерного випромінювання і їх принципові відмінності від властивостей випромінювання теплових некогерентних джерел світла (ламп розжарювання, дугових ламп, Сонця та ін. ).
Нагадаємо, що лазер являє собою генератор оптичних коливань, який використовує енергію індукування випромінюючих атомів або молекул в середовищах з інверсної заселеністю рівнів енергії, які мають властивість посилювати світло певних довжин хвиль [10- 13]. В якості зворотнього зв`язку в лазерах використовують дзеркала, які утворюють оптичний резонатор і забезпечують достатню кількість проходів світлового пучка через посилює середу, щоб все втрати світла в системі
були компенсовані за рахунок посилення активного середовища. На рис. 1.2 схематично показано пристрій лазера, що включає відображають дзеркала і активний елемент, в якому за рахунок різних способів накачування створюється активне середовище.

Мал. 1.2. Схема пристрою лазера (праворуч показано розподіл інтенсивності в лазерному пучку)
При зазначених умовах в лазері виникає генерація, спектр якої показаний на рис. 1.3, т. Е. Лазер випромінює кілька хвиль, що відрізняються частотою та інтенсивністю, це так звані подовжні моди лазера.
Звичайний (теплової) джерело світла відрізняється від лазера тим, що основний внесок у випромінювання дають спонтанні переходи, в системі відсутні інверсія і оптична зворотний зв`язок.

Мал. 1.3. Спектр поздовжніх мод лазера
Все це призводить до істотних відмінностей у властивостях лазерних і нелазерних джерел світла. Лазерні джерела мають високий ступінь монохроматичности (тимчасової когерентності), просторової когерентності, спрямованості, поляризованности, інтенсивності і яскравості, надкоротких тривалістю імпульсів і перестраіваемость довжини хвилі випромінювання.
Монохроматичність або висока спектральна щільність потужності (інтенсивності) випромінювання, або знача-
кові тимчасова когерентність лазерного випромінювання забезпечують, по-перше, проведення спектрального аналізу з дозволом, на багато порядків перевищують дозвіл традиційних спектрометров- по-друге, високий ступінь селективності порушення певного сорту молекул в їх суміші, що дуже важливо саме в біологіі- по-третє , дозволяють, * реалізовувати голографічні і інтерферометричні методи діагностики біооб`єктів.
Ступінь монохроматичности одномодового газового лазера визначається шириною лінії генерації fiv цієї моди, яка обумовлена квантовими флуктуаціями, вібраціями, акустичними шумами, плазмовими коливаннями в активному середовищі і т. Д. І становить величину від десятків герц до десятків мегагерц [14].
Висока монохроматичность визначає значну спектральну щільність випромінювання. Наприклад, для лазера з вихідною потужністю Р = 1 Вт, 6v = l МГц, радіусом пучка W-2 мм і А, = 500 нм спектральна щільність потужності, що падає на одиницю поверхні, дорівнює 2,6 X X107 Вт / (нм -см2 ). Для порівняння, аналогічна величина для сонячного випромінювання дорівнює 1,3 -10-4 Вт / (нм-см2).
Для імпульсних лазерів ширина лінії обмежена тривалістю імпульсу ти, 6v «1 / t&bdquo- і може становити досить значні величини для лазерів з короткою тривалістю імпульсів (6v »l ГГц для т&bdquo- = 10-у с).
Залежно від розв`язуваних завдань і конкретних умов вимірювань для лазерів, що працюють на багатьох модах, можна забезпечити різну ступінь монохроматичности. З одного боку, окрема мода практично зберігає свою високу монохроматичность (вузьку ширину лінії 6v), а з іншого - мод стає багато і їх спектр займає вже ширину AvivNc / 2nL, де N - число поздовжніх мод, c / 2nL - частотне відстань між ними , яке визначається оптичної довжиною резонатора nL, з - швидкість світла, п - показник заломлення активного середовища (рис. 1.3).
Зміни в ступені монохроматичности знаходять відображення і в тимчасовій когерентності такого джерела, т. Е. Його здатності утворювати чітку інтерференційну картину при відповідної тимчасової затримки складаються світлових пучків. Зручно тимчасову [когерентність характеризувати довжиною когерентності
Для одномодових лазерів довжина когерентності може бути надзвичайно великий - 3 -108-3 * 10? см, що перевершує типові потреби біологічних і медичних досліджень.

Лазери характеризуються високим ступенем поляризованности випромінювання. У цьому виявляються когерентні властивості їх випромінювання. Однак вид поляризації (лінійна, кругова, еліптична) у різних лазерів може бути різним. У більшості випадків це пов`язано з властивостями оптичного резонатора. Резонатори з брюстеровскімі віконцями розрядної трубки або внутрішніми призмами мають стійку лінійну поляризацію. Для промислових лазерів з лінійною поляризацією ступінь поляризованности, т. Е. Ставлення інтенсивностей світла при взаємно ортогональних положеннях поляризаційного аналізатора, / ц: / х = 500: 1. При цьому для лазерів з малим посиленням квантові і технічні флуктуації практично не призводять до деполяризації випромінювання [14].

Інший клас часто використовуваних резонаторів лазерів - це ізотропні резонатори. Наприклад, промисловість випускає лазери з внутрішніми дзеркалами. Висока якість дзеркал таких лазерів забезпечує ідеальну кругову поляризацію випромінювання, / ц: /j.=l: 1. Однак ступінь поляризації (азимут і еліптичності) у цих лазерів виявляється більш чутливою до збурень, ніж в разі сильно анізотропних резонаторів [14].
Передача лазерного випромінювання по волоконних световодам круглого перетину призводить до деполяризації випромінювання за рахунок збудження багатьох хвилеводних мод. Залежно від типу світловода довжина, на якій відбувається повна деполяризація випромінювання, змінюється від декількох десятків сантиметрів до кількох метрів. Порівняно широкі медичні світлопроводи з діаметром серцевини 400-1000 мкм мають малу довжину деполяризації (кілька десятків сантиметрів). Розроблено спеціальні одномодові анізотропні світлопроводи (наприклад, з еліптичних перетином серцевини), які зберігають стан поляризації на відстанях в декілька сотень метрів, однак поперечні розміри серцевини таких світловодів надзвичайно малі, 5-7 мкм, тому існує проблема введення випромінювання.
Надзвичайно висока інтенсивність лазерного випромінювання дозволяє сконцентрувати в малому обсязі значну світлову енергію, тим самим викликати многофотонние і інші нелінійні процеси в біологічному середовищі, локальний тепловий нагрів, швидке випаровування, гідродинамічний вибух і т. Д.
Вище вже наводився ряд прикладів, що ілюструють високу інтенсивність лазерних пучків. Однак з точки зору програм не здійснює інтенсивність, а яскравість є найбільш важливим параметром будь-якого джерела, в тому числі і лазерного. Яскравість В визначається як потужність, що припадає на одиницю площі і одиницю тілесного кута, або інтенсивність в одиниці тілесного кута. Для пучка кругового перетину радіусом w (0), расходимостью 0 і повною потужністю Р яскравість

або з урахуванням (1.1) для лазерних пучків В = Р / Х2 Вт / (см2 -ср), де ср - стерадіан - одиниця тілесного кута.
Інтенсивність, яку можна отримати в фокусі лінзи, виявляється тим більше, чим більше яскравість пучка. Оптична обробка пучка за допомогою системи лінз і інших оптичних елементів, як правило, не може збільшити яскравість, оскільки стиснення пучка завжди супроводжується збільшенням його розбіжність.
Властивість перестраіваемость довжини хвилі лазерного випромінювання в сукупності з його надзвичайної монохроматичністю дозволяє використовувати лазери як спектрометрів ультрависокої дозволу. В принципі будь-лазер допускає перебудову частоти (довжини хвилі). Правда, для одних лазерів вона може бути тільки дискретної з дуже вузьким діапазоном поблизу дискретних довжин хвиль, а для інших безперервної в досить широкому діапазоні довжин хвиль. Наявність перебудовуються лазерів у всій області від УФ до ГИК дозволяє селективно порушувати практично будь-які стани біомолекул і окремих її фрагментів.
Обговорюючи властивості лазерного випромінювання, не можна не звернути увагу на одну важливу для застосування властивість - здатність формувати спекл-картину при відображенні від шорсткою поверхні. Розсіяний цією поверхнею світло складається з хаотичного скупчення темних і світлих плям (спеклів). Причина цього явища полягає у високій когерентності лазерного випромінювання, і воно обумовлено складною інтерференцією вторинних хвиль від невеликих розсіюючих центрів, розташованих на поверхні об`єкту. Оскільки біооб`єкти в більшості своїй шорсткі, то вони завжди повинні формувати спекл-картину і в цьому сенсі вносити деякі спотворення в результати досліджень. З іншого боку, спекл-поле несе інформацію про властивості поверхні біооб`єкту, що можна використовувати, наприклад, в діагностичних цілях.
Якщо спекл-картина спостерігається на досить віддаленому від об`єкта екрані, то середній діаметр зерна (спекла) визначається співвідношенням dttMlw, де I - відстань від об`єкта до екрану, w - радіус лазерного пучка на об`єкті [13].
Принципи лазерної діагностики, найбільш типові приклади. Ця книга цілком присвячена лазерної діагностики в біології та медицині. У наступних розділах будуть розібрані найбільш цікаві методи неруйнуючої діагностики, оцінені їх можливості і перспективи. Тут, у вступній главі, визначені як основні принципи та наведено деякі з найбільш яскравих прикладів [П. 33]. Як уже зазначалося, методи лазерної діагностики діляться на мікродіагностіческіе (на рівні атомів і молекул) і макродіагностіческіе (на рівні клітин і органів). Мікродіагностікаявляє використовує всі засоби лінійної і нелінійної лазерної спектроскопії, а макродіагностіка - методи пружного і квазіпружного розсіювання, интерферометрию і голографію.
Традиційно, спектральний аналіз широко застосовується в біології для аналізу, наприклад, слідів концентрацій речовин при вивченні метаболізму живих організмів і в токсикології. Однак нелазерні джерела світла дозволяють в кращому випадку забезпечити детектування сигналу від 1010 атомів або молекул одного сорту. З використанням лазерів вдається реалізувати надчутливі методи, що дозволяють детектувати навіть окремі атоми або молекули, проводити атомний аналіз безпосередньо на реальних об`єктах, не вдаючись до їх попередньої підготовки. Одним із прикладів є метод прямої резонансної фотоіонізації, успішно застосованої до визначення слідових концентрацій алюмінію в крові людини [П. 42].
Поєднання резонансної фотоіонізації молекул з традиційною мас-спектрометрією дозволяє істотно підвищити чутливість і отримувати її для випадку визначення вмісту триптофану в воді на рівні 10&ldquo-14 м
Лазерна спектроскопія виявляється особливо ефективною при дослідженні забруднень навколишнього середовища (флори і фауни, харчових продуктів і ін.) Токсичними і патогенними речовинами і аналізі шляхів їх проникнення в людський організм. Навіть порівняно простий флуоресцентний аналіз в комбінації з хроматографією при використанні лазерів виявляється дуже чутливим. Лазерно-флуоресцентна спектроскопія із застосуванням сенсибілізаторів патологічних тканин, наприклад похідних гематопорфірину, виявляється дуже ефективною при ранній діагностиці ракових та інших захворювань [П. 36].
Оптико-акустична спектроскопія має свої особливі переваги при дослідженні біологічних об`єктів, головне з яких полягає в малому вплив розсіювання на результати вимірювання спектрів поглинання, що дуже важливо для неоднорідних за структурою біологічних середовищ 1П. 23, П. 41]. Лазерне збудження забезпечує і тут висока спектральний дозвіл, локальність і дистанционность аналізу, можливість використання волоконної техніки.
Жорстка фокусування потужних лазерних пучків використовується в цілому ряді методик, що реалізують мікро спектральний аналіз біологічних об`єктів. Лазерний відбір мікропроб з поверхні біооб`єкту шляхом випаровування мікрообсягу речовини (1 мкм *) з подальшим мас спектральним аналізом цього пара лежить в основі лазерної мікроаналітичних мас-спектроскопії (Елої-метод) і промислових лазерних мас-аналізаторів [П. 42, П. 47].
Існують і руйнівні методи мікроспектрального аналізу біооб`єктів, наприклад лазерна мікро- флуориметр окремих живих клітин або органел [П. 7]. Просторове і тимчасовий дозвіл методу становить, відповідно, 0,3 мкм і 0,2. Він може бути корисний при флуоресцентного картировании генів. Для прямого спостереження первинної структури ДНК може виявитися найбільш підходящим комбінований метод, що поєднує селективну лазерну іонізацію молекул хромофоров з іонно-польовий мікроскопією. Ізото--селективне детектування окремих атомів може бути використано для аналізу шляхів метаболізму живих організмів in vivo *) в тому числі на клітинному рівні.

* На живому (лат.).

Лазерні імпульси пикосекундной і субпікосекундной тривалості знайшли найширше застосування для вивчення первинних процесів фотосинтезу, зору і біохімічних реакцій за участю гемоглобіну, ДНК і інших біологічно важливих молекул [П. 1 - П. 3]. Ультрашвидкі процеси є характерними для біології, причому для одного і того ж об`єкта часи фото- фізичних і фотохімічних процесів можуть займати дуже широкий діапазон, наприклад, для гемоглобіну 10-6- 10-16 з [П. 24]. Дослідження цих процесів вимагають застосування імпульсних лазерів і нових методик спектроскопії, включаючи спектроскопію комбінаційного розсіювання (КР) в наносекундному і пикосекундной діапазонах, швидкодіючі абсорбція методи в тимчасовому масштабі від наносекунд до фемтосекунд і пикосекундной флуоресцентну спектроскопію [П. 1].
Отримало розвиток і такий напрямок в діагностиці, як дистанційне лазерне зондування біологічних об`єктів (фітопланктону] і нафтових забруднень водних середовищ, біологічно активних домішок в атмосфері, наземної рослинності та ін.), Засноване на КР і флуоресцентної спектроскопії [П. 16, П. 17].
В основі біомедичної макродіагностікі лежить використання високої монохроматичности і когерентності лазерного випромінювання, яка дозволяє вимірювати положення, швидкість, малі переміщення і форму різних компонентів біологічних об`єктів. Зауважимо, що більшість з перерахованих нижче прикладів в принципі не може бути реалізовано за допомогою теплових джерел світла.
Одним з перших ефективних застосувань лазерів в біомедицині була прольотна цитометрия, коли лазер був застосований для прискорення аналізів і сепарації окремих клітин ссавців за рахунок точних вимірювань їх оптичних властивостей - характеристик викликаної лазером флуоресценції [16]. Цитофлуориметрії першого покоління на основі Аг лазерів з = 488 нм випускаються промисловістю. Готуються до випуску цитофлуориметрії другого покоління на основі більш короткохвильового Чи не - Cd лазера з = 441,6 нм.
Інший не менш ефективне застосування лазерів - це лазерна анемометрія, яка полягає в вимірі малих швидкостей руху біологічних рідин (наприклад, швидкості кровотоку в судинах, рухливості бактерій, сперматозоїдів і ін.). Цей метод заснований на вимірюванні доплерівського зсуву частоти випромінювання лазера, який виникає при зворотному розсіянні світла від рухомих частинок мікронного розміру.
Голографія і интерферометрия є потужними засобами діагностики взагалі і біомедичної зокрема. Голографічні методи дозволяють отримувати тривимірні зображення біооб`єктів, контури цих об`єктів можуть бути картіровани, а їх деформації проаналізовані в реальному масштабі часу. Ці нові можливості можуть вплинути на розвиток багатьох розділів медицини: ортопедію, радіологію, офтальмологію, урології та отології. Великі потенційні можливості в цьому сенсі має класична интерферометрия при використанні лазерних джерел (наприклад, при створенні ретінометров - пристроїв для визначення ретинальной гостроти зору), а також спекл-интерферометрия (наприклад, для визначення структури і шорсткості деяких биотканей).
Пружне розсіяння при використанні лазерних джерел світла в поєднанні з повним аналізом поляризаційних характеристик індикатриси розсіяння дозволяє ефективно вивчати слабопоглощающіе анізотропні двокомпонентні биоткани, наприклад тканини ока [17]. Пружне светорассеяніє виявляється також ефективним у ряді задач імунології, вірусології та гематології. Застосування лазерів в цих дослідженнях дозволяє істотно спростити вимірювання і підвищити їх надійність.
Обговорюючи проблеми лазерної діагностики, не можна залишити поза увагою дві інші області біомедичних застосувань лазерів: лазерну терапію і хірургію, хоча б тому, що, проводячи діагностику, необхідно знати, які наслідки можуть мати місце, якщо рівні потужності і дози лазерної засвічення відповідають терапевтичним або хірургічним. Як і раніше, при викладі будемо в основному слідувати роботі [П. 33].
Фізико-хімічні основи лазерної терапії, типові приклади. В основі лазерної терапії лежить управління біохімічними процесами за допомогою світла, який збуджує біомолекули. Збуджена молекула або сама бере участь в хімічній реакції, або передає своє збудження іншої молекули, що бере участь в хімічних перетвореннях. Розрізняють однофотонні збудження (малі інтенсивності світла - лінійна фотобіологія) і многофотонной (великі інтенсивності - нелінійна фотобіологія), коли молекула може поглинути більш ніж один фотон.
Однофотонні, фотобіохіміческіе процеси, що лежать в основі фототерапії або фотохіміотерапії жовтяниці новонароджених (надлишкової билирубинемии), різних захворювань шкіри [8], а також раку [П. 36], добре відомі в фотобиологии. Фотохіміотерапія раку при використанні похідних гематопорфірину (ПГП) є класичним прикладом. При введенні в організм молекули ПГП мають тенденцію накопичуватися в клітинах патологічних тканин. Один з можливих механізмів, що лежать в основі терапії, полягає в наступному. Молекули ПГП добре порушуються видимим світлом і передають це збудження через триплетні стану молекул кисню, присутнім в тканинах. У свою чергу молекули кисню порушуються в синглетний стан, яке є хімічно активним і руйнує клітини. Цей процес називають фотодинамічним ефектом.
Розглянуті процеси можливі при порівняно малих інтенсивностях світла (близько 1 Вт / см2), які можна отримати від нелазерних джерел світла. Проте застосування лазерів дало новий досить істотний поштовх у розвитку фотодинамічної терапії, оскільки завдяки високій спектральної інтенсивності, просторової когерентності і малої розбіжність їх випромінювання виявилося можливим забезпечити значну селективність впливу і ефективну доставку випромінювання до важкодоступних тканин за допомогою волоконних світловодів.
Терапія за допомогою червоного світла (gt;. = 632,8 нм) Ні - Ne лазера знайшла широке застосування для лікування трофічних і довго не гояться ран і виразок (наприклад, [П. 25]). Часто терапевтичний ефект червоного лазерного світла пов`язують з його когерентністю або високою полярізованностио. Однак ці аргументи видаються неспроможними тільки з тієї причини, що при використовуваних интенсивностях швидкість збудження молекул виявляється в 1010раз повільнішою, ніж швидкість релаксації збуджених молекул (швидкість втрати когерентності) в конденсованому середовищі при нормальній температурі. Дійсно, терапевтичний ефект спостерігається і з нелазерних джерелами світла при опроміненні на ряді довжин хвиль в діапазоні 400-850 нм, проте лазери відповідно до перерахованих вище причинами виявляються більш зручним інструментом. Місцевий лікувальний ефект низькоінтенсивного випромінювання на довжинах хвиль Нє - Ne (Х = 632,8 нм), Ні - Cd (А, = 441,6 нм) і GaAs (А, = 830 нм) лазерів, мабуть, пов`язаний з регуляторним дією світла цих довжин хвиль на проліферативну активність клітини (швидкість проходження клітинного циклу), коли світло виступає в ролі триггерного регулятора клітинного метаболізму [18, 19]. Фотоакцепторов низкоинтенсивного монохроматического лазерного випромінювання в клітці є ендогенні сенсибілізатора.
Перерахуємо інші терапевтичні застосування лазерів малої потужності [20]. У дерматології - це лікування нейродерміту, екземи, червоного плоского і оперізуючого лишаю, рецидивуючого герпесу, ліпоїдного некробіоза, келоїдних рубців, локального свербіння шкіри і ін. Лазерна терапія застосовується в ортопедії, в тому числі при сповільненій консолідації і несрастающіхся переломах кісток, а також при лікуванні ревматоїдного артриту. У невропатології її використовують при лікуванні багатьох захворювань периферичної та центральної нервової системи: остеохондрозу хребта, невралгій трійчастого нерва, розсіяного склерозу та ін. При цьому застосовують лазерну рефлексотерапію (лазеропунктура), опромінюючи біологічно активні точки, що рекомендуються при відповідному захворюванні в класичній рефлексотерапії. Лазери успішно застосовують в гінекології, стоматології [П. 31], при лікуванні хронічних тонзилітів, запальних захворювань середнього вуха, недостатнього кровопостачання кінцівок (шляхом внутрішньовенного опромінення крові) та ін.
Многофотонной збудження біомолекул можна забезпечити за допомогою короткого лазерного імпульсу порівняно невеликій енергії, але великий пікової потужності.
При цьому для двоступеневого збудження триплетних рівнів досить імпульсів наносекундной тривалості, а для більш короткоживучих синглетних рівнів необхідні тривалості в пикосекундной діапазоні. Наприклад, використання двухквантових збудження електронних станів біомолекул у розчинах призводить до дисоціації і утворенню радикалів молекул розчинника. Принципова відмінність такого фотолиза від у- радіолізу полягає в тому, що молекули розчинника диссоциируют тільки поблизу молекул-хромофоров, які поглинають лазерне випромінювання, а не в усьому опромінюється обсязі, як це відбувається при у-радіолізі. Цей ефект може знайти застосування в лазерної терапії ракових пухлин, оскільки він забезпечує продукування радикалів води, які вражають ракові клітини.
За рахунок виключення синглет-триплетної конверсії двухквантових збудження в порівнянні з одноквантовим дозволяє підвищити ефективність фотохімічної реакції. Наприклад, перехід від низкоинтенсивного збудження (1 Вт / см2) до високоинтенсивному (10е Вт / см2) підвищує квантову ефективність фотомодифікації порфирина в розчині в 100 разів. Подібні експерименти з ПГП показують, що таке збудження дає сильніший цитотоксичний ефект, ніж низкоинтенсивное.
Двухквантових фотохімічні реакції спостерігалися в біологічних системах різного рівня організації (віруси, дріжджі і клітини). Цей підхід повинен знайти застосування в генній інженерії. Наприклад, при дослідженнях in vivo вдається спостерігати різні типи пошкоджень молекул нуклеїнових кислот (розриви і зшивання), що відкриває можливість вивчення просторової структури і функцій складних біомолекул (білки, нуклеїнові кислоти) [П. 1).
Таким чином, многофотонной збудження біомолекул є основою нової ефективної нелінійної фототерапії, що використовує короткі лазерні імпульси, здатні виробляти значні фотохімічні ефекти при таких малих середніх інтенсивностях, коли теплові ефекти відсутні.
Основи лазерної хірургії, типові приклади. Переваги лазерної хірургії добре відомі - це безконтактність, що дає абсолютну стерільность- селективність, що дозволяє вибором довжини хвилі опромінення руйнувати патологічні тканини, не зачіпаючи навколишні здоровие- широкий діапазон інтенсивностей, що дає можливість забезпечувати необхідну вплив на біооб`єкт: плавлення і випаровування при порівняно невеликому розігріві, гідродинамічний руйнування за рахунок локального інтенсивного імпульсного нагріву або фотохімічні руйнування [П. 18 - П. 22, П. 26 - П. 30, П. 33, П. 37, 21]. Відзначимо ще безкровність лазерних операцій, а також широкі можливості при мікрохірургії тканин і клітин завдяки високому ступеню фокусування пучка і пороговому характеру фоторазрушенія.
Найбільш значні досягнення лазерна хірургія має в офтальмології [П. 22, П. 32, П. 37, 22]. Це операції на склоподібному тілі, фотокоагуляція сітківки, лікування діабетичної ретинопатії, приварювання відшарувалася сітківки, пробивання отворів для забезпечення нормального функціонування шлеммова каналу при лікуванні глаукоми та ін.
Широкі можливості відкриваються у лазерної хірургії при використанні волоконних світловодів, здатних передавати значні потужності. Наприклад, застосування волоконно-оптичних катетерів дозволяє реалізувати лазерну ангіопластику - руйнування (абляцию) склеротичних бляшок у кровоносних судинах [П. 26, 23- 26]. Для випаровування бляшки досить протягом 1-40 з опромінювати її світлом даній операції потужністю 3-4 Вт. Найбільш перспективними для цих цілей вважаються ексимерні лазери (А = 200-300 нм), оскільки руйнівну дію імпульсного УФ випромінювання на бляшки носить в основному фотохімічний характер, необхідна енергія при цьому істотно менше, тому знижується небезпека пошкодження стінок судин. Мала глибина проникнення УФ випромінювання в тканину дозволяє здійснювати тонкий пошарове контроль за процесом абляції.
Останнім часом УФ випромінювання ексимерних лазерів починає використовуватися при лікуванні різних кератоз, а також для корекції вад зору за рахунок пошаровим абляції тканин рогівки.
Значні перспективи в біології має лазерна мікрохірургія живих клітин. Локальність впливу може бути доведена до 0,01 мкм. Широкі межі зміни довжини хвилі лазерного випромінювання і тривалості імпульсу дозволяють реалізувати будь-який з видів фоторазрушенія від теплового до багатофотонного фотохімічного. Все це дає нові можливості в мікрохірургії хромосом, мітатіческіх органел і цитоплазми, має вихід в генетичну інженерію.