Реакція зв`язування комплементу - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень
Реакція зв`язування комплементу (РСК)
З`єднання антитіла з антигеном і комплементом не обов`язково супроводжується руйнуванням антигену. Це. в більшій мірі відноситься до мікробів, які проявляють стійкість до литическому дії комплементу. Те, що відбувається в таких випадках зв`язування комплементу може бути виявлено непрямим шляхом за допомогою методу, відкритого Ж. Борде і С. Жангу. Суть методу полягає в наступному. При взаємодії імунної сироватки зі специфічним антигеном відбувається з`єднання антигену з антитілом, утворюється комплекс антитіла з антигеном, який пов`язує комплемент. У разі невідповідності антигену і антитіла зв`язування комплементу не відбувається, т. Е. Комплемент залишається вільним. Процес зв`язування комплементу при позитивній реакції антитіла з антигеном залишається невидимим. Тому для визначення, зв`язався чи комплемент або залишився вільним, як індикатор в реакцію вводиться гемолітична система (гемолітична сироватка - гемолізини і еритроцити барана). Реакція зв`язування комплементу ставиться в дві фази: в першій фазі до досліджуваної сироватці (антитілу) додається антиген і комплемент, в другій - додається гемолітична система.
Якщо в першій фазі реакції досліджувана сироватка містить специфічні для антигена антитіла, то комплемент буде пов`язаний з комплексом антиген + антитіло, при додаванні гемолітичної системи гемоліз не відбудеться і реакція буде вважатися позитивною.
Якщо ж досліджувана сироватка не містить специфічних антитіл, т. Е. Антиген і антитіла не відповідають один одному, тоді комплемент в першій фазі реакції залишається вільним і при додаванні гемолітичної системи відбудеться гемоліз (розчинення) еритроцитів, т. Е. Реакція буде негативною (див . рис. 57).
Реакція Борде-Жангу (реакція зв`язування комплементу), що володіє високою чутливістю, придбала велике діагностичне значення. Це значення ще більше збільшилася, коли Жангу показав, що реакція може відбуватися не тільки з бактеріальними тілами, але і з їх екстрактами. Реакція Борде-Жангу застосовується при діагностиці сапу, гонореї та інших захворювань. А. Вассерман, виходячи з ідеї Ж. Борде, застосував реакцію зв`язування комплементу для серодиагностики, сифілісу. Ця реакція отримала практичне застосування в розпізнаванні сифілісу.
Реакція зв`язування комплементу застосовується з двоякою метою:
- Для виявлення в сироватці специфічних антитіл за допомогою відомого антигену. Наприклад, маючи антиген, приготований з культури гонокока, можна виявити гонококові антитіла в сироватці хворого. В цьому випадку необхідно користуватися антигеном, доза якого, що зв`язує комплемент, заздалегідь витітрована на значній кількості сироваток хворих.
- Для визначення виду антигену за допомогою сироватки, що містить антитіла до певного антигену. Наприклад, за допомогою відповідної імунної сироватки можна ідентифікувати паличку кашлюку. У цих випадках необхідно мати сильну імунну сироватку, титр якої відомий.
Інгредієнти (складові частини) реакції. Для реакції зв`язування комплемен-нта необхідні такі інгредієнти: 1) еритроцити барана, 2) гемолітична сироватка, 3) комплемент, 4) антиген і 5) випробувана сироватка.
1. Еритроцити отримують з дефібрін іровани крові барана. Для цього у барана беруть кров з яремної вени безпосередньо в банку зі скляними бусами. Струшують протягом 10 хвилин. Проціджують через стерильну марлю, центрифугують і сироватку відсмоктують. Три рази відмивають еритроцити від залишку сироватки фізіологічним розчином хлористого натрію центрифугуванням протягом 10-15 хвилин. Після третього центрифугування з осаду готують 3% суспензію еритроцитів для досвіду. При зберіганні в льодовику дефібринованої кров може вживатися протягом 6-8 днів.
Схема приготування розведень гемолітичної сироватки з основного розведення 1: 100
пробірка | Основні разведеніяв мл | Фізіологіческійраствор в мл | Полученноеразведеніе |
1-я | 0,1 | 0,9 | 1: 1 000 |
2-я | 0,1 | 1,1 | 1: 1 200 |
3-тя | 0,1 | 1,4 | 1: 1 500 |
4-я | 0,1 | 1,7 | 1: 1 800 |
5-я | 0,1 | 1,9 | 1: 2 000 |
6-я | 0,1 | 2,4 | 1: 2 500 |
7-я | 0,1 | 2,9 | 1: 3 000 |
8-я | 0,1 | 3,4 | 1: 3 500 |
- Гемолітична сироватка зазвичай виходить від кроликів, імунізованих еритроцитами барана. Гемолітичну сироватку випускають в сухому вигляді інститути бактерійних препаратів. На етикетці ампули вказано титр сироватки і термін придатності.
Таблиця 4
Схема титрування гемолітичної сироватки
Титром гемолітичної сироватки називається її граничне розведення, здатне в обсязі 0,5 мл розчинити 0,5 мл 3% суспензії еритроцитів у присутності 0,5 мл комплементу протягом години при температурі 37 °.
Титр гемолітичної сироватки визначається за наступною схемою: готують основне розведення виворотки 1: 100 (0,1 мл сироватки + 0,9 мл фізіологічного розчину), з якого готують подальші розведення (табл. 3).
В ряд пробірок послідовно відміряють по 0,5 мл отриманих розведень гемолітичної сироватки, починаючи з 1: 1000, додають в кожну пробірку по 0,5 мл комплементу, розведеного 1: 10, і по 0,5 мл 3% суспензії еритроцитів. Титрування гемолітичної сироватки проводиться за схемою (табл. 4).
Зі схеми видно, що дана сироватка ще в розведенні 1 1500 дає повний гемоліз (т. Е. Титр сироватки 1: 1500). Надалі для досвіду беруть в 3 рази менше розведення (потрійний титр). Так, наприклад, якщо титр гемолітичної сироватки 1: 1500, застосовується розведення 1: 500 (т. Е. 0,1 мл сироватки 49,9 мл фізіологічного розчину).
- Комплемент. Як комплементу в реакції служить сироватка морських свинок (їх комплемент володіє найбільшою активністю) або сухий комплемент, що випускається інститутами бактерійних препаратів.
Так як ступінь активності комплементу не у всіх морських свинок однакова, необхідно брати кров у кількох тварин і отримані сироватки змішувати.
Титром комплементу позначається перша мінімальна доза комплементу, яка розчиняє еритроцити. Якщо, наприклад, в наведеній схемі титрування повний гемоліз стався в пробірці, що містить 0,3 мл комплементу, і неповний гемоліз виявився в пробірці, що містить 0,25 мл комплементу, то титром комплементу треба вважати 0,3 мл в розведенні 1: 10. в якості робочої дози комплементу зазвичай береться титр його, збільшений на 20-25%, т. е. приблизно це відповідає тій кількості комплементу, яке міститься в передостанній пробірці з гемолізом.
Як при титруванні гемолітичної сироватки, так і при титруванні комплементу ставляться два контролю (див. Табл. 5).
Схема титрування комплементу без антигену
Таблиця 6
Схема титрування комплементу в присутності антигену
Крім того, рекомендується титрувати комплемент також в присутності антигену.
Титрування комплементу в присутності антигену необхідно в тих випадках, коли антиген пригнічує титр комплементу (антікомплементарние властивість антигену). Це властивість може залежати як від природи самого антигену, так і від способу його приготування.
- Антиген. В реакції зв`язування комплементу використовуються різні антигени. Антигенами є культури різноманітних мікробів або екстракти патологічно змінених або нормальних тканин. Як бактеріального антигену можуть вживатися як суспензії мікробів в фізіологічному розчині, так і екстракти з мікробів, приготовані різними способами (наприклад, антіформіновий гонококовий антиген, спиртовий туберкульозний і т. П.). Добрими антигенними властивостями володіє мікробна суспензія, попередньо вбита парами формаліну або оброблена алкоголем. Для реакції вихідну суспензію антигену розводять по оптичному стандарту, який містить. 1 млрд. Мікробних тіл в 1 мл, і беруть в обсязі 0,5 мл.
В якості антигену застосовують також мікробні лізати в дистильованої воді або фізіологічному розчині, отримані в шюттель-апараті (апарат для струшування) або шляхом обробки антиформін.
Для реакції слід вживати таку дозу антигену, яка викликає повну затримку гемолізу з сироватками, що містять відповідні гемолізіни, але яка сама по собі затримки гемолізу не дає. В силу того, що всі мікробні антигени адсорбують якусь кількість комплементу, перед титруванням їх перевіряють на антікомплементарние властивості, визначаючи растворяющую дозу комплементу, т. Е. Те найбільшу кількість антигену, яке не викликає затримки гемолізу. Визначення такої розчинюючої дози антигену виробляється за схемою (табл. 7).
З таблиці видно, що в даному прикладі растворяющая доза антигену становить 0,4 мл. Для досвіду беруть половину такої дози, т. Е. Орієнтовна доза буде рівна 0,2 мл.
- Випробувана сироватка. Сироватку хворого відокремлюють від згустку через 3-48 годин після взяття крові і інактивують в водяній бані при 56 ° протягом 30 хвилин.
Таблиця 7 Схема визначення розчинюючої дози антигену
пробірка | Антігенв мл | Фізіологіческійраствор в мл | Рабочаядоза комплементу в мл | Гемолітіческаясістема в мл | результат |
1 -Я | 0,1 | 0,9 | 0,5 | 1,0 | гемоліз |
2-га | 0,2 | 0,8 | 0,5 | 1,0 | 1Стояніе в термостаті при 37 ° напротязі години |
3-Я | 0,3 | 0,7 | 0,5 | 1,0 | |
4-я | 0,4 | 0,6 | 0,5 | 1,0 | » |
5-я | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 | ^ Затримка гемолізу |
Інактивовані сироватки можуть зберігатися в холодильнику протягом 5-6 днів. Для реакції сироватка хворого застосовується в розведенні 1: 5 (0,1 мл сироватки + 0,4 мл фізіологічного розчину).
Постановка досвіду реакції зв`язування комплементу (табл. 8).
Для постановки реакції зв`язування комплементу необхідні такі інгредієнти:
- фізіологічний розчин (0,85%);
- сироватка, що підлягає дослідженню, інактивована при 56 ° протягом 30 хвилин на водяній бані;
- антиген (суспензія бактерій або екстракт з них), що не викликає самостійно ні гемолізу, ні затримки його в дозі, встановленої титруванням;
- комплемент у робочій дозі, встановленої титруванням;
- гемолітична сироватка в дозі, що відповідає її потроєному титру;
- 3% суспензію баранячих еритроцитів.
Кожен з інгредієнтів, який застосовується для реакції, береться в кількості 0,5 мл. Якщо доза окремого компонента менше цього обсягу, то її доповнюють фізіологічним розчином до 0,5 мл.
Основний досвід зв`язування комплементу бажано ставити відразу з двома - трьома антигенами, приготованими різним способом (А1, А2, А3 в табл. 8).
Схема основного досвіду
Для контролю необхідно одночасно ставити реакцію точно в тих же умовах з нормальною сироваткою і сироваткою, свідомо дає позитивний результат. При постановці реакції спочатку змішують досліджувану сироватку, антиген і комплемент. Суміш витримують при 37 ° протягом години. Після закінчення зазначеного терміну в пробірку додають суміш гемолітичної сироватки і еритроцитів - гемолітична систему. Гемолітичну систему додають або безпосередньо після приготування суміші з рівних обсягів гемолітичної сироватки і еритроцитів, або після півгодинного витримування цієї суміші в термостаті. Суміш всіх інгредієнтів після енергійного струшування поміщають в термостат при 37 ° на 1 годину, а потім на 12 годин переносять в холодильник або залишають при кімнатній температурі.
У пробірках, в яких стався гемоліз, рідина стає прозорою, але пофарбованої (див. Рис. 58).
Мал. 58. Схема реакції зв`язування комплементу.
а - реакція положітельная- б - реакція негативна.
(++ + +) -повна Затримка гемоліза- рідина не пофарбована, значний осад ерітроцітов-
(+ + +) -Ясно Затримка гемоліза- рідина забарвлена, осад ерітроцітов-
(++) - Часткова затримка гемоліза- рідина забарвлена інтенсивності компактний осад ерітроцітов-
(+) -дуже Слабка затримка гемоліза- рідина забарвлена інтенсивно, осад небольшой-
(±) -сліди затримки гемолізу, при збовтуванні помітний незначний осадок-
(-) - Повний гемоліз (негативна реакція).
