Лазерна спектроскопія квазіпружного розсіювання - лазерна діагностика в біології та медицині

ЛАЗЕРНА СПЕКТРОСКОПІЯ квазіупругая РОЗСІЯННЯ
У цьому розділі розглянуто можливості використання лазерного светорассеяния для вивчення динамічних характеристик біологічних мікрооб`єктів: коефіцієнтів дифузії, швидкостей спрямованого транспорту і міграційного руху, параметрів внутрішньомолекулярної і внутрішньоклітинної рухливості. За цим вимірюваним характеристикам можна розраховувати розміри, масу і ряд інших характеристик розсіювачів. Це область так званого квазіпружного светорассеяния, при якому не відбувається істотної зміни довжини хвилі зондуючого випромінювання на відміну від комбінаційного розсіювання, яке буде розглянуто в гол. 6.

3.1. Фізичні основи методу. Основні типи спектрометрів

Фізичні основи. Нехай на середу, що містить рухомі розсіюють частинки, падає монохроматична лінійно поляризована світлова зондуюча хвиля Е3 з хвильовим вектором Д3 (рис. 3.1). Так само, як в експерименті по пружності Светорассеяніє, розсіяна хвиля реєструється в віддаленій точці під кутом 0. Вона характеризується хвильовим вектором gv. Якщо знехтувати можливістю багатократного розсіяння і взаємодією частинок один з одним, то розсіяне світло можна уявити як суму незалежних вкладів від N одночасно розсіюють частинок:

де Ep0j - амплітуда світлової хвилі, розсіяною на / -й частці з залежною від часу координатою г, (0, Ф - фаза / -й розсіяної хвилі, яка визначається через різницевий хвильової вектор розсіювання q = qv-q3 як Oj = qrj (t ).
Як вже говорилося, при квазіупругая розсіянні = 2яп / к. Отже, чисто геометрично з
Мал. 3.1. Геометрія експерименту по квазіупругая Светорассеяніє
Мал. 3.1 можна отримати для модуля хвильового вектора розсіювання вираз
(3.1)
Слід зауважити, що крім координати центру мас частки від часу можуть залежати і амплітуди Ep0j, наприклад, при зміні в процесі вимірювання розсіюють властивостей, конфігурації або конформації частинок, при обертальному русі несферичних частинок і в ряді інших випадків. В результаті для розсіяної хвилі отримуємо вираз
(3.2)
Звідси видно, що, реєструючи тимчасові зміни (динаміку) амплітуди і фази (частоти) розсіяного випромінювання, можна в принципі отримати більшу інформацію про динамічні параметри розсіювачів. Ще раз підкреслимо, що квазіупругая розсіювання визначається порівняно повільними динамічними процесами з характерними часом в діапазоні 10&ldquo - * - 1 с, що істотно більше характерних часів швидких внутрішньо молекулярних коливань, що визначають неупругое взаємодія випромінювання з біомакромолекул (див. гл. 6).
Тимчасові зміни параметрів квазіупругая розсіяного випромінювання проявляються в зміні його кореляційної функції або, що те ж саме, в зміні його частотного спектра. Залежно від характеру руху розсіювачів оптичний спектр або тільки уширяется, або у нього з`являються додаткові максимуми на зсунутих частотах. Однак ці розширення і зрушення, що становлять в залежності від досліджуваного об`єкта, як правило, від 10 Гц до 10 МГц, настільки малі в порівнянні з частотами оптичного діапазону (близько 5-1014 Гц), що зареєструвати їх традиційними методами оптичної спектроскопії не представляється можливим - навіть найкращі оптичні спектрометри з інтерферометрами Фабрі - Перо не дозволяють розрізнити в оптичному діапазоні компонент, розташований ближче 10 МГц. Отже, для вирішення поставлених завдань необхідно здійснювати спектральний аналіз з надвисокою роздільною здатністю.
Це стало можливим після розробки в 60-х роках методу оптичного змішання (ОС), що увійшов в широку практику тільки з появою лазерів. Суть цього методу полягає в тому, що при змішуванні на квадратичном фотоприемнике (фотодіоді, фотоумножителе) світлових хвиль різних частот на виході цього фотоприймача утворюється електричний сигнал, промодулірованний різницевими частотами. Так як в розглянутому нами випадку ці частоти близькі, то сигнал має характер биття, спектр яких однозначно пов`язаний зі спектром розсіяного світла. При цьому, як уже говорилося, він розташований в діапазоні низьких частот і може бути підданий аналізу вже не оптичними, а радіотехнічними засобами, що дають цілком достатня спектральний дозвіл (аж до доль герца). Теорія і методи практичної реалізації ОС при реєстрації квазіпружного светорассеяния описані в багатьох книгах і оглядах (див., Наприклад, [1-15]).
Типи спектрометрів ОС. Розглянемо принципи дії двох основних різновидів цих спектрометрів. Монодінние спектрометри (МС), звані також іноді гомодинного, працюють за принципом виділення частот самобіеній різних спектральних компонентів розсіяного світла. Схема МС зображена на рис. 3.2. У МС на фотоприймач подається тільки розсіяне досліджуваними частками поле Ер. Фотоприймач, як говорилося вище, реєструє напруженість, а квадрат напруженості поля. Тому вихідний струм 1фп виявляється пропорційним величині | р | 2. Коефіцієнт пропорційності залежить від квантової ефективності приймача і від когерентних властивостей розсіяного світла. Саме для того, щоб весь світ, реєстрований приймачем, був когерентним, т. Е. Щоб все хвилі, розсіяні різними частками досліджуваного об`єкта, потрапляли на фоточувстві- вальну поверхню приймача в фазі, тілесний кут
збору 0 розсіяного випромінювання в спектрометрах ОС зазвичай обмежується діафрагмами. У разі МС кут когерентності зручно оцінювати виразомде I - характерний розмір зондіруемой області [9].
Виконуючи операцію зведення в квадрат вирази (3.2) і обчислюючи спектр потужності фотоструму, можна показати,

Мал. 3.2. Схема лазерного МС: 1-лазер, 2 апаратура обробки сигналу, 3 - лімфрагми, 4 - лінзи, 5 - фотоприймач
що цей спектр складається з трьох компонентів: постійної складової, дробового шуму і спектра флуктуацій інтенсивності реєстрованого поля, як раз і несе корисну інформацію. Зауважимо, однак, що в МС оптичний спектр без спотворень повторюється в спектрі фотоструму тільки в разі гаусом статистики розсіяного поля. Це, як правило, виконується, якщо число одночасно розсіюють частинок, що дають внесок в реєстроване поле, N ^ gt; 1.
Принциповою відмінністю гетеродинних спектрометрів (ГС) оптичного змішання від МС є те, що на фотоприймач крім розсіяного досліджуваним об`єктом випромінювання подається опорна (гетеродина) хвиля ЕГ з фіксованою частотою. Інтенсивність цієї хвилі повинна бьпь у багато разів більше інтенсивності розсіяного поля. Як опорний, як правило, використовується частина випромінювання того ж лазера, який збуджує розсіювання. Воно може підводитися на фотоприймач або за допомогою системи дзеркал, як на рис. 3.3, або це може бути випромінювання, розсіяне на нерухомих розсіювачах, розташованих поблизу вимірювального об`єму, наприклад, на стінках кювети. У деяких випадках для отримання опорного випромінювання може використовуватися другий лазер, синхронізувати з першим.
Ефективне оптичне змішання розсіяною і опорної хвиль на фотоприемнике в ГС відбувається тільки при узгодженні їх хвильових фронтів. Це означає, що геометрія розташування елементів установки, що визначає кути збору і падіння на фотоприймач розсіяною і опорної хвиль, повинна бути такою, щоб ці хвилі були когерентними. Ця обставина створює певні труднощі в налагодженні ГС. Однак труднощі окупаються перевагами ГС в порівнянні з МС, які в деяких випадках виявляються принципово важливими.
Одна з переваг випливає з того, що за умови | г | ^ gt; | р | і високу ефективність змішування цих хвиль

Мал. 3.3. Схема лазерного ГС: позначення ті ж, що і на рис. 3.2,
6 - дзеркала
корисна складова сигналу г`фП виявляється пропорційною інтенсивності опорного пучка. Ця обставина дозволяє домогтися виграшу в величині корисного сигналу.
Принципово важливим також є те, що у ГС інформативна складова спектра потужності фотоструму, також включає в себе постійний і шумовий компонент, повторює оптичний спектр незалежно від статистики розсіяного поля. Крім того, ГС на відміну від МС чутливі не тільки до рухів розсіювачів типу рівноважної дифузії, розсмоктуються флуктуацій і випадкових міграцій, але й до спрямованим рухам. Ця особливість ГС виявляє їх близьку спорідненість з лазерними доплероскім анемометрами (ЛДА) - приладами, призначеними спеціально для вимірювання швидкостей потоків рідин і газів [13, 14].
Як вже видно з назви, принцип роботи цих приладів заснований на реєстрації зрушень частоти випромінювання, розсіяного рухомими частинками. Поява цих зрушень в розсіяному світлі в найпростішому випадку, коли розсіювачі рухаються в одному напрямку з постійними швидкостями, видно з аналізу виразу (3.2). Дійсно, якщо rj (t) = r0j (t) + v0jt, то

е. фази розсіяних хвиль змінюються лінійно за часом. Так як частота хвилі є похідна за часом від фази, то це і означає, що в даному випадку розсіяне світло набуває постійні зрушення частоти
(3.3)
мають доплеровское походження. тут lt; р - кут між напрямками векторів q і V. Всі безліч доплеровских зрушень частоти, що містяться в розсіяному світлі, називається доплеровским спектром. Звертає на себе

Мал. 3.4. Схема диференціального ЛДА: позначення ті ж, що на рис. 3.2 і 3.3
увагу лінійна залежність доплеровских зрушень частоти від швидкостей руху розсіюють частинок.
Як один із прикладів, взятих з великої різноманітності схем ЛДА, розроблених до теперішнього часу [14], розглянемо зображену на рис. 3.4 так звану диференціальну схеіу, що застосовується в біомедичної діагностики [7]. У цій схемі область вимірювання (або, як часто говорять, вимірювальний об`єм) формується перетином двох зондирующих пучків однакової інтенсивності та елементами приймальної системи, що включає в себе в найпростішому випадку лінзу і дві діафрагми. Вихідний сигнал фотоприймача так само, як в ГС, утворюється в результаті оптичного змішання на його фотокатоде двох полів. Однак в даному випадку змішуються поля, розсіяні від обох зондирующих пучків. Особливістю диференціальної схеми ЛДА є те, що узгодження хвильових фронтів двох розсіяних хвиль досягається автоматично в широкому тілесному куті. Завдяки великій приймальні апертурі диференціальних ЛДА, вони часто використовуються при вимірах в слабо розсіюють середовищах. Візуалізація вимірювального об`єму в області перетину зондирующих пучків також дає додаткові зручності.
Зі сказаного вище ясно, що ЛДА і ГС є прилади одного типу. Різниця в назвах носить історичний характер і підкреслює різні боки одного і того ж принципу вимірювання: ЛДА призначені виключно для дослідження спрямованих ламінарних і турбулентних потоків, в той час як ГС часто використовуються також і для вивчення ненаправленої (дифузійних) процесів переносу. В обох типах приладів шукана інформація виходить, як правило, з кореляційних функцій або спектрів потужності сигналів фотоприймача. Тому в літературі використовуються і такі назви, як кореляційні або доплеровские спектрометри.
На практиці обробка вихідного електричного сигналу кожного з цих спектрометрів виконується аналоговими або цифровими методами, які ми обговоримо в наступному параграфі, а зараз розглянемо вимоги, що пред`являються до основного елементу всіх спектрометрів ОС - лазеру. Саме завдяки монохроматичности, когерентності і високої спрямованості лазерного випромінювання стало можливим ефективно здійснювати ОС. В абсолютній більшості випадків в спектрометрах ОС, призначених для дослідження біологічних об`єктів, використовуються безперервні одномодові Ні-Ne лазери. Потужності серійно випускаються Ні-Ne лазерів (1 50 мВт) цілком вистачає для отримання достатньої для реєстрації інтенсивності розсіяного світла.
Основна проблема вибору потужності зондуючого пучка полягає в тому, щоб не внести збурень в досліджуваний об`єкт. Особливо це стосується живих об`єктів - клітин, а також інших об`єктів, сильно поглинають світло. Використання багатомодових лазерів може привести до погрішностей у вимірах в зв`язку тим, що відстань по частоті між сусідніми поперечними модами можна порівняти з характерними змінами в спектрах, мають місце при розсіянні на біологічних об`єктах.
Якщо говорити про вибір довжини хвилі, то тут важливо, що чим вона менша, тим сильніше розсіюється світло. Крім того, диффузионное розширення спектрів обернено пропорційно квадрату довжини хвилі. Отже, чим менше , тим ширше спектр і тим м`якше вимоги до системи обробки сигналу. Тому в ряді випадків в спектрометрах ОС використовуються безперервні аргонові лазери, що генерують в синьо-зеленій області довжин хвиль. При виборі довжини хвилі, звичайно, слід враховувати спектр поглинання досліджуваного об`єкта. На практиці Ні-Ne лазери виявляються краще в силу меншої вартості і більшої компактності. Конкретний тип лазера вибирається також з міркувань стабільності випромінювання, так як технічні флуктуації зменшують відношення сигнал / шум.