Лазерний флуоресцентний аналіз - лазерна діагностика в біології та медицині
глава 7
ЛАЗЕРНИЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНИЙ АНАЛІЗ
Добре відомі великі можливості, які відкрило в медико-біологічних дослідженнях застосування люмінесцентного аналізу [1-5]. Завдяки високій чутливості до малих кількостей біологічного матеріалу та хорошою відтворюваності результатів, цей метод став використовуватися для вирішення широкого кола завдань в галузі молекулярної і клітинної біології, вірусології, біофізики мембран. У медицині люмінесценція використовується для діагностики найважливіших фізіологічних процесів, для контролю за надходженням, перетворенням і виведенням з організму ліків, для діагностики великої кількості захворювань від грипу до раку, для контролю якості харчових продуктів і чистоти навколишнього середовища і т. Д.
У цьому розділі показано, що застосування лазерної техніки в одних випадках надає люмінесцентному аналізу якісно нові можливості, в інших - використання лазерів дозволяє істотно підвищити ефективність досліджень.
Після короткого опису фізичних основ лазерного люмінесцентного аналізу розглянуті розроблені до теперішнього часу технічні засоби, що дозволяють, зокрема, проводити кінетичні вимірювання з великим просторовим і тимчасовим дозволом і з цифровою обробкою інформації. Можливості методу продемонстровано на ряді прикладів від вивчення властивостей макромолекул, окремих живих клітин і мікроорганізмів до діагностики злоякісних пухлин і атеросклеротичних змін судин.
У заключній частині наведені приклади дистанційній флуоресцентної діагностики фотосинтезирующих біологічних об`єктів з борта літака або судна.
Загальні відомості. В основі лазерного флуоресцентного аналізу лежить реєстрація фотонів, що випускаються молекулами при переході з електронно-збудженого в основний стан (див. Рис. 5.1, 7.1). На рис. 7.1 основне і перше порушену синглетні стану позначені через S0 і Sl. Кожен з цих рівнів енергії може складатися з безлічі коливальних підрівнів 1,2,3 і т. Д. Переходи між різними подуровнями показані стрілками.
Мал. 7.1. Схема розташування енергетичних рівнів і переходів молекули
Порушення атомів і молекул при лазерному флуоресцентного аналізі зазвичай відбувається шляхом поглинання ними квантів лазерного випромінювання ближнього ультрафіолетового або видимого діапазонів. Цей процес відбувається за час порядку періоду світлових коливань, т. Е. Приблизно за 10-15 с. При цьому молекула, як правило, виявляється на деякому вищому коливальному рівні або S2. Далі для молекул в конденсованої фазі характерна швидка безизлучательним релаксація на найнижчий коливальний підрівень Slt відповідний термічно рівноважного стану. Цей процес закінчується, як правило, за час 10-12-10"п с. Подальший перехід в стан S0 супроводжується спонтанним процесом можна показати квантів світла. При цьому якщо перехід здійснюється безпосередньо зі стану Si в стан S0 без зміни спинив електронів, то такий перехід відноситься до квантово-механічний дозволеним переходам. Типове значення часу життя цього збудженого стану складає 10 ~ 8 с. Цей процес і називають власне флуоресценцией.
Якщо, проте, перед випусканням фотона в результаті деякого внутрішнього енергетичного переходу один з електронів молекули змінить свій спін, то молекула виявляється в тріплетном стані 7 , перехід з якого в основне синглетний стан квантовомеханічна не вирішено, т. Е. Його ймовірність дуже мала. Діапазон часу життя цього стану від 10-8 до 102 с. Таке випускання фотонів називається фосфоресценції. Це випромінювання зазвичай зрушено в бік більших довжин хвиль (менших енергій) в порівнянні з флуоресценцією і має істотно більшу тривалість при імпульсному збудженні.
Предметом нашого подальшого розгляду буде виключно флуоресценція. Підкреслимо, що спонтанна емісія флуоресценції є випадковий процес і спонтанне випромінювання є некогерентним, на відміну, наприклад, від пружно розсіяного випромінювання.
Багато важливих біологічні об`єкти характеризуються власної флуоресценції або мають флуоресцирующие компоненти - флуорофор. Так, близько 90% всієї флуоресценції білків обумовлено наявністю в них ароматичної амінокислоти триптофану. Білки поглинають світло поблизу А, = 280 нм, а найбільш сильно флуоресцируют в області Х = 300-350 нм. Час життя флуоресценції триптофану в білках лежить в діапазоні 1-7 ні і залежить від типу білка і його третинної структури. Також флуоресцируют в білках такі амінокислоти, як тирозин, фенілаланін, цистеїн і цистин. Загальна характеристика флуоресценції білків приведена в роботах [6-8].
У синій і жовто-зеленої областях спектру флуоресцируют відновлені піридин-нуклеотиди НАДН і НАДФН (gt;. = 440-480 нм) і окислені флавопротеиди (ФП) (X = 510-540 нм). Ці речовини беруть участь в таких найважливіших внутрішньоклітинних процесах, як гліколіз, цикл Кребса, дихання. Тому практично будь-які зрушення в клітинному метаболізмі відображаються на динаміці властивостей НАДН і ФП, а вона в свою чергу може бути виявлена при флуоресцентного аналізі живих клітин і тканин. Один з таких прикладів буде розглянуто нижче.
Природною флуоресценцией мають також і інші кофактор, ферменти, вітаміни, стероїди і гормони. Нуклеотиди і нуклеїнові кислоти зазвичай самі не флуоресцируют. Однак є деякі винятки. Так, tRNA-Phe з дріжджів містить інтенсивно флуоресціююча підставу, відоме як Y-підставу, яке має максимум випускання поблизу = 470 нм, а час життя близько 6 ні. У ближній УФ і видимої частинах спектра флуоресцируют штучно вирощених кристали основ нуклеїнових кислот.
Власної флуоресценцией в УФ діапазоні володіє скорочувальної апарат, мітохондрії і деякі інші внутрішньоклітинні структури, причому інтенсивність їх флуоресценції залежить від фізіологічного стану клітин і змінюється при різних впливах на клітини.
Флуоресценція в червоній частині спектра обумовлена присутністю в живих клітинах порфиринов.
Однак природні флуоресцентні властивості багатьох біологічних об`єктів виражені слабо і часто не дають можливості отримати з експерименту шукану інформацію. У таких випадках в якості міток, або зондів, використовують інші природні або штучно синтезовані флуорофор, які хоча і є сторонніми по відношенню до досліджуваного об`єкта, але мають кращі флуоресцентні властивості. Флуоресцентні зонди дозволяють, наприклад, кількісно характеризувати такі фізичні властивості мембран, як поверхневий заряд, трансмембранний потенціал, мікров`язкість, відстань між білками і ліпідами, концентрація води в мембранах, зміна конформації білків і ін. [7].
Використання флуоресцентних зондів дозволяє проводити діагностику багатьох захворювань, зокрема імунних, включаючи алергію, токсикози і атеросклероз. Реєстрація флуоресценції штучно вводяться в живі клітини і організми флуоресціюючих барвників, наприклад порфиринов і тетрацикліну, проводиться також при діагностиці ракових пухлин.
Відео: Каріотипи - навіщо їх здавати
Флуоресценція завжди частково поляризована. Анізотропне світлове збудження дозволяє виділити з хаотичної сукупності атомів або молекул певну групу.
Поляризація флуоресценції несе інформацію про поведінку молекул між поглинанням і випусканням фотонів, про орієнтацію молекул, їх рухливості і взаємодії з оточенням.
Будь-експеримент з використанням лазерного флуоресцентного аналізу зводиться до селективного порушення флуоресценції досліджуваного об`єкта або будь-якої його частини лазерним випромінюванням, вимірювання одного або декількох з перерахованих вище параметрів і оцінці зв`язку отриманих результатів з досліджуваним явищем в рамках тієї або іншої моделі.
Часовий діапазон між поглинанням випромінювання і його подальшим випусканням достатній для протікання цілого ряду процесів, кожен з яких веде до зміни спостерігається характеристики флуоресценції. До таких процесів відносяться: зіткнення з гасників флуоресценції (наприклад, з молекулами кисню), обертальна і поступальна дифузія, утворення комплексів з розчинником або з розчиненими речовинами і т. Д. В результаті реєстрація спектрів, часів життя, квантових виходів і анізотропії флуоресценції дає більшу інформацію про таких динамічних процесах.
