Застосування спектроскопії кр в біохімічних дослідженнях - лазерна діагностика в біології та медицині

6.2 Застосування спектроскопії КР
в біохімічних дослідженнях
Вивчення білків. Класичними об`єктами для застосування спектроскопії КР до біомолекул є білки і їх компоненти. Причому якщо перші КР-спектри білків були отримані в кінці 50-х років за допомогою ламп, то в останні два десятиліття в якості джерел збудження застосовують виключно лазери.
Метою більшості досліджень, що проводяться методами КР, є вивчення структури молекул і вивчення окремих функціональних груп, що визначають їх біохімічну активність [9, 10].
Зі звичайного (спонтанного) КР-спектра білка можна отримати інформацію про його структурних характеристиках, наприклад про середню конформації основний поліпептидного ланцюга [П. 8]. Зокрема, така інформація міститься в положенні і формі контурів смуг амід-1 і амід-3. Дійсно, кожна амидная група в молекулі білка має інтенсивну лінію амід-1, положення якої в спектрі залежить від конформації даної ділянки молекули. Більшість амідних груп в складі, наприклад, а-спіральної конформації відчуває приблизно однаковий вплив з боку сусідніх атомів і, таким чином, має приблизно однакову частоту лінії амід-1 (1645- 1657 см-1).
Амідні групи, що знаходяться в складі (3-структурного фрагмента молекули, мають кілька відрізняється частоту цієї лінії (1665-1672 см-1). Оскільки вторинна структура реальної молекули білка складна, то спостерігається в КР-спектрі цього білка смуга амід-1 являє собою суперпозицію окремих ліній.
Те ж відноситься до смузі амід-3, в якій по-різному проявляються лінії: 1260-1295 см-1 (слабка), 1230- 1240 см-1 (сильна) і один тисяча двісті сорок п`ять ± 3 см-1 (широка), що відносяться відповідно ка -спіральні, (5-структурної і невпорядкованою конформації.
Звідси видно, що, аналізуючи положення максимуму і форму контуру смуги (наприклад, розкладаючи експериментальну смугу але спектрами окремих структур), можна отримувати кількісні оцінки змісту окремих типів структури в досліджуваному білку.
Великий матеріал, накопичений до теперішнього часу по встановленню вторинної структури різних білків, багато в чому заснований на дослідженні КР-спектрів моделей поліпептидів з відомою структурою [9, П. 8].
Продемонструємо можливості спектроскопії КР при дослідженні конформації білків і поліпептидів в водних розчинах і в твердому стані на прикладі вивчення структури і взаємодії С-протеїну і міозину [11]. Ці білки з молекулярною вагою 140 ТОВ і 460 000 відповідно виділяли з скелетних м`язів кролика. Розсіювання порушували Аг лазером (Ji = 488,0 нм), реєстрацію проводили з роздільною здатністю 5 см-1.
На рис. 6.4 наведені КР-спектри С-протеїну, міозину і їх комплексу. Для спектру С-протеїну (рис. 6.4а) характерні сильна лінія амід-1 (1 668 см-1) і порівняно добре виражена смуга амід-3 (одна тисяча двісті сорок дві см-1). Таке їх положення і співвідношення свідчать про те, що молекули С-протеїну знаходяться в конформаціях р-структури і статистичного клубка приблизно в рівній пропорції.
Для міозину (рис. 6.46) характерно слабке розсіювання в області лінії амід-3, в той час як коливання амід-1 проявляється сильним лінією тисяча шістсот п`ятьдесят три см-1. Спостерігається також значна лінія на 939 см-1, що відповідає поздовжнім коливанням основний поліпептидного ланцюга молекули. Це свідчить про те, що більшість молекул міозину знаходиться в а-спіральної конформації і незначна їх частина - в | $ -структур ної конформації.
При утворенні комплексу міозин - С-протеїн молекули останнього приєднуються до молекули міозину в декількох місцях, зокрема в галузі легкої ланцюга мероміозіна і в області субфрагмента-2 хвоста цієї молекули. Така взаємодія, здавалося б, могло суттєво позначитися на конформаціях обох молекул. Однак аналіз КР-спектра комплексу (рис. 6.4в) показує, що конформаційних змін молекул не відбувається ні в водному розчині, ні в твердому стані.

Мал. 6.4. КР-спектри: а - С-протеїну (3% -ний розчин), б - білка міозину (6% в таблетці), в - комплексу міозин - С- протеїн (6% в таблетці). Виміри проводилися при однакових умовах: в присутності 0,09 моль КС1 і 5 * 10&ldquo-3моль К3РО4
lt; оН = 7,0) [11]
Використовуючи методи РКР, можна в багатьох випадках досліджувати окремі атомні групи і їх функції в біомолекул. Так, резонансний варіант АСКРО використовувався для вивчення складних молекул Р-каротину, вітаміну Bi », металлопорфирин [12]. Цікавим є дослідження взаємодії коферменту флавінаденіндінуклеотіда (ФАД) з білком-ферментом глюкозоксидаза [13, 14]. Цікавою особливістю проведених експериментів є те, що в максимум смуги поглинання ФАД потрапляє довжина хвилі антистоксових сигналу, а не довжина хвилі випромінювання накачування. У тому ж випадку коли резонансної є довжина хвилі накачування, якість отриманих спектрів істотно погіршується. В роботі [14] експериментально підтверджено наявність водневого зв`язку ФАД - фермент.
Розглянемо більш докладно приклад дослідження методом АСКРО механізму каталітичної активності білка ферменту а-хімотрипсину [15-17]. Активний центр цієї молекули включає імідазольна групу залишку Гіс57, пов`язану водневими зв`язками із залишками Асп 102 і Сер 195, в результаті чого утворюється система з перенесенням заряду. Можливість детального опису процесу, що відбувається в активному центрі а-хімотрипсину, передбачає наявність інформації про ступінь протонізації групи Гіс 57: процес перенесення протона в водневих зв`язках призводить до зміни протонізації імідазольної групи, що має знайти відображення в зміні її коливального спектра.
Дійсно, АСКРО-спектри дозволяють по співвідношенню інтенсивностей певних ліній (зокрема, лінії 1 164 см-1) одержувати інформацію про зміст тієї чи іншої (протоновану або непротонірованной) форми імідазолу. Використання АСКРО дозволяє реєструвати лінії імідазолу, не виявляються в спектрах спонтанного КР.
На рис. 6.5 приведена схема АСКРО-спектрометра, побудованого спеціально для дослідження біомолекул, для чого в ньому використані лазери з високою імпульсної і порівняно низькою середньою потужністю [4]. Основою спектрометра є лазер на АІГ: Nd, що працює в режимі акустооптичні модуляції добротності і синхронізації мод. Вихідна випромінювання являє собою цуги імпульсів, що випливають із частотою 5 кГц. Тривалість окремого імпульсу в Цузі становить 80-85 пс, імпульсна потужність 0,7 МВт. Випромінювання що задає (1060 нм) після подвоєння по частоті в кристалах LiIOs використовується в «сигнальному» каналі і в каналі синхронної накачування лазера на барвнику. Плавне перебудова довжини хвилі генерації цього лазера проводиться в діапазоні 0,56-0,60 мкм, що відповідає діапазону різниці частот vx-v2 = 950-2100 см-1. Ширина лінії генерації становить 0,5 см-1, тривалість імпульсу 50-60 пс, імпульсна потужність 20 кВт. Для зменшення середньої потужності випромінювання другої гармоніки (530 нм), що падає на зразок, з цуга виділяється одиночний імпульс. При цьому в «сигнальному» каналі випромінювання має середню потужність 30-40 мВт, імпульсну - 15 кВт, тривалість імпульсу 50-60 пс.

Мал. 6.5. Блок-схема спектрометра АСКРО [4]: 1 - АІГ: Nd лазер, 2 - кристали LiI03, 3 - камера «Агат», 4 - дзеркала, 5 - лазер на барвниках, 6 - схема виділення одиночного імпульсу, 7 - ромб Френеля, 8 - лінія затримки, 9 - дихроичное дзеркало, 10 - кювета, 11 - лінзи, 12 - діафрагма, 13 - призма Глана, 14 - інтерференційний фільтр, 15-подвійний монохроматор, 16 - ФЕУ, 17 - багатоканальний аналізатор, 18 - модулі КАМАК , 19 - графічний пристрій, 20 - ЕОМ
Випромінювання другої гармоніки vx і лазера на барвнику v2 фокусується лінзою на кювету з зразком. Генерується антістоксов сигнал колімуючих і фокусується лінзами на вхідну щілину монохроматора. Для придушення нерезонансного фону лінійні поляризації випромінювань накачування vx і v2 розлучаються за допомогою ромба Френеля. Обертанням аналізатора (призми Глана) поблизу положення максимального придушення нерезонансного сигналу домагаються істотного видозміни спектру. Це дає можливість управляти формою спектра за рахунок зміни умов інтерференції нерезонансних і резонансної складових сигналу.
Сигнал АСКРО, спектрально відфільтрований від засвічень за допомогою подвійного монохроматора, потрапляє на ФЗУ, що працює в режимі рахунку фотонів. Далі інформація накопичується в багатоканальному аналізаторі. Реєстрація, обробка сигналу і перебудова лазера на барвнику виробляються при допоможи мікро-ЕОМ.
Здійснюючи амплітудно-поляризационное придушення нерезонансного фону, за допомогою описаної установки вдалося, зокрема, встановити гидрофобность оточення имидазольного кільця в проміжку між субглобуламі молекули а-хімогріпсіна, де розташований її активний центр. На рис. 6.6 наведено спектри амплітудно-поляризаційної АСКРО а-хімотрипсину в діапазоні 960- 1060 см-1.

Мал. 6.6. АСКРО-спектр водного розчину а-хімотрипсину при різних кутах між віссю поляризационного аналізатора і вектором поляризації нерезонансного сигналу lt; р: - 1,0 ° (а), 1,5 ° (б),
0 ° (в) [4]
У цьому діапазоні лежать частоти коливань, характерних для амінокислотних залишків фенілаланіну (1004 см-1), триптофану (1014 см-1), а також валентних коливань зв`язку С-N (1033 см-1). Цікаво відзначити, що всі шість залишків фенілаланіну, що входять до складу білка, знаходяться в безпосередній близькості від активного центру.
Всі спектри були отримані при одінакозих умовах і відрізняються один від одного кутом між віссю поляризационного аналізатора і вектором поляризації нерезонансного сигналу (lt; р). Крім придушення нерезонансного фону поляризационная методика дозволяє управляти формою спектра, виділяючи або послаблюючи в ньому ті чи інші лінії. Зокрема, в експерименті виявлена лінія 1010 см-1, яка зовсім не виявляється в спектрах спонтанного КР. Питання про відповідність цієї лінії певних елементів вторинної структури білка є предметом майбутнього дослідження.
Унікальну можливість вивчати стан окремих атомних груп, розташованих на поверхні макромолекул, дає також спектроскопія ГКР 17, 18, 19]. За останні роки за допомогою цього методу досліджено велике число білків і складових їх амінокислот. Зокрема, для водорозчинних білків було показано [19], що посилення КР спостерігається тільки для груп атомів, які знаходяться на поверхні білкової глобули і взаємодіють з металом. У той же час лінії амід-1 і амід-3 в спектрах ГКР не виявляються. Мабуть, це пов`язано з ефектом екранування пептидних груп бічними ланцюгами амінокислотних залишків, що віддаляє їх від поверхні металу і перешкоджає ефективному посиленню відповідних коливань.
Можливості ГКР при вивченні білків продемонструємо на прикладі світлочутливого мембранного білка - бактеріального родопсина (БР). Молекули цього білка здійснюють трансмембранний перенос протонів. Для розуміння молекулярного механізму функціонування БР необхідно визначити топографію його хромофорного центру (положення залишку ретиналя). Метод спектроскопії ГКР був використаний для встановлення розташування ретиналю щодо поверхні мембран [20].
При адсорбції на гидрозолей срібла пурпурна мембрана, яка містить БР, може взаємодіяти з сріблом як зовнішньої, так і внутрішньої стороною (рис. 6.7). Наявність в спектрі смуг коливань хромофора підтверджує висновок про зближення ретиналю з поверхнею мембрани. Відзначимо, що схожість спектрів РКР і ГКР в області 1000-1400 см-1 свідчить про те, що при адсорбції білка поліеновие ланцюг ретиналю повністю зберігає трансконфігурацію, характерну для БР в водної суспензії.
Вивчення нуклеїнових кислот. Перший КР-спектр ДНК був отриманий в 1968 р [21]. Починаючи з цього моменту проведено велику кількість досліджень методом спектроскопії КР вільних підстав і нуклеотидів, комплексів їх з білками [22], важкими металами та іншими елементами і сполуками. Були отримані КР-спектри розчинів природних вірусів [23] і хромосом [24].

Мал. 6.7. РКР-спектри водної суспензії пурпурних мембран різної концентрації: а - 10_6, в - 10-7 моль / л, б - ГКР-спектр пурпурних мембран, адсорбованих на срібному гидрозолей, концентрація 10-7 моль / л-в нижньому діапазоні чутливість збільшена в два рази [20]
Можливості спектроскопії КР для дослідження різних особливостей нуклеїнових кислот можна продемонструвати експериментом по плавлення ДНК [25]. На рис. 6.8 наведені отримані при різних температурах КР-спектри ДНК, виділеної з тимуса теляти. Так як температура плавлення ДНК лежить в інтервалі 80- 85 ° С, то по КР-спектрах можна судити, що відбувається з молекулами в процесі плавлення.
Вивчення температурної залежності КР-спектрів помазує, що за температурними профілями інтенсивностей

Мал. 6.8. КР-спектри водного розчину ДНК, виділеної з тимуса теляти при температурі 98 (а), 84 (б) і 25 ° С (в) - рН = 7,0 [25)
і частотам ліній різні внутрішньо-молекулярні зв`язки можна віднести до різних категорій: 1) зв`язку підстав, яким відповідає оборотне зменшення інтенсивностей ліній, попереднє точці плавлення, т. е. певне явище предплавленія- 2) зв`язку підстав, для яких температурна залежність виражена слабо або взагалі відсутня - 3) дезоксірібозофосфатние зв`язку основному ланцюзі, для кодебаній яких характерна відсутність температурної залежності нижче точки плавлення і сильне падіння ікуенсівності в цій точці.
Деякі лінії, які відповідають усім 4 підставах (Аленина (А), - тимін (Т), цитозин (С) і гуаніну (G)), зазнають поступове зростання в інтенсивності з ростом температури нижче точки плавлення. При досягненні цієї точки відбувається різке збільшення інтенсивності цих ліній (наприклад, лінії Т 1240 см-1 на рис. 6.8). Це говорить про те, що деякі зміни в розташуванні основ відносно один одного (вертикальний стекінг) починають відбуватися, починаючи з температури 50 ° С, м. Тобто істотно нижче точки плавлення. При досягненні точки плавлення молекули ДНК змінюють свою конформацію, переходячи з Б-форми в форму випадково невпорядкованого клубка.
Високочутливим методом реєстрації тонких конформаційних змін в ДНК стала спектроскопія ГКР. Зокрема, реєструються тонкі ефекти дестабілізації подвійної спіралі ДНК, викликані дією навіть низьких доз іонізуючого випромінювання здійснюватиме [27] і мутагенних чинників [28].