Застосування спектроскопических методів аналізу - біоматеріаловеденіе - полімери медичного призначення

Серед способів інструментального аналізу, що використовують фізико-хімічні методи [26], спектроскопії належить особливо важлива роль. У сфері біохімії, включаючи клінічний аналіз, широко застосовуються ІК і УФ спектроскопія, дослідження видимого спектру, флюорографічний аналіз, лазерна Раман-спектроскопія, дисперсно-обертальна спектроскопія, круговий дихроизм, ЯМР-спектроскопія, електронно-спіновий резонанс і інші методи спектроскопічного аналізу. Всі вони успішно практикуються в області мікроколічественного, якісного і структурного визначення різних високомолекулярних речовин типу білків і нуклеїнових кислот в розчинах і в інших агрегатних станах.

ІК спектроскопія відображення

Загальні принципи, методи і призначення ІК спектроскопії досить добре відомі, і автор відсилає читача до спеціальної літератури з цього питання [26, 27, 28].

Рис 71. Принципова схема ІК спектроскопії методом відображення (ATR). А - середовище з високим коефіцієнтом заломлення (призма ATR) - Б - зразок (полімерна плівка).
Мал. 72. Схема власника призми ІК спектрографа, чинного за способом ATR.
1 - підтримуюча пластіна- 2 - прокладка прокладка- 3 - зразок у вигляді пленкі- 4 - регулювальний гвинт 5 - фіксуючий гвинт.
Тут же доцільно торкнутися лише деяких приватних аспектів способу відбивної спектроскопії (ATR). Принцип його реалізації характеризується схемою на рис. 71- робоча частина спектрографа, що діє за принципом ATR, показана на рис. 72.
Призму для створення відображення зазвичай виконують з матеріалу, який в області вимірюваних довжин хвиль прозорий і володіє більш високим коефіцієнтом заломлення (п), ніж досліджуваний полімер. Такий матеріал (KRS) складається з суміші кристалів T1I-Т1Вг (в області 4 мкм, п = 2,38), AgCl (лг = 2,00), Ge (лг = 4,10) і деяких інших компонентів. Відбивну призму щільно затискають між поверхнями досліджуваних зразків у вигляді полімерних плівок- якщо кут падіння променя перевищує критичне значення, т. Е. 0С = = sin_1, створюється повне відображення. Визначення поглинання відбитого променя дозволяє отримати ІК спектр поверхневої частини зразка (на глибину того ж порядку, що і довжина хвилі падаючого променя). Таким чином, використовуючи специфічну особливість відбивної спектроскопії, можна визначити речовини, нанесені на поверхню досліджуваного полімеру, зокрема адсорбовані на ній білки.
Lyman і співр. [29] застосовували відбивну ІК спектроскопію для кількісного визначення адсорбції білка плазми на плівках різних полімерів. Методика диктувалася необхідністю запобігти зіткненню плівки зразка з поверхнею розділу газової і рідинної фаз. Спочатку зразок плівки вимочували в дистильованої воді, потім додавали туди розчин білка і витримували 2 год при 37 ° С, після чого промивали дистильованою водою і залишали стояти на ніч при температурі 50 ° С, або сушили при заморожуванні. Тільки після такої обробки зразки піддавали ІК спектроскопії методом ATR. Концентрацію білка (мкг / см2), адсорбованого на поверхні зразка, кількісно визначали по екстинкції характеристичної смуги поглинання (при 1640 см-1) амід I, т. Е. Смуги, характерною для білків. Як стандарт при вимірах використовували екстинкції характеристичних смуг різних зразків (наприклад, полидиметилсилоксана і поліетилену, що знаходяться відповідно при 1410 і 1460 см-1). Спектральні контури, отримані за такою методикою, представлені на рис. 73.
Таким чином була знайдена кореляція між концентрацією розчину білка і адсорбцією останнього на поверхні полімерного матеріалу. Вона описується адсорбційної изотермой, наведеної на рис. 74. З кривої можна визначити рівноважну концентрацію білка, адсорбованого на поверхні високомолекулярної речовини. Беручи за основу отриманий параметр, можна обчислити товщину шару адсорбованого білка, середню площу адсорбції, що припадає на кожну молекулу білка, і інші характеристики. Результати таких розрахунків при 37 ° С представлені в табл. 43.
Lyman і співр. [29] розглядали табличні дані в поєднанні з параметрами, що описують розміри і конфігурацію молекул білків плазми. Ці параметри були визначені ще в 40-х роках Oncley [30] - вони показані в табл. 44.
Спостереження Lyman можна звести до наступних основних положень:

1. адсорбція білків до гідрофобному полімеру завершується насамперед в мономолекулярному шарі;

1. адсорбція протікає не по бічним (side-on), а по кінцевим (end-on) групам;

Мал. 73. Спектр ІЧ поглинання альбуміну (плазми крові людини), адсорбованого на поверхні поліетиленової плівки [29] (методом ATR).

1. - Поліетилен до контакту;
2. - Після контакту з розчином білка.

Мал. 74. Адсорбція у-глобуліну на поверхні полістирольної плівки (при 37 ° С).

1. за всіма ознаками, конформація адсорбованого білка не зазнавав значних денатураціонние змін. Все сказане можна резюмувати в тому сенсі, що в процесі тромбоутворення роль денатураціонние змін білка дуже невелика.

Таблиця 43. Адсорбція білка плазми крові на поверхні деяких полімерних матеріалів (при 37 ° С)

Таблиця 44. Розміри і конфігурація молекул білків плазми крові [30]

Значний інтерес представляє робота Lee і Kim, які використовували ІК спектроскопію за способом ATR для дослідження кореляції між адсорбцією білка полімером і швидкістю потоку крові [31]. Побудовані ними криві адсорбції альбуміну на поверхні сегментированного поліуретану (сополімер ефіру з уретаном і сечовиною) в різних кінетичних умовах показані на рис. 75. З цих кривих випливає, що чим вище швидкість потоку крові, тим важче досягається стан рівноважної сорбції, іншими словами, чим швидше протікає кров, тим повільніше йде адсорбція білка на поверхні полімеру. Таким чином, по відношенню до адсорбції білка і тромбоутворення роль швидкості потоку крові виключно велика.
Все сказане дозволяє стверджувати, що для загальних якісних досліджень в області адсорбції білка медичними полімерами ІК спектроскопія за способом ATR цілком прийнятна. Це підтверджується спектрами, продемонстрованими в 1976 р на VI симпозіумі по використанню полімерів в медицині [32] - вони наведені на рис. 76. Разом з тим існує ряд проблем і труднощів в цьому напрямку, які ще вимагають свого вирішення. До них належать такі питання.

1. За характеристичним смугах поліпептидів можна ідентифікувати їх структуру (табл. 45). Разом з тим результати ІК спектроскопії ATR, строго кажучи, не збігаються або, у всякому разі, не повністю узгоджуються з положенням і конфігурацією смуг поглинання в спектрі пропускання. Крім того, практично неможливо чітко віднести і детально розділити смугу амід I, тому вкрай важко, використовуючи спосіб ATR, диференціювати різні складові білків з задовільною ступенем дозволу. Нарешті, в низькочастотної області спектра (наприклад, в області аміду V) довжина ІК хвиль зростає, і застосування способу ATR стає неможливим.

1 - ненаповнений силіконовий каучук- 2 - поліфторвініліден- 3 - поліетілен- 4 - блоксополимерами полиметилметакрилата з полівініл ацетатом- 5 - купрофан- 6 - поліетилентерефталат.

Мал. 76. ІК спектри деяких полімерів, що характеризують адсобрціей білка
при контакті їх з кров`ю (знято методом ATR).

Мал. 75. Залежність адсорбції альбуміну на поверхні сегментированного поліуретану від швидкості потоку крові [31].
1 - 0 мл / с- 2 - 3 мл / с- 3 - 6 мл / с- 4 - 9 мл / с- 5-12 мл / с.
Переривчасті криві - до контакту з кров`ю, суцільні - після контакту.
Мал. 77. ІК спектри зразків нейлону 6, зняті методом ATR.

А - образец- Б, В - після контакту з кровью- Б - через 1 год, В - через 24 год.
Таким чином, для тонких структурних досліджень та ідентифікації цей спосіб при самостійному використанні непридатний.

1. Залежно від щільності дотику і ступеня стиснення зразка і призми виникають мікроотклоненія в рівні екстинкції, тому кількісні визначення білків способом ATR дуже непевні.
2. Смуги поглинання 3600-2500 см-1, 1700-1400 см-1 і 900-500 см-1, що відносяться до води, накладаються на смуги амідів, через що при вимірах необхідно елімінувати воду. У зв`язку з цим повідомлялося, що розроблена недавно установка для перетворень Фур`є дозволяє вирішити дану проблему.
3. Операції з видалення води (звичайної сушінням або сушінням із заморожуванням) загрожують небезпекою денатурації адсорбованого білка.
4. Коли в якості зразка використовується полімер, що містить, подібно нейлону, амідні групи, ІК спектроскопія способом ATR неможлива через інтерференції характеристичних смуг поглинання (див. Спектри на рис. 77).

УФ спектроскопія

Для кількісного аналізу білків способом УФ спектроскопії використовуються наступні ключові смуги: а) поглинання в області 250-313 нм з піком поглинання при 280 нм- воно обумовлено залишками ароматичних амінокислот, наприклад, триптофану, тирозину або фенілаланіна-
б) смуга поглинання в області 225-215 нм, яка відноситься до
пептидного зв`язку (-CONH -) -
в) смуга в області 194-191 нм, яку відносять, як і пре
дидущей, до пептидного зв`язку.
Nyilas з співр. [33] вводили в розчин гамма-Булина скляний мікропорошок, що представляє собою суміш сферолітів діаметром 12,5-40,5 мкм з зернами крупності порядку мкм і нижче. Далі визначали на моніторі (по екстинкції 278 нм) концентрацію білка у верхній, прозорої частини рідини і по зменшенню концентрації інтерпольованого адсорбцію білка. Отримали адсорбционную ізотерму, по якій було обчислено, що кількість у-глобуліну, адсорбируемого на поверхні скла у вигляді мономолекулярного шару, вимірюється величиною порядку 0,12 мкг / см2, а усереднена площа адсорбційної поверхні, яка припадає на кожну макромолекул білка, досягає 2180 нм. Очевидно (і це підтверджується табл. 44), що дана площа більша за ту, яка була б зайнята при адсорбції з кінцевим (схема end-on) або по бічних (схема side-on) групам. За всіма передумовами, далеко не виключена можливість того, що в результаті адсорбції конформація глобуліну зазнає змін. Слід зазначити, що такий висновок не повністю збігається з висновками, зробленими Lyman на підставі результатів ІК спектроскопії ATR. Потрібні подальші поглиблені дослідження в цьому напрямку, щоб однозначно відповісти на таке запитання.