Фізичні основи спектроскопії кр - лазерна діагностика в біології та медицині

ЛАЗЕРНА СПЕКТРОСКОПІЯ комбінаційний
РОЗСІЯННЯ
У цьому розділі розглядаються методи мікродіагностікізастосовується, засновані на неупругом (комбінаційному) розсіянні (КР) світла біологічними молекулами. Так як біологічні об`єкти в більшості випадків досліджуються в водних розчинах або містять в собі велику кількість води, то методи спектроскопії КР мають важливі переваги перед іншими методами мікродіагностікізастосовується, застосування яких до вивчення біомолекул в природному середовищі ускладнено внаслідок поглинання водою.
До теперішнього часу накопичений великий експериментальний матеріал по спектроскопії КР біологічних молекул, зокрема білків і нуклеїнових кислот. Деякі приклади таких досліджень представлені в цьому розділі.
Крім біомолекул і їх комплексів об`єктами спектроскопії КР все частіше стають живі клітини і багатоклітинні структури. Великі перспективи тут відкриваються в зв`язку з розвитком техніки мікроскопії КР.
Крім методів спектроскопії спонтанного КР, дані основні відомості про порівняно нових і найбільш перспективних методах: спектроскопії гігантського КР і активної спектроскопії КР.
Фізичні основи спектроскопії комбінаційного розсіювання та її різновидів
Спонтанне комбінаційне розсіювання. Одним з результатів взаємодії світла з біологічними об`єктами є його неупругое розсіювання, внаслідок якого змінюється не тільки напрямок, але і частота випромінювання. На рис. 6.1 показані можливі варіанти і слідства взаємодії кванта світла з молекулою. тут основне

і перше електронно-збуджений стан позначені через S0 і відповідно. Кожен з цих рівнів енергії складається з безлічі коливальних підрівнів У, 2, 3 і т. Д. Переходи між різними рівнями і підрівнями показані стрілками, причому довжини стрілок, спрямованих вгору, пропорційні частоті падаючого світла.

Мал. 6.1. Можливі енергетичні переходи в молекулі, непружного взаємодіє з квантом світла
Довжини стрілок, спрямованих вниз, пропорційні частоті розсіяного світла.
В результаті взаємодії за час порядку періоду світлових коливань, т. Е. Приблизно за 10 ~ 15 с, молекула переходить в більш високий енергетичний стан. Далі через інтервал часу близько 10&rdquo-11 з може статися вивільнення кванта світла, але вже з частотою, яка є комбінацією частоти падаючого світла і частоти коливального переходу. При цьому якщо вивільнений квант має частоту, меншу частоти падаючого світла, а саме v0 - vK0J1 (стрілка закінчується на коливальному рівні, розташованому вище вихідного), то спостерігається так званий Стокс компонент комбінаційного розсіювання світла. Якщо ж відбувається енергетичний перехід в стан нижче вихідного рівня, т. Е. Енергія вивільненого кванта більше енергії падаючого (v0 + vKOJI), то такий компонент КР називається антистоксових. В обох випадках різниця частот падаючого і розсіяного світла V0- (v0 ± vKOJI) дорівнює частоті молекулярного коливання.
Імовірність спонтанного КР істотно менше ймовірності релєєвського (пружного) розсіювання, тому інтенсивність сигналу досить низька. При цьому в нормальних умовах інтенсивність антистоксової компоненти розсіяного світла значно менше інтенсивності стоксова компонента. Інтенсивність сигналу залежить від частоти падаючого світла: далеко від області електронного поглинання вона пропорційна vj, при наближенні до смуги поглинання спостерігається більш швидке зростання інтенсивності КР. При попаданні частоти v0 в область смуги поглинання досліджуваної речовини спостерігається так зване резонансне комбінаційне розсіювання (РКР).
Інтенсивність ліній РКР може на кілька порядків перевищувати інтенсивність звичайного КР. Завдяки цьому, використовуючи РКР, можна селективно реєструвати світло, розсіяне окремими сполуками в багатокомпонентних біологічних системах. Інтенсивність звичайного КР від інших компонентів системи при цьому настільки мала, що практично не відрізняється від фону.

Так як будь-яка біомолекул складається з великого числа атомів і атомних груп, то інтенсивний падаюче світло,
Мал. 6.2. КР-спектр рідкої води, що отримується при порушенні Аг лазером ( , = = 488 нм, Л-1 = 20 492 см&rdquo-1). По осі абсцис відкладені абсолютні та відносні одиниці (хвильові числа)
взаємодіючи одночасно з багатьма атомами, дає цілий спектр ліній КР. При цьому положення ліній в спектрі визначається тільки частотами коливань основних електронних станів (значеннями vK0JI j). Тому спектроскопія КР - це варіант колебательной спектроскопії. Аналогічно ІК спектроскопії сенс застосування спектроскопії КР при дослідженні біологічних об`єктів полягає в тому, щоб зв`язати КР-спектри з хімічними властивостями складових ці об`єкти біомолекул і їх найближчого оточення, добре характеризуються коливальними спектрами.
На рис. 6.2 зображений в якості найпростішого прикладу КР-спектр рідкої води - природного фізіологічного розчинника біологічних сполук. Спектр отриманий шляхом порушення води випромінюванням Аг лазера (А, = 488 нм). По горизонтальній осі відкладені довжини хвиль в нанометрах, відповідні їм хвильові числа, а також зрушення щодо хвильового числа збудливого випромінювання (А, 1 = = 20 492 см-1). Найбільш інтенсивна лінія в спектрі lt; 3415 см-1) з`являється в результаті обміну енергії падаючого світла з енергією валентних коливання, відповідних розтягування зв`язку О-Н. Коливання ,, що відбуваються при деформації кута Н-О-Н в молекулі води, проявляються в КР-спектрі значно слабше (лінія 1619 см-1).
Важливою особливістю КР-спектра води є те, що за винятком лінії валентного коливання інтенсивність цього спектру мала. Це дозволяє на його тлі отримувати чіткі лінії КР-спектрів розчинених у воді речовин. Цим спектроскопія КР принципово відрізняється від ІК спектроскопії, так як вода дуже сильно поглинає інфрачервоне випромінювання.
Порівняння інтенсивності ліній в КР-спектрах, отриманих від великої кількості різних молекул, дозволило сформулювати деякі узагальнені правила [1, П. 8]. Так, наприклад, валентні коливання проявляються в КР-спектрах сильніше деформаційних коливань (ми вже бачили це на прикладі води) - лінії коливань кратних зв`язків повинні бути більш інтенсивними, ніж лінії коливань простих зв`язків-лінії, обумовлені синфазними коливаннями валентних зв`язків, більш інтенсивні, ніж лінії, обумовлені протівофазного коливаннями цих зв`язків.
Як правило, в КР-спектри багатоатомних молекул переважний внесок вносять коливання деяких груп атомів. Це такі часто зустрічаються в органічних молекулах групи, як С-Н, О-Н, N-Н, S-Н, С = С, С = 0 і ін. Точне положення в спектрах ліній, які відповідають цим груповим коливань, залежить від типу зв`язку з іншими атомами. Так, в спектрах молекул, які мають групу = С-Н, є лінія 3300 см-1, групівідповідає лінія 2960 см-1, а группелінія 3020 см-1.
Прикладом більш складної групи атомів, яка виступає в якості незалежного осцилятора в молекулах всіх поліпептидів і білків, є так звана амидная група

утворюється при зв`язуванні амінокислот один з одним, різні типи коливань цієї групи проявляються в КР-спектрах у вигляді так званих смуг амід-1, амід-2, амід-8. Найбільш сильні смуги амід-1 і амід-3 розташовані поблизу хвильових чисел 1660 см-1 і 1250 см-1 відповідно. Смуга амід-2 в КР-спектрах білків проявляється слабо. Точне положення максимумів смуг і форма їх контурів визначають вторинної структурою білка.
Аналогічно, коливання фосфатних груп

основному ланцюзі молекул ДНК і РНК зумовлюють появу в КР-спектрах цих макромолекул двох сильних характерних ліній поблизу 800 і 1100 см-1. Інтенсивність і положення першої з них залежить від конформації і впорядкованості вторинної структури.
Характерні лінії є в КР-спектрах та інших біологічних макромолекул. Крім цих характерних ліній КР-спектри біологічних макромолекул і систем містять велику кількість інших ліній, приписка яких певним внутрімолекулярних коливань становить одну із завдань спектроскопії КР біологічних об`єктів.

Мал. 6.3. Блок-схема установки для реєстрації КР-спектрів в звичайному експерименті: 1 - лазер, 2 - фокусуються лінза, 3 - кювета з досліджуваним зразком, 4 - конденсор, 5 - вхідна щілина, 6 - монохроматор, 7 - фотоумножувач або багатоканальний аналізатор

Загальні відомості про техніку експерименту. На рис. 6.3 представлені основні оптичні елементи, необхідні для реєстрації спонтанних КР-спектрів в звичайному експерименті. Використання лазера в якості джерела інтенсивного монохроматичноговипромінювання в експериментах з порушення і реєстрації КР було необхідною умовою швидкого розвитку цього методу і широкого впровадження його в хімію і біологію.

Лазери зняли більшість здавалися раніше непереборними труднощів і обмежень, пов`язаних з досліджуваними об`єктами і, як уже говорилося вище, їх водними розчинами. Найчастіше використовуються безперервні Аг і Кг лазери з дискретної перебудовою довжини хвилі, а також лазери на барвниках і параметричні генератори світла з плавним перебудовою довжини хвилі. Імпульсні лазери дозволяють отримувати `високу імпульсну потужність зондуючого випромінювання при порівняно низькою середньої потужності і, що особливо важливо, високе тимчасовий дозвіл реєстрованих спектрів.
Реєстрація КР-спектра здійснюється або за допомогою фотоумножителя, з`єднаного зі скануючим монохроматором (як правило, подвійним для надійної відбудови від пружно розсіяного світла), або за допомогою оптичного багатоканального аналізатора. Цей аналізатор являє собою лінійку з декількох сотень мініатюрних фотоприймачів або високочутливу телекамеру. У сканирующем спектрометрі лінії спектра реєструються послідовно, причому весь спектр в діапазоні від десятків до тисяч зворотних сантиметрів з дозволом до кількох зворотних сантиметрів отримують за час порядку декількох секунд.
Використовуючи їх, можна багатоканального аналізатора дозволяє реєструвати всі лінії спектра одночасно, на що потрібно істотно менше часу вплоть- до нано- і пикосекунд.
Одним з перешкод при реєстрації КР-спектрів виступає фонова люмінесценція зразків - більш ймовірний процес, ніж КР (див. Гл. 7). Джерелами люмінесценції є домішки або ендогенні Хромофор. Зменшення небажаного люмінесцентного фону, що перекриває іноді слабкі лінії КР, домагаються ретельної очищенням зразка, підбором оптимальної довжини хвилі збуджуючого випромінювання або додаванням в розчин досліджуваної речовини спеціальних гасників. У деяких випадках можливе випалювання люминесцирующих домішок шляхом тривалого опромінення зразка інтенсивним лазерним випромінюванням. Останній спосіб, правда, може привести до фотохімічної модифікації і навіть руйнування зразка.
Більш перспективним шляхом відділення КР-спектрів від люмінесценції є використання для збудження КР лазерних імпульсів пикосекундной тривалості. Так як часи життя навіть швидкої люмінесценції (флуоресценції) лежать в наносекундному діапазоні (див. Гл. 7) на відміну від пикосекундной діапазону у КР, то, використовуючи швидкодіючу систему реєстрації, відключати після прийому КР-випромінювання до приходу квантів люмінесценції, можна усунути фонові лінії з спектра.
Активна спектроскопія комбінаційного розсіювання (АСКРО). Принципово іншим методом реєстрації КР- спектрів від об`єктів з високим рівнем флуоресценції є АСКРО [2]. Для реалізації цього методу використовують два перебудовуються лазера з частотою випромінювання Vj і v2. Перетинаючись в зразку, пучки випромінювання цих лазерів наводять в ньому дипольний момент, який характеризується нелінійної сприйнятливістю третього порядку. В результаті відбувається когерентне антистоксових розсіювання з частотою va = 2vx-v2. Напрямок поширення сигналу визначається виконанням умови фазового синхронізму для хвильових векторів взаємодіючих хвиль і відрізняється від напрямку поширення випромінювання накачування. Інтенсивність цього розсіяного випромінювання істотно зростає, якщо разностная частота vx-v2 збігається з частотою досліджуваного внутримолекулярного коливання. Варіюючи vx-vs шляхом перебудови частоти лазерів, можна прописувати КР-спектри в широкому діапазоні і при цьому ефективно відбудовуватися від флуоресценції в більш короткохвильову антистоксових область.
Іншою перевагою АСКРО є можливість вирішувати близько розташовані і перекриваються спектральні лінії, пов`язана з тим, що спектральний дозвіл спектрометра АСКРО визначається не монохроматором, а шириною ліній використовуваних лазерів [2].
Отриманню якісних спектрів АСКРО перешкоджає наявність нерезонансного нелінійно-оптичного сигналу, обумовленого внеском молекул розчинника. Придушення його здійснюють за допомогою поляризаційних елементів, використовуючи відмінності поляризаційних характеристик резонансного і нерезонансного вкладів [3, 4].
Гігантська комбінаційне розсіювання (ГКР). В останні роки в молекулярної біології та біохімії почали використовувати інший різновид колебательной спектроскопії, засновану на явищах ГКР світла [5-7]. Суть цього явища полягає у величезній (до 105-10е раз) збільшення перетину КР молекулами, адсорбованими на поверхні металу. Внаслідок цього ГКР-спектри вдається реєструвати при концентраціях, на кілька порядків менших, ніж у звичайній спектроскопії КР.
В основі явища ГКР лежать два механізми: електромагнітний, пов`язаний зі збільшенням локального електромагнітного поля поблизу поверхні, і молекулярний, пов`язаний з утворенням збуджених станів комплексів молекул з металом [8]. Інтенсивне ГКР спостерігається найчастіше на спеціально приготовлених металевих поверхнях з сильною шорсткістю. ГКР-спектри біологічних молекул, як правило, отримують в електрохімічних комірках, в гидрозолей металів і на металевих плівках з регулярними неоднорідностями. Для реєстрації спектрів використовується та ж апаратура, що і для отримання звичайних КР-спектрів. Для збудження застосовують лазерне випромінювання видимого діапазону, потужність якого зазвичай не перевищує кількох десятків милливатт.