Стахиботріотоксикозу - токсінобразующіе мікроскопічні гриби
Stachybotrys З о г d а - стахіботріс
Стахиботріотоксикозу (Stachybotryotoxicosis)
Stachybotrys alternans В про п о г d - стахіботріс чергується
Викликає широко поширене захворювання коней, великої рогатої худоби та інших видів тварин. Вперше етіологічнезначення гриба в захворюванні коней було встановлено в 1938 р колективом вчених Інституту мікробіології Академії наук УРСР під керівництвом В. Г. Дроботько (1946 1949). Захворювання отримало назву стахіботріотоксикозу.
Ще до з`ясування етіологічного значення Stachybotrys alternaqs Пономаренко (цит. За Дроботько та ін., 1949) вивчені клінічні та патологоанатомічні ознаки захворювання і встановлена приналежність його до окремої нозологічної одиниці, не відомої до того часу в науці.
Захворювання стахиботріотоксикозу зазначалося також на Україні в 1931 р 1937-1940 рр. спостерігалося в районах Поволжя
Східному Сибіру, центральної смуги СРСР, Молдавії, Румунії, Польщі, Словаччини, Угорщини (Саркісов, 1954).
Стахиботріотоксикозу виникає аліментарним шляхом при вживанні кормів, уражених St. alternans, характеризується важкими запальними і некротичними процесами слизових травного тракту, геморагічним діатезом, розвитком лейкопенії та агранулоцитозу. Захворювання протікає в типовій і атиповій формах. При типовому перебігу розрізняють три стадії стахіботріотоксикозу, наступаючі послідовно одна за одною.
Перша стадія настає зазвичай через один - три дні поїдання корму, ураженого St. alternans- характеризується гіперемією і виразкою слизових оболонок ротової порожнини, інфільтрацією підщелепних лімфатичних залоз, запалення слизової носа і кон`юнктивітом, більш-менш вираженим припуханням губ, з подальшим лущенням некротизованих шарів епідермісу і появою тріщин на губах біля кутів рота. Іноді спостерігається підвищення температури. Ці поверхневі ураження зазвичай гояться на п`яті - восьму добу, залишаючи на місцях некрозу рубці. Спочатку відзначається лейкоцитоз з нейтрофілією. Залежно від токсичності гриба перша стадія може протікати протягом 10-15 днів (рідше - довше). При заміні отруйного корму на доброякісний захворювання проходить швидко.
Друга стадія настає після більш тривалого згодовування ураженого грибом корму, також в залежності від кількості останнього і ступеня його токсічності- триває від 8 до 40 днів (зазвичай 15-20). У цій стадії спостерігаються типові для стахіботріотоксикозу зміни: агранулоцитоз, лімфоцітоз- первинний нейтральний лейкоцитоз змінюється стійкою лейкопеніей- тромбопения, зниження ретракції кров`яного згустку. Зміст тромбоцитів знижується до 28-18 на 3000 еритроцитів, число лейкоцитів досягає 4-1 тис. В 1 мм 3 крові. Настають різкі зміни деяких біохімічних показників крові - зменшення вмісту в крові неорганічного фосфору, ацітоз. Станом хворої тварини цю стадію багато авторів вважають «прихованим» періодом, хоча вона характеризується прогресуючими і важкими змінами організму: геморагічним діатезом, порушенням роботи шлунково-кишкового тракту, вторинними некрозами слизових ротової порожнини, підвищенням температури і ін. При заміні корми на доброякісний і лікуванні можливо одужання.
Третя стадія характеризується різким підйомом температури до 39-40 ° С і вище, ослабленням серцевої діяльності, прогресуючої загальною слабкістю, пригніченням і різкими змінами в крові, що проявляються в подальшому наростанні тромбопенії до 8 тис. На 2000-3000 еритроцитів, зниження або повне зникнення ретракции крові (часто за кілька годин до загибелі кров втрачає здатність згортатися) і сильно вираженої лейкопенії (кількість лейкоцитів зменшується до 200 в 1 мм 3 крові) - прогресують некротичні процеси, в ротовій порожнині виникають великі ареактівное вогнища. Перебіг захворювання ускладнюється вторинною бактеріальною інфекцією, викликаної вискозной паличкою, діплострептококком або гемолитическим стрептококком- зазвичай закінчується загибеллю тварини, в рідкісних випадках одужання кров повертається до норми тільки через 20-30 діб.
Атипова, або шокова, форма стахіботріотоксикозу відзначається при згодовуванні великої кількості остротоксіческого корми і розвивається дуже швидко - через 5-10 год. Характеризується різким підвищенням температури, розладом серцево-судинної системи, явищами наростаючого набряку легенів, симптомами з боку центральної нервової системи, множинними крововиливами слизової оболонки ротової і носової порожнин. Виникає тромболейкоцітоз, згортання крові іноді підвищується. Вихід звичайно летальний.
У 1937-1938 рр. Линник вперше встановив захворювання стахиботріотоксикозу людей, які мають контакт з ураженими St. alternans кормами. Симптоми: подразнення слизових оболонок очей, носа, рота, зіву, бронхів (іноді з кровотечами), а також шкіри, особливо в області потоотделітельних залоз. Уражені ділянки слизової або шкіри остроболезненни, з сильним свербінням і палінням. Карпова-Бенуа (1954) і Самсонова (1960) виявили випадки захворювання людей при контакті з целюлозовмістні сировиною, ураженим St. alternans.
Самсонова встановили захворювання людей при попаданні конідій і фрагментів міцелію гриба в організм респіраторним шляхом. У дослідах на лабораторних тваринах відзначені патологоанатомічні зміни окремих органів при пневмостахіботріотоксікозе.
Найбільш характерними патолого змінами при стахиботриотоксикозе є наступні: більш-менш гостро виражений геморагічний діатез, виявляється у вигляді множинних точкових, смугастих, плямистих, дифузних крововиливів, геморагічні запалення лімфатичних вузлів голови і шиї, некротичні виразки слизової рота, глотки, мигдаликів, ясен, рідше стравоходу і тонких кишок, частіше шлунка і особливо товстих кішок- в печінці іноді відзначаються некротичні вогнища і крововиливи, слабо виражені явища білково-жировий дістрофіі- нерідко розрідження кісткового мозку з вогнищевими крововиливами, набряки в легенях. Патологоанатомічна картина стахіботріотоксикозу коней вивчалася Вертинським (1941), Мовний (1944), Пономаренко (цит. За Дроботько та ін., 1949), Мельниченко (1949) та ін.
Аскалона (1949) досліджував токсичність St. alternans для інших видів тварин: великої та дрібної рогатої худоби, дрібних домашніх і лабораторних тварин, птиці. Згідно з даними автора, при експериментальному стахиботриотоксикозе у великої рогатої худоби викликається захворювання в менш сильному ступені. Більш висока чутливість виявилася у собак і кішок: одноразовий прийом культури гриба з їжею викликав загибель у перших через 3 5 днів, у других - через 1-2 дні. Чутливі до токсину морські свинки, білі щури, миші, а також кури і голуби. Захворювання у тварин протікає при характерних клінічних і патологоанатомічних ознак.
Згодом поруч авторів вивчався стахиботріотоксикозу великої рогатої худоби (Фортушний і ін., 1959 Курманов, 1961- Мєшков, 1961- Спесивцева, 1961- Пономаренко, 1962- Ізмайлов, 1964, і ін.). Захворювання в гострій формі триває від 3 до 10 днів і закінчується зазвичай летальним результатом. У корів, як правило, відразу знижуються надої молока і надалі розвиваються типові клінічні ознаки, в основному такі ж, як у хворих стахиботріотоксикозу коней. Однак у великої рогатої худоби частіше й інтенсивніше утворюються набряки і водянки, відсутні або рідко виникають некрози губ і ротової порожнини, мигдаликів, але відзначаються великі некротичні вогнища на слизовій преджелудка, некрози печінки, бактеріальна емболія, тканинної мікробіоз і ін. (Пономаренко, 1962) .
Перебіг захворювання і прояв його форм в значній мірі залежать від дози або токсичності корму. Остання визначається як ступенем його поразки, так і, особливо, токсичністю гриба. Це було показано вперше при вивченні етіології стахіботріотоксикозу. Досліди проводилися на шести конях, які отримували культуру гриба відповідно з 30, 20, 10, 5, 3 і 1 чашок Петрі. Перша кінь загинула на 5-е, друга - на 9-е, третя - на 32-у добу, решта дві захворіли на третій місяць. У перших двох при розтині відзначена різко виражена жирова інфільтрація клітин печінки, у третій, що одержувала гриб з 10 чашок Петрі, проявилися найбільш типові патологоанатомічні ознаки стахіботріотоксикозу, у четвертій спостерігалася різко виражена лейкопенія, а у коней, які отримували гриб з трьох і однієї чашок Петрі, тільки до кінця досвіду (через 3 місяці) відзначено запалення слизової губ і ротової порожнини (Дроботько та ін., 1949). Багато авторів відзначають різну токсичність штамів St. alternans, виділених з ураженої корму (остротоксіческіе, слаботоксіческіе і атоксіческіе). Підоплічко (1949) показав, що штами St. alternans, виділені з кормів, які викликали б стахиботріотоксикозу у коней в 1937-1938 рр. на Україні і в Криму, мали в різному ступені токсичними властивостями-в той же час штами, виділені з кормів Башкирії, були атоксічни. Саркісов (1954) вказує, що із зразків кормів, які викликали б захворювання коней, зазвичай виділялися токсичні штами гриба, а в місцях, де стахиботріотоксикозу не спостерігається, як правило, виділялися атоксічние штами. 
Мал. 32. Зниження кількості тромбоцитів в крові різних коней, хворих стахиботріотоксикозу (з летальним результатом).
За даними автора, токсин в малих дозах мав уповільненим і резорбтивного дією, але перебіг захворювання можна було значно прискорити одноразовим введенням дози, здатної викликати незворотні порушення. Наприклад, при поїданні 20-30 г соломи, зараженої остротоксичні культурою St. alternans, у тварин протягом 10-14 діб виникає типова форма захворювання, а одноразове використання цієї кількості корму викликає гостру форму захворювання з характерними для типового стахіботріотоксикозу ознаками (рис. 32, 33).
Мал. 33. Зниження резервної лужності крові різних коней, хворих стахиботріотоксикозу (з летальним результатом).
За даними Бакай (1956), з 23 досліджених штамів St. alternans, виділених з токсичних кормів, тільки чотири були нетоксичними. Шулюмова і співробітники (1956) також відзначали, що в умовах півдня України токсичність штамів мінлива: різні форма прояву, динаміка розвитку і тривалість ензоотіі стахіботріотоксикозу. При високому ступені ураження корму токсичної расою St. alternans ензоотія починається швидко і проявляється у важкій формі-при незначному ураженні корми або низьку токсичність раси St. alternans кількість хворих тварин збільшується поступово, і захворювання протікає в слабкій формі. Автори вважають, що встановлені стадії протягом стахіботріотоксикозу можуть змінюватися в залежності від ступеня ураженості корми і токсичності гриба. Очевидно також, що в окремих випадках, як і при інших мікотоксикозах, хронічні форми стахіботріотоксикозу, обумовлені слаботоксіческімі штамами St. alternans, проходять непоміченими або неправильно діагностуються.
Американські вчені (Forgacs і ін., 1958), які вивчали токсичні для тварин властивості St. atra (St. alternans), отримали дані, які узгоджуються з даними, встановленими радянськими дослідниками.
Різна токсичність штамів спостерігається при культивування
вання. З 40 штамів St. alternans культуральна рідина 26 штамів викликала шкірну реакцію у кроликів, 15 штамів були Слаботоксичні (Forgacs, 1962). За даними Юськіва (1968а, 19686), який вивчав токсичні властивості 21 штаму St. alternans, виділеного з ґрунту і уражених кормів, позитивна проба на шкірі виявлена у п`яти штамів, позитивна реакція з резорціном- у 13, і всі виявилися токсичними в аліментарних дослідах. На 5-8-й день миші загинули від корму, зараженого 16 штамами, на 10-14-й день - від корму, зараженого іншими шістьма штамами.
Токсин St. alternans розчиняється в ряді органічних розчинників. Ефірні екстракти з культури гриба або уражених кормів виявляють некротичні дію на шкіру тварин і викликають при відповідних дозах експериментальний стахиботріотоксикозу у коней та інших тварин. На підставі шкірної реакції кроликів на дію ефірних екстрактів з гриба або з уражених їм кормів, вперше застосованої при вивченні етіології захворювання, створений метод «шкірної проби» для визначення токсичності кормів і грибів, який зараз широко використовується радянськими і зарубіжними фахівцями.
Як уже згадувалося, St. alternans зустрічається в грунті і целлюлозосодержащих субстратах. Гриб значно поширений в природі в різних географічних зонах, в грунті і на рослинних рештках, органах рослин, а також як шкідник целюлозної промисловості, виробів і книжкових фондів (Bisby, 1945- Підоплічко, 1949, 1954- Білай, Підоплічко, 1968, і ін .).
Види роду Stachybotrys, як і багато целлюлозоразрушающіх гриби, мабуть, грають роль в збагаченні грунту легкоусваїваємимі органічними речовинами, сприяючи розвитку інших мікроорганізмів. Можливо, St. alternans має деякий фітопатологічне значення при ураженні волокна розкрилися коробочок бавовнику, стебел цукрової тростини і фруктових дерев. Вивчення токсичних властивостей і географічного походження рас St. alternans є досить важливим для розуміння процесів токсінобразованія і їх значення у виникненні захворювань сільськогосподарських тварин і людини.
Фармакологічні властивості спиртових розчинів токсинів St. alternans з ефірних екстрактів ураженої корму або культури гриба на Суслова агарі вивчали Срібна (1949), Прокопович (1949) і ін. Дія токсину на ізольоване серце жаби викликало порівняно швидкий систолічний підйом амплітуди скорочень зі зменшенням діастолічного розслаблення. При більш високих концентраціях токсину зупинка діяльності серця наступала також в сістоле- приблизно в чотири рази менша концентрація токсину в порівнянні з концентрацією, що діє на ізольоване серце жаби, викликала після короткочасного розширення стійке звуження судин ізольованого вуха кролика (по Кравкову - Писемскому) (рис. 34). За даними Прокоповича, який вивчав фармакологічні властивості більш очищеного токсину St. alternans, високі концентрації викликають швидке скорочення діастоли, аритмію і зупинку ізольованого серця жаби в систоле, більш низькі - збільшення систоли і діастоли, а також уповільнення ритму сокращеніяПрі патологоанатомічному дослідженні загиблих мишей, яким вводився токсин, виявлена систолічна зупинка шлуночків серця.
Мал. 35. Зниження максимального і мінімального артеріального тиску при експериментальному стахиботриотоксикозе великої рогатої худоби.
Мал. 34. Вплив стахіботріотоксіна на судини ізольованого вуха кролика (по Кравкову- Писемскому):
1 - розширення на 13%, 2 - норма 100%, 3 - звуження на 33%.
Дуже високі концентрації токсину не викликали гемолізу відмитих еритроцитів крові кролика, в той час як проміжні концентрації викликали їх повний гемоліз- додавання холестерину не знімало гемолитического дії токсину. Встановлено, що тільки водонерозчинного частина токсину (осідає водою з спиртового розчину) викликає дігісталікоподобное дію на ізольоване серце жаби, гемоліз і токсично діє на організм.
При стахиботриотоксикозе у коней і великої рогатої худоби спостерігається зниження кров`яного тиску, що виникає в результаті тривалого вживання тваринами токсичного корму. Вважають, що в механізмі зниження кров`яного тиску беруть участь периферичні кровоносні судини, які реагують на токсин різким розширенням в результаті збудливої дії стахіботріотоксіна на парасимпатичну нервову систему. З іншого боку, прискорення седиментації еритроцитів і лейкопенія, які спостерігаються при стахиботриотоксикозе, можуть виникати через дії токсину на симпатичну нервову систему (рис. 35) (Ярослав, 1952- Саркісов, 1954- Борисевич, 1962, і ін.).
Антонець (1962) вивчав зміна електрокардіограми у клінічно хворих стахиботріотоксикозу великої рогатої худоби і
експериментальних тварин. Перші зміни пов`язані з порушенням ритму, зміною зубців і інтервалів. Вони аналогічні змінам, що викликається ваготропное серцевими отрутами типу наперстянки. Виникає різна ступінь порушення провідності - від незначного пригнічення до брадикардії, - блокада і мерехтіння передсердь. Надалі відзначаються ознаки важких морфологічних змін міокарда- загальне зниження вольтажу, подовження і деформація початкової і кінцевої частин шлуночковогокомплексу, різке збільшення систолічного показника, екстрасистолія, електричної альтерації і фібриляція передсердь.
Рис.36. Підвищення вмісту цукру в крові при експериментальному стахиботриотоксикозе великої рогатої худоби.
У тварин, хворих стахиботріотоксикозу, знижуються відновна лужність крові і кількість неорганічного фосфору, сповільнюється або відсутній ретракция кров`яного згустку (в зв`язку зі зменшенням вмісту тромбоцитів) (Саркісов, 1954).
У сечі хворих корів виявляються білок, жовті пігменти, в осаді - велика кількість лейкоцитів і клітин ниркового епітелію. Зазначені зміни в складі фракцій білків крові: зменшення кількості альбумінів, збільшення вмісту а1 = а2 = (в1-глобулінів, поява і збільшення вмісту фракції Уз-глобулінів. Значно змінюється електрофоретична рухливість окремих фракцій білків крові, що проявляється раніше клінічних ознак захворювання (Ізмайлов, 1962 1964).
Різка гіперглікемія відзначена при експериментальному стахиботриотоксикозе великої рогатої худоби, що свідчить про гальмування метаболізму глюкози в печінці і тканинах (рис. 36) (Борисевич, 1962).
Токсини St. alternans є характерними метаболітами гриба. Як при ураженні природних субстратів, так і при культивуванні наявність токсину відзначається в Конідій, стерігмах, фрагментах міцелію і культивованої середовищі. Початкові дослідження токсінобразованія проведені при культивуванні St. alternans на соломі або зерні вівса, Суслова агарі. Згодом ряд авторів вивчав вплив умов культивування на ріст і токсінобразованіе гриба. Робота Перльман (Parlmann, 1948) є однією з перших по вивченню впливу окремих компонентів вуглецевого, азотного і мінерального живлення на ріст Memnoniella echinata і St. alternans (St. atra), хоча вона і не пов`язана з дослідженням токсінобразованія. З дослідів випливає, що придатними джерелами вуглецю * були крохмаль (3,4), декстрин (2,8), ксилоза (2,9), фруктоза (2,2), глюкоза (2,0), лактоза (2,4 ), мальтоза, сахароза, целлобиоза (по 2,1), арабиноза (2,1), винна кислота (2,0), Еритреї (2,1), галактоза (2,1), маноза, маніт (1,8 ), рафіноза (2,0), гліцерин (1,7), дульцит (1,3), в-метил-глюкозид (1,3), салицин (1,0), трегалоза (0,9), сорбіт ( 1,0).
Менш інтенсивне зростання міцелію відзначений при зростанні гриба на середовищах з солями натрію, мурашиної, оцтової, пропіонової, щавлевої, лимонної кислот, слабке зростання - при використанні етанолу, інозиту, сорбози, інуліну. Був відсутній ріст гриба на середовищах з метаном, пропаном, ізопропаном, н-бутанолом, етилацетат, амілацетат. При використанні полі- і дисахаридів спостерігалася висока ступінь їх гідролізу: в культурах п`ятиденного зростання лактоза, сахароза, мальтоза, салицин Гідролізований на 100%, рафіноза, целлобіозана 70-80, крохмаль - на 40, а а-метілглюкозід, трегалоза - відповідно на 15 і 25%. Перльман вважає, що асиміляція вуглеводів відбувається переважно шляхом їх повного окислення до вуглекислоти і води. З досліджених джерел азоту хороший зростання гриба відзначений при використанні нітратного азоту (2 мг / мл), амонію фосфорнокислого (2,4 мг / мл), сечовини (2,5 мг / мл), гліцину (2,3 мг / мл), пролина (2,3 мг / мл), гістидину (2,5 мг / мл). Менш інтенсивно використовувалися тимін і креатин. Чи не використовувалися в якості джерел азоту KCN, нікотинова кислота, рибофлавін, індол, індолуксусной кислота, стрептоміцин.
Зростання міцелію стимулювався при додаванні в середу заліза, марганцю, цинку і, особливо, міді, нікелю, кобальту, алюмінію.
Вивченню фізіології St. alternans в зв`язку з токсінобразованіем присвячені роботи Саркісова і співробітників (1954), Трифонової (1956), Юськіва (1968). Встановлено, що з природних целлюлозосодержащих субстратів токсичні раси St. alternans ростуть на соломі різних злаків, стеблах джуту, коноплі, льону, коробочках бавовнику. Придатний для зростання і токсінобразованія Суслова агар, середовища Сабуро, Чапека та ін. Відмічено зростання гриба на стерильних тканинах органів тварин, ніж, ймовірно, можна пояснити виявлення гіф у хворих стахиботріотоксикозу тварин на некротизованих від дії токсину ділянках тканин (Мельниченко, 1949).
За даними Трифонової (1956), на зростання St. alternans і токсінобразованіе позитивно впливають збільшення концентрації глюкози в середовищі, додавання вітамінів - В1, С і особливо нікотинової кислоти (0,25 мкг / мл). Максимум токсінобразованія при поверхневому культивуванні гриба відзначений на 7-15-й день і пов`язаний з настанням рясного спорообразованія. При глибинному культивуванні максимум токсінобразованія настає на 2-5-й день і
залежить від аерації та інших умов. Юськів (1968) провів порівняльне вивчення придатності різних джерел вуглецевого і азотного живлення на ріст і токсінобразованіе у остротоксіческого і атоксіческого штамів St. alternans. Як джерела вуглецю автор досліджував різні вуглеводи і їх похідні, спирти аліфатичного ряду, органічні кислоти Трікарбонових циклу (всього 42 джерела). Як джерела азоту вивчалися різні амінокислоти і солі амонію, що вносяться також по еквівалентному вмісту азоту в середовищі Чапека. Відсутність зростання (або незначне зростання) відзначено на середовищах з ксиланів, лігніном, сорбоза, інозитом, спиртами аліфатичного ряду, органічними кислотами. Спорообразование не виявлено на середовищах з лактозою і гліцерином.
а - остротоксичні штам 12694 (1 - арабиноза, галактоза, аспарагін, крохмаль- 2-глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза- 3 - декстрин, рафіноза, целлобіоза- 4 - пектін- 5 - аланін 6 - лейцін- 7 - д триптофан, целюлоза) - б - слаботоксичний штам 14088 (8 - арабиноза, 9 - мальтоза, 10 - крохмаль).
Мал. 37. Токсичність культуральної рідини St. alternans для білих мишей в залежності від джерел вуглецю і азоту:
За активністю токсінобразованія придатність джерел вуглецю розташовувалася в порядку спадання: арабиноза, галактоза, крохмаль, глюкоза, сахароза, мальтоза, лактоза, рафіноза, целлобиоза, декстрини (рис. 37). Не відмічено токсінобразованія при зростанні гриба на середовищах з манітом, сорбітом і дульцітом. Інтенсивність росту і токсінобразованія у остротоксіческого штаму значно вище, ніж у слаботоксіческого. Максимальна токсичність у першого відзначалася через 36- 48 год, у другого - незначна на 10-12-й день і тільки на середовищах з арабінозою, мальтозою і крохмалем.
Хороший зростання гриба відзначений при використанні амінокислот гліцину, а-аланіну, триптофану, лейцину, аспарагіну (джерело вуглецю - сахароза) - спостерігалося значне освіту темно-коричневого пігменту на середовищах з триптофаном. При зростанні на середовищах з іншими амінокислотами, а також амонійними солями неорганічних і органічних кислот спостерігався слабке зростання в вигляді окремих дерновінок і міцелію на зразок клітин хламідоспорового типу.
При зануреному культивуванні St. alternans в колбах на середовищі Чапека з 3% -ної сахарозою максимум сумарного виходу неочищеного стахіботріотоксіна відзначений на 6-8-й день, значна його частина містилася в міцелії. До цього терміну кількість цукру в середовищі знижувався майже вдвічі: хроматографически виявлені глюкоза і сахароза. Максимум вмісту амінного азоту в
міцелії настає на четвертий день зростання, значно знижується до восьмого дня, причому до шестиденного віку дві третини загальної кількості азоту становить азот білків міцелію і одну третину - азот вільних амінокислот. Починаючи з чотириденного віку міцелій і культуральна рідина набувають темно-корічневочерную забарвлення. Пігмент не розчиняється в хлороформі і ефірі, але розчинний в ацетоні, адсорбується на вугіллі. 
Мал. 38. Спектри поглинання УФ-променів (а) і хроматограмма (б) на тонкому шарі алюмінію різних компонентів стахіботріотоксінов I, II, III (сг - світло-блакитне світіння, ок - оранжево-червоне).
* Додані кожен з розрахунку 4 мг С / мл, в дужках - вага міцелію в мг / мл.
Методом паперової хроматографії виявлено, що переважаючими амінокислотами білка міцелію в даних умовах культивування є глутамінова, а-аланін, пролін, метіонін, р-феніл-бета-аланін, а в чотирьох -шестідневном віці ще і аспарагінова, серин, гліцин, валін. У міцелії не виявлено орнитина, треоніну, лейцину. З незв`язаних амінокислот на 2-4-й день відзначено наявність глутамінової, аспарагінової, аргініну, а-аланіну і їх сліди в культурі шести - восьмиденного віку (рис. 38).
Перші дослідження хімічної природи токсинів St. alternans, що містяться в міцелії і конідій гриба, проведені фіалковий і Срібним (1949). У дослідах використовувався високотоксичні штам гриба, який культивували на Суслова агарі протягом 30 днів. Дослідженню піддавалися міцелій і конідії з чашок Петрі.
Токсини з міцелію і конідій екстрагували сірчаним і петролейним ефірами, хлороформом, 90 ° -ним етанолом, ацетоном, бензолом, дистильованою водою, 0,1 н. NaOH і 0,1 н. НС1. За даними авторів, вода і 0,1 н. НС1 витягували мало токсину. Найбільш активно витягувалися речовини етанолом, хлороформом і ефіром. Під час вилучення речовин 0,1 н. NaOH міцелій перетворювався в колоїдний розчин темно-бурого кольору.
Токсин багаторазово екстрагували в водяній бані при 40- 45 ° С до отримання неокрашіваемие розчинників і зникнення відомого осаду після видалення розчинника. Найбільш токсичними виявилися ефірні екстракти, які при внутрішньовенному введенні викликали у коней отруєння, характерне для стахіботріотоксикозу. Ці речовини були названі стахіботріотоксінамі. У ефірний екстракт переходять також стерини. Характерні кольорові реакції наступні.
- Резорциновий *. До 1 мл ефірного екстракту стахіботріотоксіна додають 0,5 мл концентрованої соляної кислоти і кілька кристаликів резорцину. Соляна кислота забарвлюється в інтенсивний червоний колір, через 24-48 год випадає червоний осад. Аналогічна реакція відзначена з орціном, Пирокатехин, гидрохиноном (Юськів, 1965).
- Реакція з концентрованою соляною кислотою *. До 1 мл ефірного екстракту додають 0,5 мл концентрованої соляної кислоти, яка забарвлюється в червоний або вишнево-червоний колір.
- Реакція з концентрованим розчином аміаку (по фіалковий і Срібному, 1949). До 1 мл ефірного екстракту додають 5-7 мл 96 ° -ного етанолу, обережно підігрівають і потім додають 5-7 мл концентрованого водного розчину аміаку (25%). Суміш кип`ятять 5-10 хв-спочатку з`являється інтенсивна чорно-фіолетове забарвлення, потім випадає осад чорного кольору.
- Реакція Лібермана - Бурхардтом (на стерини і деякі стероїди). 2-3 мл ефірного екстракту насухо випаряют, залишок розчиняють в хлороформі і до розчину додають трохи оцтового ангідриду, отриману суміш обережно нашаровуються на концентровану сірчану кислоту. На кордоні двох шарів з`являється зелене кільце, приймає потім фіолетову і буру забарвлення.
Виділення стахіботріотоксіна з ефірних екстрактів автори проводили розчиненням залишку 96 ° -ним етанолом, осадженням дистильованою водою і подальшої багаторазової очищенням. Отримані зазначеним способом речовини давали позитивні реакції з резорцином, соляною кислотою і аміаком, а також негативну реакцію Лібермана - Бурхардтом. За фізичними властивостями кожна речовина (наприклад, токсин А) являло собою безбарвний або блідо-жовтий аморфний порошок, слабко розчинний у воді, добре розчинний в ефірі, етанолі, хлороформі, ацетоні, анізол, піридині. Маслоподобний залишок давав позитивну реакцію на стерини.
Встановлено інші якісні реакції на стахіботріотоксін: розчинність в міцних розчинах їдкого натру і сірчаної кислоти, знебарвлення брому Хлороформний розчинами токсину з утворенням жовтого осаду і бромистого водню, знебарвлення лужними розчинами токсину 1- і 5% -ного перманганату калію, а спиртовими розчинами токсину St. alternans - фуксінсерністой кислоти, відновлення при тривалому кип`ятінні аміачного розчину срібла з утворенням дзеркала, позитивна реакція з метафенілдіаміном і реакція на деякі лактони (легальний, з пікратом натрію). У розведених розчинах їдкого натру стахіботріотоксін дає жовте забарвлення, поступово буріє, при підкисленні лужних розчинів токсину розведеними сірчаної або соляної кислотами випадає аморфний осад, що дає якісні реакції на токсин. При дії на спиртовий розчин токсину концентрованим аміаком розчин забарвлюється в зелений колір, потім в корічневий- після кип`ятіння суміші і відстоювання випадає аморфний порошок чорно-коричневого кольору (N-похідне стахіботріотоксіна). Ця речовина в 10 разів слабкіше діє на ізольоване серце жаби і дає негативну шкірну реакцію. Йод і бром-похідні дають позитивну реакцію з резорцином і негативну - з концентрованою соляною кислотою і аміаком. На підставі проведених досліджень встановлено формулу стахіботріотоксіна (С26-25Н38-39О6) і його молекулярна вага (446,3-430,3). Стахіботріотоксін, на думку авторів, відноситься до стероїдів, похідним пергідроцікло- пентенофенантрена, які мають в бічному ланцюзі ненасичену ЛАКТОН угруповання (як у геніни рослинних серцевих отрут або буфогенінов), лактонное кільце (аналогічне, можливо, такого сцілларціна А і буфогенінов), побудоване за типом лактонного кільця кумаріна- має чотири гідроксильні групи і одну активну подвійну зв`язок, мабуть, в ядрі. Автори вважають, що стахіботріотоксін утворюється грибом з стеринів в результаті їх біологічного окислення.
Таким чином, встановлено, що стахіботріотоксін представляє нову групу природних отрут, що зупиняють серце в систоле. Цей токсин відрізняється від серцевих глюкозидів, ефірів суберіларгініна, буфогеніна не тільки за хімічними властивостями, але і по фізіологічній дії. Методом тонкошарової хроматографії показано, що при зануреному культивуванні на середовищі Чапека St. alternans утворює три фракції токсичних речовин: дві - в міцелії Rf 0,6 (II) і Rf 0,92 (I) і одну - в культуральної рідини (Rf 0,6). Фракції з міцелію близькі до стахіботріотоксінам А і Б. Фракція I дає оранжево-коричневого кольору люмінесценцію в ультрафіолетових променях, фракція II (А) - яскраву, світло-блакитнувату. Максимум поглинання фракції II (А) становить 238- 240 ммк, фракції I (Б) - 238-240 і 278-280 ммк. Фракція III з культуральної рідини має Rf 0,6 максимум поглинання в ультрафіолетових променях - 233-240 і 278-280 ммк (Юськів, 1968).
Пашевіч (1950) вважає, що стахіботріотоксін має як пов`язані, але легко звільняються, так і вільні кислотні групи. Токсин стабільний при зберіганні і стійкий до впливу температури - витримує без значної втрати токсичності температуру 120 ° С протягом 2 ч.Устойчів також до впливу мінеральних і органічних кислот, КМп04, дії світла і ультрафіолетових променів. За даними Бакай (1944), міцелій і конідії стійкі до впливу рентгенівських і ультрафіолетових променів. Після п`ятигодинний експозиції гриб не втрачав життєздатності.
Стахіботріотоксін не стійкий до впливу лугів: при обробці ураженої соломи або токсину 0,5% -ним розчином NaOH або КОН і 1% -ним розчином амонію відбувається інактивація токсину.
Stachybotrys lobulata В е г к.-стахіботріс мелколопастной
Вид, близький за морфологічними і культуральними ознаками до St. alternans, володіє слабко виражені токсичні властивості, що проявляються, головним чином, у культур старого віку. Поширений переважно в Південній Європі і Південній Азії.
Таблиця 19
Токсичність різних штамів Stachybotrys alternans
і St. lobulata
показники | St. alternans | St. lobulata |
Кількість вивчених штамів | 21 | 16 |
З них: | ||
токсичних по резорцинової реакції | 13 | 4 |
токсичних по шкірній пробі | 5 | 2 |
Кількість загиблих тварин | 21 | 16 |
З них | ||
на 5-7-й день | 10 | 2 |
»8-й» | 6 | 5 |
»10-14-й» | 5 | 9, |
Юськів (19686) при порівняльному вивченні токсичності штамів St. alternans і St. lobulata різного походження показав, що при проведенні резорцинової проби 13 культур St. alternans дали позитивну реакцію, 5 - різко позитивну шкірну реакцію. При згодовуванні тваринам заражених кормів в різному ступені токсичними виявилися все штамми- з 16 штамів St. lobulata позитивна резорциновий реакція відзначена у 4 штамів, слабоположітельная шкірна проба - у 2- при згодовуванні тваринам токсичними виявилися всі 16 культур, але значно слабше, ніж штами St. alternans (табл. 19).
