Мікроскопія і мікроспектрофлуоріметрія - лазерна діагностика в біології та медицині
Відео: Електронна мікроскопія біологічних об`єктів © Electron microscopy of biological objects
7.2. Лазерна флуоресцентна мікроскопія
і мікроспектрофлуоріметрія
Загальні відомості. Застосування лазерів і цифрових методів обробки інформації істотно просунуло можливості мікрофлуоріметріческой діагностики. З одного боку, лазери забезпечують високу спектральну щільність потужності збуджуючого випромінювання, яке з малими втратами може бути сфокусовано в пляма діаметром близько одного мікрометра. З іншого боку, використання поряд з іншими пристроями пов`язаних з ЕОМ сучасних відеодетектора, які реєструють ультранизькі інтенсивності, дозволяє досягти надчутливої реєстрації просторового розподілу флуорофорів в клітинах, мембранах, а також ефективно вирішувати інші завдання, пов`язані з вимірюванням малих кількостей досліджуваних речовин в різних модельних середовищах і біологічних структурах.
Кількісний мікроспектрофлуоріметріческій аналіз біологічно активних молекул. Схема досить простого лазерного флуоресцентного мікроскопа, побудованого на базі люмінесцентного мікроскопа «Люмам-ІЗ», зображена на рис. 7.2 [9]. Для збудження флуоресценції використовується безперервний Ні-Cd лазер (Ях = 441,6 нм, gt; .р = 325 нм).
Мал. 7.2. Схема імпульсного флуоресцентного мікроскопа: 1 - лазер, 2 - модулятор, 3gt; 10 - ФЕУ, 4 - телескоп, 5 - польова діафрагма, 6 - селективне дзеркало, 7 - об`єктив, 8 - досліджуваний об`єкт, 9 - світлофільтр, 10 - підсилювачі-дискримінатори,
11 - блок сполучення з ЕОМ, 12 - ЕОМ «Іскра-226», 14 - монокулярная насадка [9]
Реєстрація флуоресценції проводиться за допомогою фотоелектронного помножувача (ФЕП) в режимі рахунку фотонів на одноелектронному рівні з автоматичним вирахуванням навколишнього фону і власних шумів ФЕУ. Діапазон довжин хвиль - 360 - 800 нм, динамічний діапазон вимірюваних світлових потоків - 10s, похибка вимірювання мінімально реєстрованого потоку-10%, діаметр пучка збудливого випромінювання в області зондування 1 - 100 мкм.
Мікрофлуоріметр використовувався для кількісного амінокислотного аналізу і для визначення вмісту ДНК в клітинах бактерій. Зокрема, при скануванні хроматографических плям, отриманих при поділі ДНС-похідних амінокислот ДНС-Phe, ДНС-Gly і ДНС-Jle на пластинках з поліакридним покриттям, вдалося достовірно зареєструвати кількості речовини в хроматографическом плямі 5-10-14 моль. Це на 1,5 порядку краще досягнутих в даний час результатів щодо кількісного детектування похідних амінокислот, розділених методом тонкошарової хроматографії, отриманих при порушенні флуоресценції випромінюванням ксенонової лампи.
Однією з найважливіших завдань сучасної клітинної біології є визначення концентрації іонів вільного кальцію [Са2 *] всередині живих клітин. Це завдання успішно вирішується за допомогою лазерних мікрофлуоріметров із застосуванням флуоресцентних зондів. Для прикладу розглянемо методику вимірювання [Са2 +] в ізольованих м`язових клітинах [10]. Як зонда використовувався барвник індо-1 з максимумом поглинання в комплексі з Са2 + на 331 нм, максимумом флуоресценції на 398 нм і квантової ефективністю флуоресценції 0,56. Флуоресценція збуджувалася випромінюванням Ні-Cd лазера (X- = 325 нм) з потужністю зондуючого пучка менше 1 мкВт.
Процедура вимірювання полягає у визначенні відношення інтенсивностей флуоресценції на двох довжинах хвиль = 422 і Я2 = 468 нм: /?=/(Х1)//(А.2) і подальшого обчислення але формулою [Са2 +] = С6Д (Rmin-R) / (R-Rmax), де Rmin і Rmax - ет0 значення R при нульовій і насичує концентраціях Са 2+ відповідно, С = 0,972- константа пропорційності, &д = 250 нмоль / л - константа дисоціації. Значення Rmm, #max і R визначалися на каліброваному 6 мкмоль розчині барвника.
Використання такої установки вперше дозволило визначати характерні значення [Са2 +] в діапазоні 100 - 300 нмоль / л в живих клітинах з точністю не гірше ± 10 нмоль / л з просторовим дозволом 2 мкм за час менше 0,5 с.
Одним з напрямків практичного застосування лазерної мікроспектрофлуоріметріі є ідентифікація і вивчення властивостей пігментів і барвників всередині живих клітин. Прикладом таких робіт є експерименти з вивчення фотоповеденія одноклітинних водоростей, в яких за допомогою цього методу були визначені органела, що виконує роль фоторецептора, і молекула фотопігментом [П. 7].
Інший приклад - реєстрація в живих клітинах спектрів флуоресценції фотосенсибилизирующих барвників типу гематопорфірину, широке використання яких в медицині починається в зв`язку з розробкою ефективних методів лазерної діагностики і терапії злоякісних пухлин. Більш детально цей приклад буде розглянуто в 7.3. jOI]
Загальним для цих робіт є використання імпульсних перебудовуються лазерів і проведення кінетичних вимірювань з високим тимчасовим дозволом.
Інструментальна база сучасної флуоресцентної мікроскопії крім лазерів і ФЕУ в режимі рахунку фотонів включає відеодетектори, що працюють при дуже низьких рівнях інтенсивності флуоресценції з дискретизацією відеокадрів, їх подальшим введенням в ЕОМ і цифровою обробкою. Відеомікрофлуоріметри мають ряд особливостей, важливих для проведення біомедичних досліджень: швидкою обробкою інформації, вкрай чутливим детектированием, цифровим форматуванням і аналізом даних, збереженням і накопиченням інформації про просторових співвідношеннях. Ці особливості дозволяють проводити реєстрацію просторово-часових розподілів флуоресціюючих компонентів в досліджуваному об`єкті зі швидкістю і точністю, раніше недосяжною іншими методами. Зберігання відеозображень на магнітних дисках не тільки забезпечує 100% -ву надійність їх повторного використання, а й дозволяє досліднику багаторазово звертатися до них з метою математичної обробки за різними алгоритмами.
Мікрофлуоресцентний аналіз внутрішньоклітинного транспорту. Цифрове подання зображень флуоресціюючого об`єкта особливо важливо при дослідженні розподілу молекул на клітинних мембранах, руху внутрішньоклітинних частинок, компартментализации специфічних зондів всередині клітини, а також клітинної рухливості.
Наприклад, в даний час ведуться роботи по вивченню взаємодії гормонів і факторів росту з мембранними рецепторами клітини і їх подальшої інтерналізації. Однією з цілей цієї роботи є з`ясування механізмів порушення регуляції росту в ракових клітинах. Більшість макромолекулярних лігандів зв`язується з клітиною в процесі ендоцитозу за посередництвом рецепторів. Комплекси ліганд - рецептор обволікаються загальної мембраною, утвореної з окремих ділянок плазматичної мембрани клітини. Утворилися закриті везикули транспортуються всередину клітини за певними адресами, наприклад до ядра. Цей-то транспорт в живих клітинах і вдається візуалізувати за допомогою флуоресціюючих антитіл, що приєднуються до везикул. Процедури цифрового усереднення зображень дозволяють вивчати характер руху закритих везикул при таких низьких рівнях збудження, при яких візуально під мікроскопом флуоресцирующие везикули просто не відрізняються від фону.
В якості іншої важливої задачі можна назвати вимір трансляційній дифузії в площині мембран і в порівняно тонких об`ємних об`єктах. Це завдання вирішується за допомогою методів фотознебарвлення. В основі цих методів лежить фотознебарвлення локальних областей досліджуваного об`єкта, що несуть флуоресцентні молекули, з метою порушення їх флуоресценції і подальшої оцінки кінетики відновлення флуоресценції внаслідок дифузного припливу необесцвеченних флуорофорів з навколишнього середовища в засвічену лазерним пучком область. Ця область може мати вигляд плями, смужки або іншу форму.
Кінетика відновлення флуоресценції пов`язана з коефіцієнтом дифузії або швидкістю потоку мічених молекул [II]. Наприклад, в разі відновлення флуоресценції в двомірному диффузионно обмеженому об`єкті коефіцієнт дифузії прямо пропорційний квадрату радіусу лазерного плями в площині об`єкта і обернено пропорційний часу відновлення флуоресценції до половини вихідного рівня. Кінцевий рівень, до якого відновлюється флуоресценція, пов`язаний з рухомою фракцією мічених молекул.
В даний час жоден інший метод не дає порівнянної інформації про трансляційній рухливості молекул в певних областях мембран одиничних клітин або клітинних органоїдів. Основними етапами експерименту є:
реєстрація флуоресценції з заздалегідь виділеної області мембрани, поверхні або тонкої плівки об`єкта розміром у кілька мікрометров-
імпульсна опромінення цій галузі пучком лазера (як правило, Ні-Cd або Аг), швидко руйнує більшу частину флуорофорів за час 5-50 мкс, внаслідок чого інтенсивність флуоресценції з цієї області різко падает-
вимір кінетики відновлення флуоресценції, починаючи з моменту закінчення знебарвлюючий імпульсу, для чого на досліджувану область направляється малопотужний «вимірювальний» пучок лазерного випромінювання (зазвичай в 103-105 разів слабший), збудливий флуоресценцию так само, як і на першому етапі.
При проведенні подібних експериментів реєстрація флуоресценції може здійснюватися за допомогою ФЕУ. Однак застосування відеосистем може дати можливість вивчення просторових деталей процесу відновлення, що дозволяє в принципі розраховувати локальні значення коефіцієнтів дифузії або швидкості потоку в досліджуваній області, наприклад всередині клітини.
Метод вимірювання кінетики відновлення флуоресценції після фотознебарвлення використовується для дослідження процесів агрегації макромолекул і самозборки клітинних органоїдів. Наприклад, цим методом були вивчені напрямок і механізм полімеризації мікротрубочок. Як флуорофора використовувався флуоресцеїн. Вимірювання дозволили виключити гіпотезу, відповідно до якої мономери тубуліна включаються в мікротрубочки в середній частині і губляться на кінцевих ділянки х.
Досліджувалася кінетика полімеризації глобулярного актину в водному розчині в присутності солі КС1 або дивалентні катіонів Са2 + і Mg2 +. В процесі полімеризації утворюються довгі (10 - 100 мкм) філаменти F- актину. Було вперше доведено, що залишається неполімерізованной фракція актину в присутності зростаючих филаментов є мономірним форму G-актину.
Дана методика дозволяє точно простежити вплив різних реагентів на процес самозборки. Наприклад, додавання цітохалазін Б призводить до укорочення филаментов, а додавання в розчин алдолази - білка, що зв`язується з Актинові філаменти, - призводить до збільшення слабо рухомий фракції актину. Найімовірніше, це відбувається через утворення алдолазних зшивок між нитками F-актину.
Найбільш цікавими представляються досліди з живими амебами. Шляхом мікроін`єкцій в клітку впорскується мічені флуоресцеїном білки: G-актин, бичачий сироватковий альбумін (БСА), овальбумин і рибонуклеаза А. Виміряні значення коефіцієнтів дифузії цих білкових молекул в клітині виявилися в 2-3 рази нижче, ніж у воді. Більш того, виявилося, що молекули G-актину, хоча їх молекулярна вага на 50% менше, ніж у молекул БСА, дифундують повільніше, ніж молекули БСА. Це підтверджує висувалися раніше припущення про те, що в клітці G-актин знаходиться в комплексі з іншими молекулами значного розміру типу профіліна.
Крім того, спостереження кінетики відновлення флуоресценції після знебарвлення показало, що нерухома фракція F-актину становить в середньому близько 10% від загального вмісту актину в клітці. У різних частинах клітини це співвідношення різне: в хвостовій частині - більше, в більш рухомий головної частини - менше. В області плазмалемми міститься до 50-80% малорухомих филаментов. Ці та інші дослідження (наприклад, по самосборке микротрубочек) показують, що метод фотознебарвлення є дуже ефективним не тільки при вимірі рухливості мембран, а й при вивченні транспорту макромолекул в розчинах і у внутрішньоклітинному матриксі.
