Кр-мікроскопія біологічних структур - лазерна діагностика в біології та медицині
КР-мікроскопія біологічних структур і живих клітин
Методи мікроскопії КР дають великі можливості для досліджень in situ на клітинному рівні. Об`єднання спектрометра КР зі звичайним оптичним мікроскопом в один прилад дозволяє використовувати всі способи спостереження клітини, розроблені в оптичної мікроскопії, без будь-якої спеціальної підготовки об`єкта. Можна виділити дві основні методики вимірювань: точкове освітлення об`єкту з одноканальної реєстрацією і загальне його освітлення з багатоканальної реєстрацією.
У першій методиці пучок лазерного випромінювання фокусується оптичною системою мікроскопа в пляма, розміри якого визначаються дифракційною межею (менше 1 мкм в перетягуванні). Розсіяний тому досліджуваним зразком світло збирається тим же об`єктивом і направляється на вхідну щілину спектрометра.
У другій методиці частково расфокусированним пучком висвітлюється велика область (150-300 мкм в діаметрі). З усього КР-спектра виділяється одна складова, яка відповідає будь-яких хвильовому числу і відображає наявність деякого специфічного компонента зразка. Далі будується мікрографічних зображення, яке відображає розподіл цього компонента по освітленій області. Отримання такого КР-зображення / осягається шляхом передачі через спектрометр оптичного зображення, формованого об`єктивом мікроскопа, на фотокатод багатоканального детектора.
Можна також отримувати зображення об`єкта скануванням по ньому сфокусованим пучком.
Були отримані КР-зображення малих обсягів нативной деревної тканини [29]. При цьому експериментальні спектри відповідали двом основним компонентам цієї тканини: целюлозі (лінії 330, 380, 1098, 2890 і 2940 см-1) і лігніну (лінії 1120, 1150, 1340, 1380 і 1450 см-1).
Мікроскопія КР використовується також і в резонансному варіанті. Наприклад, були отримані КР-зображення хромобактерій [30] і різних видів морських водоростей [31] як в суспензії, так і одиночних клітин. Так, РКР- спектри в діапазоні 900-1600 см-1 були отримані для
типів містять каротин бактерій і 9 клонів морського планктону. Було показано, що є чіткі відмінності в спектрах клітин різних типів. При цьому індивідуальні клітини можуть бути детектировать на тлі суспензії інших клітин без необхідності їх попереднього розділення [32].
У порівнянні з КР-мікроскопами, що використовують спонтанне КР світла, АСКРО-мікроскопи дають істотно сильніший сигнал [33]. Їх просторове дозвіл визначається головним чином параметрами системи отримання зображення, а не діаметром сфокусованого пучка. Так як монохроматор не потрібен, то просторову роздільну здатність не обмежується параметрами дифракційних решіток.
В [33] описаний АСКРО-мікроскоп з просторовим дозволом 0,7 мкм, яке потенційно може бути доведено до 0,35 мкм. Зображення клітин шкірки цибулі в діапазоні 1900-2700 см-1 отримували скануванням в межах 300 х 300 мкм. Вибір цього діапазону хвильових чисел визначається тим, що він порівняно вільний від ліній, відповідних більшості коливань молекул, але включає лінії дейтерированного зв`язків С-Н і О-Н.
Клітини попередньо витримували в D20 протягом 4 годин. Загальне зображення клітини при налаштуванні на лінію 2450 см-1, що відповідає коливанню О-D, в цілому повторювало її звичайне зображення в білому світлі, однак не містило ядер як складових частин. Це говорить про те"
що за 4 години D20 проникає в усі області всередині клітини, крім ядёр.
Цей експеримент показує можливості АСКРО-мікроскопії для вивчення динаміки обміну речовин на клітинному рівні.
