Приклади застосування лазерної флуоресцентної діагностики - лазерна діагностика в біології та медицині

Приклади застосування лазерної
флуоресцентної діагностики в медицині
Діагностика раку. Накопичений до теперішнього часу досвід лікування онкологічних захворювань дає підставу вважати, що рання діагностика раку з подальшим хірургічним або терапевтичним (можливо, лазерним) лікуванням можуть істотно підвищити ймовірність одужання. У зв`язку з цим в різних наукових центрах, в тому числі і в нашій країні, ведеться пошук нових, більш ефективних методів діагностики. Ще до застосування лазерів було встановлено, що спектри флуоресценції у видимому діапазоні, одержувані від нормальних і пухлинних тканин, відрізняються. Застосування лазерних флуоресцентних спектрометрів з високою спектральною щільністю потужності збудження дозволило підвищити швидкість і якості отримання спектрів і підняти загальний рівень досліджень в цьому напрямку.
На рис. 7.3 показані спектри флуоресценції, отримані від здорових і пухлинних нирки і передміхурової залози щура [12, 13]. Видно, що основні максимуми спектрів від пухлинних тканин (А. = 521-522 нм) істотно зрушені в синю область у порівнянні зі здоровими (А, = = 531-533 нм). Та й сама форма спектрів достовірно відрізняється. Подібні відмінності спектрів флуоресценції, мабуть, повинні спостерігатися і при дослідженні тканин і органів людини. Ці відмінності пояснюються або змінами середовища, що оточує флуорофор, або виробництвом нових флуорофорів, індукованим біохімічними змінами в клітинах або в навколишньому середовищі. В області довжин хвиль А, = 520-530 нм флуоресцируют флавін, причому максимуми спектрів флуоресценції можуть дещо зміщуватися в залежності від умов середовища. Отже, якщо не говорити про виробництво нових флуорофорів, то можна припустити, що в даному випадку флуоресцируют флавін. Загальні піки в спектрах в області = 590-640 нм можна приписати Порфірини, що містяться в цитохроме мітохондрій. Їх флуоресценція багаторазово посилюється при видаленні іонів Fe і Сі.

Мал. 7.3. Спектри флуоресценції від нирки (а) і передміхурової залози (б) щури: 1 - здоровий орган, 2 - пухлинний

Мал. 7.4. Схема лазерного флуориметра: 1 - Аг лазер, 2 - переривник, 3 - об`єкт, 4 - фокусуються система, 5 - монохроматор, 6 - ФЕУ, 7 - підсилювач, 8 - самописець [121

Схема установки, на якій були отримані наведені вище спектри, зображена на рис. 7.4. Безперервне випромінювання Аг лазера (^ = 488 нм), промодулірованной за допомогою переривника з частотою 200 Гц, фокусувалася на поверхню досліджуваної тканини. Флуоресцентний сигнал за допомогою системи лінз прямував на вхідну щілину подвійного монохроматора, який здійснював розгортку спектру з дозволом ДЛ, = 1,8 нм в діапазоні = 500 800 нм, так що розсіяне світло не потрапляв на фотоумножувач. Сигнал ФЕУ синхронно з переривачем посилювався і реєструвався на самописці. Потужність зондуючого лазерного випромінювання становила 100 мВт, діаметр плями в області вимірювання - 100 мкм. Спектри знімалися по кілька разів, і при цьому спостерігалася їх повна відтворюваність.
Зауважимо як відступу, що така ж установка може, бути використана для діагностики карієсу зубів. Показано, що існують достовірні відмінності в спектрах флуоресценції і пружного розсіювання в видимій ділянці від уражених карієсом і здорових ділянок зуба. Більш детальну інформацію зацікавлений читач знайде в [14].
Інший перспективний метод лазерної флуоресцентної діагностики раку заснований на здатності злоякісних клітин і тканин накопичувати підвищену в порівнянні зі звичайними клітинами і тканинами концентрацію флуоресціюючих барвників [15, П. 36]. Проведення оптичного обстеження тканин в спектральному діапазоні флуоресценції барвника дає можливість оперативно виявляти місця його підвищеної концентрації і, отже, локалізації пухлини.
Використання лазерів в цій методиці є принциповим не тільки з точки зору необхідності високої спектральної щільності потужності випромінювання, але також з точки зору необхідності використання світловолоконних трактів для підведення збудливого випромінювання до внутрішніх органів і відведення звідти флуоресценції.
Вибір оптимального барвника для флуоресцентної діагностики пухлин проводиться відповідно до низки вимог. Барвнику повинні бути властиві: висока селективність накопичення в злоякісних клітинах і тканинах (в порівнянні з нормальними), високий квантовий вихід флуоресценції, швидке виведення з організму, відсутність побічних ефектів на тканині і організм в цілому. Чи не повинен бути високим квантовий вихід фотоіндукованої генерації синглетного кисню або будь-яких інших ціготоксіческіх агентів на відміну від протилежного вимоги до барвників, що використовуються для фото динамічної терапії пухлин.
В даний час в лабораторіях, які розробляють методику лазерної флуоресцентної діагностики раку, найчастіше використовуються в якості барвників гематопорфірін (ДП), похідні гематопорфірину (ПГП) [П. 36, 16, 171 і флюренат (динатрієва сіль флюоресцеіна) [15, 18]. У той час як перші два барвника використовуються також і для фотодинамічної терапії, флюренат виявляється більш придатним саме для діагностики. Так, він забезпечує контрастність спостереження пухлини в світлі флуоресценції на тлі нормальних тканин не менше 50: 1 в порівнянні з 5: 1 у ПГП.
Для збудження флуоресценції флюрената найбільше підходить випромінювання Нє - Cd лазера (Л, = 441,6 нм), що потрапляє в смугу його поглинання. При наявності у хворого, в кров якого введено флюренат, злоякісної пухлини, наприклад шлунково-кишкового тракту, ця пухлина світиться зеленим світлом на темно-синьому тлі непораженной слизової. Це свічення з достовірністю 98% відповідає місцю знаходження пухлини. Некротична тканина дає світяться ділянки. Такі ділянки часто спостерігаються на великих пухлинах, які в цілому світяться слабше.
У ряді випадків площа світіння при лазерному збудженні значно перевищує область пухлини, видиму при звичайному освітленні. Це означає високу інфільтрацію злоякісної тканини в стінку органа. Таке спостереження дозволяє правильно спланувати операцію.
Метастази світяться так само, як і пухлини. Застосування флуоресцентної діагностики істотно збільшує відсоток їх виявлення. У деяких випадках тільки завдяки флуоресценції виявляється внутриорганное метастазування в вигляді просоподібних висипань далеко від пухлини.
Цікаво відзначити, що були в практиці випадки [15], коли у хворих з діагнозами раку, наприклад, товстої кишки, поставленими пальпаторно і рентгенологічно, не спостерігалося флуоресцентного світіння. Навіть під час операції діагноз раку не викликав сумніву. Однак наступне гістологічне дослідження цей діагноз не підтвердило: за пухлина були прийняті запальні інфільтрати. Его показує високу надійність лазерної флуоресцентної діагностики.
В даний час тривають роботи по клінічного випробування цього методу і по дослідженню механізмів виборчого накопичення барвників в ракових клітинах [17, 19], а також по вивченню механізмів фотодинамічного пошкодження біомолекул, клітин і біоструктур тканин [20, 211. Важливим етапом цих робіт є вивчення стаціонарних і дозволених в часі спектрів флуоресценції барвників у розчинах і в живих клітинах, яке проводиться за допомогою лазерних пікосекундних спектрометрів і мікроспектрофлуоріметров.
У роботах [22, 23] реєструвалися флуоресцентні спектри ДП, діацетату ДП (ДГП) і дігематопорфірінефіра (фотофріна 2) у водних розчинах (рН = 4,0-11,0), в фосфатному буферному розчині (РІ = 7,4) і в розчині диметилформаміду в модельних системах: штучних ліпідних бульбашках - ліпосоми і тінях еритроцитів, а також в культивованих клітинах нирки свині і фібробластів людини.
Схема установки, на якій були отримані ці спектри, зображена на рис. 7.5.

Мал. 7.5. Схема пикосекундной флуоресцентного мікроскопа: 1 - фокусує об`єктив, 2 - об`єкт, 3 - монохроматор, 4 - ФЕУ, 5 - лічильник фотонів, 6 - мікро-ЕОМ [22]
Флуоресценція збуджувалася одиночними імпульсами або другої гармоніки АІГ: Nd лазера, або імпульсами лазера на барвнику тривалістю 70 ± 10 пс. Короткофокусний об`єктив сфокусував збудливий лазерний промінь на об`єкт і збирав флуоресценцию. Діаметр пучка в області зондування був менше 1 мкм. Флуоресцентне випромінювання прямувало крізь

прозоре в діапазоні 600-700 нм дихроичное дзеркало на монохроматор і далі на ФЕУ, що працює в режимі рахунку фогонов. Вся система функціонувала під керуванням мікро-ЕОМ.
У клітинах головний максимум флуоресцентного спектру припадає на 635 нм. Стаціонарні спектри мають максимуми на 612 нм для водних розчинів і на 625 нм - для

Мал. 7.6. Розподіл інтенсивності флуоресценції по ракової клітки людини, сенсибілізованої ПГП [25]
органічного розчинника. Це говорить про те, що характер флуоресценції молекул барвника істотно залежить від їх безпосереднього оточення (молекул води, розчинника, ліпідів та ін.).
Кінетичні вимірювання показали, що характер загасання флуоресценції залежить від того, знаходяться молекули барвника в формі мономерів або має місце їх агрегація і комплексоутворення з іншими, наприклад внутрішньоклітинними, структурами. Так, кінетика загасання флуоресценції від розчину мономерів ДП в воді в області максимуму з хорошою точністю моделюється однією експонентою з часом т = 15-16 ні. Поява в розчині агрегатів (олігомерів) барвника тягне за собою появу ще однієї «швидкої» експоненти з т = 0,5 ні. Швидка кінетика з`являється також в смузі головного максимуму спектрів флуоресценції молекул барвника в клітинах, що вказує на те, що ці молекули утворюють комплекси з внутрішньоклітинними структурами, швидше за все з мембранами.
При підвищенні дози світлового впливу в розчинах барвників виникають стійкі фотопродукти, що дають в кінетичних і стаціонарних спектрах флуоресценції бічні смуги з пикосекундной загасанням (для ДП? .тах = 644 нм, т = 100 пс) [24]. На рис. 7.6 наведено приклад вимірювання розподілу інтенсивності флуоресценції по ракової клітки людини після 1-годинного утримання її в розчині ПГП [25]. Концентрація барвника становила 50 мкг / см3, щільність потужності випромінювання аргонового лазера на поверхні клітини - близько 0,4 мВт / см2. Відношення сигнал / шум становило кілька десятків в області максимальної флуоресценції. Вимірювання проводились на лазерному флуоресцентного мікроскопі, обладнаному високочутливої системою реєстрації, цифрової обробки і представлення зображень.
Видно, що інтенсивність флуоресценції менше в центральній частині, ніж у периферійних областях. Цей результат означає, що ПГП накопичується головним чином в області зовнішньої мембрани культивованих ракових клітин, що відповідає результатам інших авторів [26]. З огляду на цей факт, а також уявлення про комплексообразовании молекул барвників з мембранами, можна припустити, що руйнування ракових клітин при фото- динамічної терапії пухлин розвивається в основному в мембранах клітин.
На наведеному малюнку розміри мінімального елемента зображення відповідають області в 0,25 мкм на досліджуваному об`єкті, що знаходиться на межі просторового дозволу оптичної системи. Час отримання флуоресцентного зображення становить 1 з на відміну від кількох десятків секунд, необхідних при використанні звичайної техніки, що дає до того ж недостатнє просторову роздільну здатність.
Що збільшується з кожним роком число робіт в області розвитку і випробування методик лазерної флуоресцентної діагностики злоякісних утворень дозволяє сподіватися на те, що в недалекому майбутньому ці методики разом з лазерною фотодинамічної терапії раку займуть міцне місце в клініках.
Діагностика ішемії серцевого м`яза. Багато флуоріметріческіе дослідження живих клітин засновані на реєстрації відносини концентрацій відновленої і окисленої форм піридин-нуклеотидів [НАДН] / [НАД +], що є коферментами багатьох внутрішньоклітинних реакцій. Це ставлення несе важливу інформацію про стан клітин і складаються з них тканин і органів. Можливість її флуоресцентної реєстрації визначається властивостями НАДН поглинати світло на довжині хвилі ХХ = 340 нм і висвічувати флуоресценцию з максимумом на довжині хвилі Я2 = = 480 нм. НАД + на довжині хвилі не поглинає, а його флуоресценція в області Я2 значно слабше.
Одним з цікавих прикладів застосування цього підходу є реєстрація ішемії серцевого м`яза в нормальних фізіологічних умовах [13]. Характерною особливістю роботи з перфузованої кров`ю органами

Мал. 7.7. Схема лазерного волоконного флуориметра [13]
є сильне обурення, що вноситься в сигнал флуоресценції тканинної циркуляцією крові. Компенсувати це обурення виявилося можливим шляхом одночасної реєстрації інтенсивності флуоресценції на довжині хвилі , і інтенсивності відбитого тканиною випромінювання в максимумі смуги поглинання гемоглобіну (Я3 = 805 нм).
4на рис. 7.7 зображена схема лазерного волоконного флуориметра, створеного для подібних вимірів. Пристрій включає в себе два лазера: азотний (/) і на барвнику (2), як джерела УФ та ІЧ випромінювання, два фотодіода (3), які реєструють відношення вихідних потужностей лазерів, два ФЕУ (4), що вимірюють інтенсивність флуоресценції, індукованої УФ випромінюванням , і інтенсивність відбитого ІК випромінювання. Ця схема, природно, обладнана електронним блоком і мікро-ЕОМ. Параметри азотного лазера: частота повторення імпульсів 140 Гц, енергія в імпульсі 150 мкДж, пікова потужність 30 кВт, середня потужність при частоті повторення імпульсів 100 Гц -

мВт. Тривалість імпульсу лазера на барвнику при тій же частоті повторення - 6 ні.
Як ілюстрацію результату застосування описаного приладу для реєстрації ішемії серцевого м`яза на рис. 7.8 приведена тимчасова залежність інтенсивності відбитого світла (/) і флуоресценції (2) під час нападу ішемії (зупинки перфузії) ізольованою перфузованої моделі серця щура. зменшення відображення

Мал. 7.8. Кінетика зміни відображення (1) і флуоресценції (2) під час нападу ішемії, викликаної зупинкою перфузії серця криси_ (момент tx) і відновленої через 50 с (момент t2)
відбувається за рахунок зменшення концентрації внутрішньотканинний червоних кров`яних тілець, в той час як збільшення інтенсивності флуоресценції відбувається за рахунок збільшення внутрішньоклітинного відносини [НАДН] / [НАД +].
Лазерний волоконний флуориметр може з успіхом застосовуватися при операціях на серці для вивчення метаболізму серцевого м`яза через световодний катетер. Більш того, очевидно, що будь-який орган, доступний для фіброскопа або катетера, може бути об`єктом вивчення за допомогою такого флуориметра. Зауважимо, що нелазерних флуориметр, побудований раніше на базі ртутної лампи, монохроматора, фільтрів і УФ мікроскопа, не дозволяв отримувати достовірні результати головним чином через нестачу чутливості.
Діагностика атеросклерозу. Ще одним перспективним застосуванням флуоресцентної діагностики в медицині стає діагностика атеросклеротичних бляшок і, зокрема, фіброзних бляшок, що є першою стадією атеросклеротичного ураження судин.
Як показано в роботі [26], наявність в посудині атеросклеротичної бляшки може бути визначено шляхом порівняння інтенсивності флуоресценції на довжинах хвиль 580 і 600 нм при порушенні на довжині хвилі 480 нм. На рис. 7.9

Мал. 7.9. Спектри флуоресценції від нормальної (/) і ураженої атеросклерозом (2) артерій [26]
представлені характерні спектри флуоресценції, отримані від нормальної і враженої атеросклерозом артерій. Видно, що вони сильно відрізняються.
Використовуючи той факт, що висота піку на 600 нм відносно мінімуму, що припадає на 580 нм, набагато більше в разі здорових артерій у порівнянні з ураженими, можна скласти ставлення контрасту / (600) // (580). Значення цього відносини, отримане в експериментах, підтверджених відповідними гістологічним аналізом, дорівнює приблизно 2 для нормальних артерій і приблизно 1 для атеросклеротичних.
Численні експерименти показують, що можна достовірно розрізняти нормальну артерію і артерію, що має бляшку товщиною 0,5 мм і більше. І хоча до теперішнього часу результати отримані тільки на трупних артеріях, можна розраховувати, що пряма лазерна діагностика атеросклерозу in vivo через световодний катетер скоро стане можливою. При цьому в разі позитивного діагнозу можна буде за тим же катетеру передавати великі дози лазерного випромінювання в область ураження судини атеросклерозом з метою руйнування бляшок.