Морфометрична характеристика альвеолярнихмакрофагів - патологія органів дихання у ліквідаторів аварії на чаес

К. Шарпен, А. Л. Черняєв, О. М. Гробова
6
Морфометрична характеристика альвеолярнихмакрофагів ліквідаторів наслідків аварії на Чорнобильській АЕС у віддалений період
Вивчення рідини бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ) ліквідаторів наслідків аварії на Чорнобильській АЕС (ЧАЕС), які страждають на хронічні обструктивні захворювання легень, довело присутність в цитоплазмі альвеолярнихмакрофагів численних фаголізосом. Спектрометричне вивчення вмісту фагосом виявило присутність елементів групи актинидов (Chuchalin A. et al., 1995). Очевидно, що присутність подібних включень надає индуцирующее вплив на різні механізми функціонування альвеолярнихмакрофагів (вироблення цитокінів), відповідальних за пошкодження тканин бронхів і альвеол і активацію прозапальних клітинних механізмів (Cryestal R. G., 1991). У попередніх дослідженнях виявлено, що альвеолярнімакрофаги ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС активно секретувати інтерлейкін-8 - найпотужніший хематтрактант нейтрофілів (Chuchalin A. et al., 1995 б). Активація альвеолярнихмакрофагів може бути результатом зміни як кількості, так і якості вмісту цитоплазми макрофагів. У зв`язку з цим представляється клінічно доцільним видаляти подібні макрофаги з легких за допомогою відомих неінвазивних методів, до яких відноситься, зокрема, БАЛ.
Метою цього дослідження було вивчення морфологічних і денситометрических характеристик цитоплазматических включень альвеолярнихмакрофагів БАС ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС, які страждають на хронічний обструктивний бронхіт.
У дослідження були включені хворі з хронічним обструктивним бронхітом (16 чоловіків, віком від 30 до 46 років). Всіх хворих турбував кашель зі слизової мокротою в більшість днів місяця на протязі як мінімум 3 місяців на рік упродовж останніх 5 років. Рентгенологічно у всіх пацієнтів були виявлені ознаки емфіземи і пневмосклерозу. Критерії для включення пацієнтів у дослідження були: а) відсутність відомостей про сімейної схильності до алергічних заболеваніям- б) відсутність інших видів легеневої патології (бронхоектази, туберкульоз легенів, рак легені) - в) загострення захворювання, що виявляється посиленням задишки, що супроводжується зміною якості (слизова на гнійну) і кількості мокротиння в останні 10 днів-у) тривалий анамнез тютюнопаління (більше ніж 13 років) і активне куріння в даний час (10-20 сигарет з фільтром в день) - г) відсутність професійних інгаляційних факторів, що сприяють розвитку патології органів дихання. Вісім з обстежених пацієнтів приймали участь в ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС і працювали на будмайданчику станції в 1986- 1987 роках. Всі ліквідатори проживали до і після аварії в районах Росії, які не зазнали радіаційного ураження після аварії на ЧАЕС. Для всіх ліквідаторів було характерно наступне: а) відсутність суб`єктивних і об`єктивних ознак захворювань легенів до роботи на будмайданчику ЧАЕС- б) робота на ЧАЕС в умовах запиленості (погрузка на машини частин зруйнованих стін енергоблоку, грунту) - в) відсутність засобів захисту органів дихання ( респіратори, захисні маски) під час робіт. При надходженні пацієнтів до клініки НДІ пульмонології МОЗ РФ все вони були обстежені за допомогою загальноприйнятих клініко-лабораторних методів дослідження: аналіз історії хвороби, фізичне обстеження, функціональне дослідження органів дихання, рентгенографія, ЕКГ, клінічний аналіз крові. У всіх пацієнтів були виявлені запальне зрушення в крові. Функціональні легеневі тести (спірометрія і бодіплетізмометрія - 6200 Autobox, SensorMedics Зігрій.), Виконані на цьому етапі, демонстрували зниження показника FEV, нижче 80% від должного- кращі значення FEV / FVC після інгаляції бронхолитика були нижче 70% від належного. Залежно від виявлених змін як пацієнтам основної групи (ліквідаторам), так і пацієнтам групи порівняння (неліквідаторам) проводилася терапія теофіліном, бета- агоністами і антибіотиками. Після закінчення 7-14-денний терапії пацієнти були знову обстежені за допомогою методів, виконаних під час вступу до клініки (табл. 1).
Для визначення ступеня вираженості запальних змін в легенях на цьому етапі дослідження була проведена фибробронхоскопия і БАЛ, виконані за загальновідомими правилами (Joseph N. et al., 1980). Таким чином, пацієнтам основної групи (ліквідаторам) БАЛ проводили 8-9 років після роботи на ЧАЕС і експозиції радіаційних аерозолів. Всім пацієнтам фібробронхоскопіческое дослідження здійснювали під місцевою анестезією 2% розчином лідокаїну гнучким фіброскоп BF-B3 (Olympus Corp. of America, New Hyde Park, NY). Після візуальної оцінки стану бронхів дрібно, по 50 мл, вводили апірогенний підігрітий до 37 ° С ізотонічний розчин NaCl, приготований для внутрішньовенного введення. Загальна кількість введеної рідини становило 250 мл. Як матеріал для дослідження використовували 2-5 порції. Для трансмісійної електронної мікроскопії клітини БАЛ фіксували в 2,5% розчині глютарового альдегіду на 0,1 М фосфатному буфері (pH 7,4). Постфіксація проводили 1% розчином OsO4 на фізіологічному фосфатному буфері (pH 7,2) протягом 60 хвилин-контрастування - 2% водним розчином уранілацетатом протягом 60 хвилин. Потім суспензію клітин БАЛ збезводнювали в ацетон висхідній концентрації і заливали в епоксидні смоли. 10 забарвлених уранілацетатом ультратонких зрізів аналізували на трансмісивному електронному мікроскопі JEOL 1200 (Japan). Для досягнення достатньої кількості (3000-6000) аналізованих зразків цитоплазматических включень робили не менше 20 мікрофотографій макрофагів БАС на одне спостереження. Морфометричне і денситометрическое вивчення включень макрофагів здійснювали, як раніше описано, за допомогою комп`ютеризованої програми - SAMBA 2005, Alcatel TITN, Grenoble, France (Brugal G., 1984). Аналіз зображення цитоплазми альвеолярнихмакрофагів проводили з чорно-білих фотографій за допомогою відеокамери (Sony Зігрій.) По 10 параметрам: показник середньої поверхні макрофагів (в пікселях), середнє число фагосом на 1 макрофаг, показник відношення поверхні фагосом до поверхні клітини, середній розмір фагосом (в пікселях), фактор перетину фагосом, середня оптична щільність фагосом зі світлим і темним вмістом (ранг вимірювання 0-255). Загальний принцип морфометричної і денситометричної оцінки був розроблений і представлений раніше (Charpin С. et. Al., 1988,1992,1995- Devictor В. et al., 1993).
БАС ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС містила велику кількість макрофагів. Альвеолярнімакрофаги були збільшені в розмірах, цитоплазматическая поверхню їх мала численні цитоплазматичні ворсинки (рис. 1, а). Цитоплазма клітин містила величезну кількість включень, різних за розміром, формою і оптичної щільності вмісту. Більшість цитоплазматических включень мали морфологічні ознаки або фаголізосом, що містять в більшості спостережень темний матеріал (дуже схожий на що виявляються при антракосилікоз), або голкоподібні тільця. Форма більшості фаголізосом була круглої, овальної або ангулярного (рис. 1, а-2 а).

Електроннограмма альвеолярного макрофага (а, б), комп`ютерна морфометрія сторонніх часток в фаголізосомах цитоплазми (в), гістограма розподілу обсягів сторонніх структур в цитоплазмі (г).
а, б, в х 5000

Мал. 1, а.

Мал. 1, ст.

Деякі включення займали близько 1/3 клітинної площі. Деякі фагосоми містили крісталло- і міеліноподобние тільця. Більшість макрофагів мали ознаки клітинної активації, менша частина клітин - ознаки дистрофії. Навколо клітин з порушеною цілісністю цитоплазматичної мембрани або ознаками лізису цитоплазми спостерігали вільно лежать темні включення.
В БАС пацієнтів-неліквідаторов кількість макрофагів було значно менше. Я не можу знайти включення, подібні описаним у ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС. Морфологічні характеристики макрофагів відповідали описаним для клітин в умовах норми (Normand С. et al., 1987).
Результати аналізу зображення цитоплазматических включень альвеолярнихмакрофагів ліквідаторів у вигляді середнього значення на кожне спостереження і показника стандартного відхилення представлені в табл. 1, рис. 1 б-г-2 б-р.

Аналогічний малюнок іншого альвеолярного макрофага, а, б, в х 5000.

Мал. 2, б.

Мал. 2, ст.

Мал. 2, м

Таблиця 1 Морфометрические і денситометричної показники альвеолярнихмакрофагів БАС ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС (М ± ш)

Альвеолярнімакрофаги рідини БАЛ ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС містять значну кількість включень, які були проаналізовані за допомогою комп`ютеризованої програми морфометрії і денситометрії.
Отримані результати не можна поки віднести до специфічних ознаками радіонуклідного пневмокониоза. Однак виявлені кількісні показники стану цитоплазми альвеолярнихмакрофагів дозволять зіставити їх з динамічними клінічними і функціональними змінами і чітко визначити діагностичні ознаки ураження легень внаслідок радіаційного ураження. Аналіз зображення дозволив об`єктивним способом оцінити величезну кількість включень і в зв`язку з високим рівнем стандартизації дослідження дуже ефективний в клінічних цілях. Цей метод може бути використаний, зокрема, при оцінці ефективності лікувальних заходів, спрямованих на виведення з бронхоальвеолярного простору частинок, відповідальних за пошкодження тканини легенів. Це дослідження було присвячено морфометричної і денситометричної оцінці альвеолярнихмакрофагів, отриманих в ході первинного діагностичного БАЛ. Подібний об`єктивний підхід в подальшому дозволить оцінити ефективність повторних лікувальних БАЛ в очищенні легенів від активованих макрофагів, що містять чужорідний матеріал.
Включення, виявлені в альвеолярних макрофагах ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС, можуть бути цитологічним ознакою пневмокониоза ушкоджуючий ефектом на тканину легенів незалежно від того, містяться в них радіонукліди чи ні. У обстежених нами пацієнтів офіційна паспортизовані доза опромінення коливалася від 16 до 23 рентген. В даний час не представляється можливим визначити справжню дозу, отриману кожним ліквідатором, і, зокрема, дуже складно розрахувати дозу, привнесену інгаляцій радіоактивних аерозолів. Проте, проведене нами раніше якісне спектрометричні дослідження цитоплазми альвеолярнихмакрофагів виявило присутність ряду хімічних елементів, що входять до складу палива АЕС чорнобильського типу. В даний час наша дослідницька група проводить вивчення хімічного складу фагосом на ультратонких зрізах, що дозволить визначити кореляційні відносини між морфометричними, денситометричними параметрами і хімічним складом фагосом і виявити специфічні цитологічні ознаки радіаційного чорнобильського пневмокониоза.
Присутність елементів групи актинидов може бути причиною нерадіаційного пошкодження клітин і змін в легенях. Останні можуть бути обумовлені наявністю Нерадіоактивні багатокомпонентної пилу в цитоплазмі альвеолярнихмакрофагів. Величезна кількість включень призводить до посилення функціональної активності цих клітин, що виявляється збільшеною виробленням IL-8, потужного і специфічного хематтрактанта нейтрофілів, який в свою чергу також активізує функціональну активність нейтрофілів (Schroder J.M., Christopher, 1991). Наші дослідження виявили значне посилення активності мієлопероксидази нейтрофілів БАЛ у обстеженої групи ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС (Grobova О. М. et al., 1994). Всі ці дані можуть бути доказом афферентной активації клітин БАС і активного запального процесу (альвеолита і бронхіоліту) в легенях ліквідаторів. Крім того, присутність елементів групи актинидов може надавати певні радіаційно обумовлені ушкодження геному епітеліальних клітин. В обстеженій групі хворих проводяться дослідження, зокрема, мутацій антионкогенов (р53) і стану регуляції ВС12 гена апоптозу. Подібні дослідження, проведені на матеріалі біоптатів бронхів, дозволять дати відповідь про можливий ризик розвитку раку легенів і будуть додатковим аргументом для проведення програмного об`ємного лаважірованія легких даної групи пацієнтів.

ЛІТЕРАТУРА
Brugal G. Image analysis ofmicroscopic preparation // Methods and Achievement in Experimental Pathology / Ed. G. Jasmin, L. Proschek. - Basel: Karger, 1984. - P. 1-33.
Charpin C., Andrac L., Vacheret H. et al. Multiparametric evaluation (SAMBA) of growth fraction (monoclonal Ki67) in breast caroinoma tissues // Cancer Res. - 1988. - Vol. 48. - P. 4365-4374.
Charpin C., Bonnier P., PianaL. et al. Correlation of nucleolar morphometry assessed by automatic image analysis in breast cancer with aneuploidy, Ki67 immunostaining, histopathologic grade and lymph node involvment // Pathol. Res. Pract. - 1992. - Vol. 188. - P 1009-1017.
Charpin C., Devictor B., Amabile L. et al. P53 Quantitative immunocytochemicalanalysis in breast carcinomas // Hum. Pathol. - 1995. - Vol. 26. - P. 159-166.
ChuchalinA. G., Grobova 0., CherniaevA. et al. The delayed respiratory consequences of inhaled radionuclides in population exposed to nuclear catastrophe // STEM Cells. - 1995. - Vol. 113. - P. 2376-²³⁸2.
Chuchalin A. G., Grobova 0., Cherniaev A. et at. Long term effects of inhaled radionuclides on BAL // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1995. - Vol. 15, # 4. - P. A259.
Chuchalin A. G., Grobova 0., Chernikov V. et ai. Investigations of BAL fluid of the Chernobyl wreck&rsquo-s consequences on liquidators // Eur. Respir. J. - 1995. - Vol. 7, Suppl. 18. - P. 360s.
CryestalR. G. Alveolar macrophages // The Lung: Scientific Foundation / Ed. R. G. Cryestalet al. - New York: Raven Press, 1991. - P. 527-538.
Devictor B., Bonnier P., PianaL. et al. c-myc Protein and Ki67antigen immunodetection in patients with uterine cervix neoplasia: Correlations of microcytophotometric analysis and histological data // Gynecol. Oncol. - 1993. - Vol. 49. - P. 284-290.
Joseph N., Tonne A. B., Capron A. et al. Enzyme release and superoxide anion production by human alveolar macrophages with immunoglobulin // J. Clin. Exp. Immunol. - 1980. - Vol. 40. - P. 416-420.
Normand C., Cornu L., Wallaert B. et al. Etude ultrastructurale des cellules recoltees par lavage broncho-alveolaire dans la silicose et la pneumoconiose du mineur de charbon: correlation avec les caracteristiques cliniques de la maladies // Coll. INSERM. - 1987. - Vol. 155. - P. 99-108.
Schroder J. M., Christopher E. Secretion of novel and homolous neutrophil-activating peptides by LPS-stimulated human endothelial cells // Science. - 1991. - Vol. 142. - P. 244-251.