Застосування спектроскопії кр в офтальмології - лазерна діагностика в біології та медицині

Застосування спектроскопії КР в офтальмології
Останнім часом спектроскопія КР як неруйнівний неінвазивний метод лазерної діагностики, що дає інформацію про об`єкт на молекулярному рівні і має значні перспективи для проведення аналізу in vivo і in situ, все більше проникає в область медичних досліджень. Першим і залишаються одним з основних застосувань спектроскопії КР в медицині є офтальмологія, а саме вивчення інтактних кришталиків тварин і людини [34-40].

Мал. 6.9. Блок-схема спектрометра для вимірювань in vivo [38]: 1 - лазер на барвниках, 2 - ексимерний лазер, 3 - безперервний Аг лазер ( = 488 нм), 4 - зразок, 5 - дифракційну спектрограф, 6 - синхронний імпульсний генератор, 7 - охолоджуваний багатоканальний детектор, 8- Графобудівник, 9-ЕОМ, 10 - дисплей, 11 - магнітна пам`ять. Штриховими лініями показана частина установки для імпульсної КР-діагностики, яка поки що не реалізована

Розробка КР-мікроспектрометров з багатоканальної реєстрацією спектрів, що забезпечують високу швидкодію і просторову роздільну здатність (локальність) при значній чутливості, відкриває можливість проведення ранньої діагностики такого серйозного і масового захворювання, як катаракта [35, 37, 39, 40].
Блок-схема одного з таких спектрометрів представлена на рис. 6.9. Головним елементом спектрометра є високочутливий охолоджуваний багатоканальний детектор, який в поєднанні з Аг лазером (А. = 488 нм) невеликої потужності (2-30 мВт) дозволяє отримувати КР-
спектри в досить широкій смузі частот за дуже малий час (0,5 с). Ці обставини визначають можливість зняття КР-спектрів in vivo, що і демонструють зображені на рис. 6.10 КР-спектри кришталика ока кролика

Мал. 6.10. КР-спектри кришталика ока кролика в області ядра [39]: 1 - вимірювання in vivo, потужність випромінювання лазера Р = 2 мВт- 2 - вимірювання на ізольованому кришталику (Р = 30 мВт). Час експозиції для кожного з трьох фрагментів спектра порядку 0,5 с
в області ядра [39]. Зауважимо, що потужність випромінювання лазера 2 мВт при часу опромінення 0,5 с є граничною, при якій не відбувається пошкодження сітківки ока.
Подальші удосконалення спектрометра в плані порушення імпульсних КР-спектрів за допомогою перебудованого лазера на барвниках, що накачується ексі- мірним дазером, має дозволити з ще більшою гарантією реалізувати вимірювання in vivo за рахунок оптимізації возбужденіячспектров (підстроювання частоти лазера) і зменшення експозиції (імпульсний режим).
Мікроспектрометр КР на базі даній операції (А, = = 514,5 нм) з потужністю 60 мВт і діаметром плями на об`єкті 2 мкм описаний в [37].
Таблиця 6.1
Характерні смуги спектра КР свіжоприготованого цілого кришталика ока кролика, отриманого від поверхневого шару під ядром кришталика.
Значення КР-зрушень частоти наведено без урахування нелінійності шкали довжин хвиль спектрографа (фенілаланін - Ф, тирозин - TP3, триптофан - ТРФ) [37]

Спектри кришталика знімалися в діапазонах 200-1400, 700-1900, 2400-3600 і 2800- 4000 см-1 за допомогою дифракційного спектрометра і багатоканального аналізатора з лінійкою з 1024 фотодіодів. Час вимірювання повного спектра становило 5-30 хв. Дані по КР-зрушень частоти характерних смуг в спектрі і результати їх віднесення, наведені авторами [37], представлені в табл. 6.1.
КР-спектр нормального кришталика утворюється перекриваються спектрами так званих а-, бета- і у-Кристалін - структурних протеїнів, загальна вага яких в кришталику ссавців становить приблизно S3% від загальної ваги кришталика, спектрами їх / похідних (в основному агрегатів протеїнів) і води , що міститься в кришталику [34]. За допомогою спектроскопії КР вивчається молекулярна структура нормальних, постарілих і катарактальних кришталиків тварин і людини, в тому числі і кришталиків, підданих впливу лікарських препаратів [34-40]. Найбільш цікаві результати отримані для вторинної структури протеїнів кришталика і для микроокружения бічних груп протеїнів, таких як триптофан, тирозин і сульфідні групи. lt; 2 точки зору ранньої діагностики катаракти становлять інтерес наступні смуги [38, 39]: смуга в діапазоні 3600-3100 см-1, що визначається наявністю води в хрусталіке- смуга з частотою 2580 см-1 (2568 см-1 за даними [37 ], табл. 6.1), віднесена до валентних коливань сульфідних груп дістеінового остатка- дублетні смуги тирозину на 855 і 831 см-1 конформаційні смуги полі- пептидного підстави на 1672 см-1 аміду-1 і 1240 см-1 аміду-3- смуги триптофану на 644 см-1 і фенілаланіну на 624 см-1 (622 см-1 [37], табл. 6.1).
Відношення інтенсивності смуги 3390 см-1 (ОН-валентні коливання) до інтенсивності смуги 2935 см-1 (СН-валентні коливання) змінюється від 0,40 для прозорого кришталика до 0,50 для катарактального кришталика ока кролика (табл. 6.2). При обробці кришталика антікатарактальним лікарським препаратом це співвідношення встановлюється на рівні 0,43. Зворотні процеси відбуваються в ядрі кришталика ока миші при старінні, коли це відношення зменшується від 0,33 до 0,18 [34]. Ці • зміни свідчать про втрату води в процесі старіння. У той же час дослідження трьох типів катаракт у мишей показує, що інтенсивність ОН-валентних коливань (3390 см-1) істотно зростає в міру помутніння кришталика. Наприклад, ставлення інтенсивностей для катарактального і нормального кришталиків при однаковому віці, рівному 4 місяців, становить 1,1-1,4.
Таким чином, відносна інтенсивність характеристичних коливань Н20 може служити в якості тесту при діагностиці катаракти. Однак необхідні відповідні дослідження на кришталиках людини.
Відносини інтенсивностей найбільш характерних КР- смуг кришталика ока кролика, чутливих до ви- 194 штучно викликаної за рахунок відповідної дієти катаракті, представлені в табл. 6.2 [38]. Ці зміни в смугах, відповідних воді, сульфідним групам, тирозину, триптофану і фенілаланіну, а також Аміду-1 та аміди-3, припускають ряд структурних модифікацій, що виникають при формуванні катаракти, які призводять до часткового перетворення ТРИПТОФАНОВИХ залишків протеїнів кришталика з «закритою» в «відкриту» форму, можливості залучення тирозинових залишків в передбачуваний процес «агрегації протеїнів», одночасного часткового перетворенню SH-груп цистеїну в S-S зв`язку.
Таблиця 6.2
Ставлення інтенсивностей КР-смуг кришталика ока кролика
Катаракта викликана штучно за рахунок дієти. Лікарський препарат - Dondalina [38]

При дослідженні структурних змін катарактальних кришталиків людини виникають певні труднощі через їх сильної флуоресценції, яка посилюється з віком. Відношення інтенсивності флуоресценції до інтенсивності окремих смуг в КР-спектрі є мірою патології кришталика, що пов`язано з його помутнінням за рахунок флуорофорів (високомолекулярних агрегатів протеїнів) [34-40]. Вплив антікатарактальних препаратів значно знижує фон флуоресценції в КР-спектрах. Цей ефект може служити мірою дії препаратів [38]. З іншого боку, збільшення довжини хвилі збуджуючого лазера від 406,7 нм до 514,5 нм і далі До 647,1 нм дозволяє сильно зменшити фон флуоресценції і надійно реєструвати КР спектри [34].
За допомогою розробленого в [37] багатоканального мікроспектрометра виявилося можливим отримувати КР-спектри мікрооб`ємів кришталиків очей кролика і людини, порівнянних з розмірами локальних помутніння в катарактальної кришталику, які були визначені за допомогою електронної мікроскопії. У прозорому кришталику були помічені зміни КР-спектрів протеїнів при скануванні сфокусованого лазерного пучка від центру до периферії кришталика. Однак не було помічено змін в спектрах двох сусідніх ділянок кришталика - прозорого і скаламученого. Це може бути пов`язано з труднощами налаштування перетяжки сфокусованого пучка світла на мутне мікровключення або, дійсно, з дуже малими змінами КР-спектрів сусідніх ділянок. Помутніння кришталика в цьому випадку може бути пов`язано з флуктуаціями дальнодействующего порядку орієнтації протеїнів, викликаного дуже малими змінами пептидних ланцюгів, і може бути досліджено за допомогою поляризаційної спектроскопії КР [37] і спектроскопії пружного світлорозсіювання (гл. 2).
Певну надію на рішення найближчим часом проблеми ранньої діагностики катаракти методом спектроскопії КР вселяють успішно проведені in vivo вимірювання КР-спектрів кришталика ока кролика в області ядра (див. Рис. 6.10). Це виявилося можливим завдяки розвитку техніки спектроскопії КР із застосуванням багатоканальних оптичних аналізаторів, що дозволяють з високою чутливістю реєструвати широку смугу КР- спектра за час порядку 0,5 с [36,38,39]. В [39] використаний багатоканальний детектор типу Tracor TN-6500, а в [37] - EG & GPA ОМА 111 з лінійної з 1024 діодів, дозволяє знімати КР-спектри за кілька хвилин. Фірма Жобен Івон (Франція) випускає універсальні повністю автоматизовані мікроспектрометри КР типу V1000 і S3000, оснащені багатоканальними оптичними детекторами.