Методи культивування токсичних мікроміцетів - токсінобразующіе мікроскопічні гриби
Г л а в а 4. МЕТОДИ культивування ТОКСИЧНИХ мікроміцетів І ВИЗНАЧЕННЯ ЇХ ТОКСИЧНОСТІ
Методи вивчення токсичних грибів дуже різноманітні і багато в чому подібні до методів мікологічних і мікробіологічних досліджень. Це - виділення з зерна, продуктів і кормів, а також культивування і визначення токсичності.
Правильне взяття зразків має важливе значення для успішного дослідження грибний флори. Для микологического аналізу береться зразок вагою близько 200 г. Він відбирається з середньої проби, яку зводять за загальноприйнятою способу: щупом з різних місць. Залежно від обставин методи взяття зразків можуть змінюватися, але при цьому має виконуватися одна умова: необхідно, щоб отриманий зразок максимально повно відображав стан корми в досліджуваній партії.
Вивчення грибний флори слід проводити насамперед в осередках, підозрюваних на недоброякісність корми. Вони зазвичай добре помітні, тому що являють собою потемнілі гнізда або прошарку нерідко зі специфічним запахом цвілі.
Якщо мікологічні дослідження продуктів або кормів викликано необхідністю з`ясувати причини захворювання людини або тварин, то крім відомостей, наведених в поданій до зразком етикетці (найменування господарства, час і місце взяття зразка), бажано також мати дані хоча б про основні ознаки перебігу захворювання.
В лабораторії проводиться загальний огляд зразка. Для цього його розкладають на чистій, найкраще білому папері і проводять огляд. Враховується загальний стан зразка: нормальна або ненормальна забарвлення, наявність або відсутність видимих ознак заплесневенія, грибів (наприклад, іржавинних або сажкових), які вразили рослини під час вегетації, наявність або відсутність запаху цвілі і т. П. Стебла, листя, суцвіття з поміченими на них грибними ушкодженнями досліджуються за допомогою мікроскопа. Препарати для перегляду під мікроскопом готують соскабливанием грибного нальоту, дерновінок, спорокучек і т. Д. Їх соскабливают чистим скальпелем, переносять в краплю води на предметне скло, накривають покривним склом і переглядають. За виявленими спорах або спороношенням судять про рід, часто також про вид і ступеня розвитку гриба на досліджуваному кормі. При наявності на зразках спороношений цей метод аналізу при ретельному його виконанні незмінно дає хороші результати.
Для визначення ступеня ураження соломи St. alternans проф. Н. А. Наумов (1937) запропонував метод змиву суперечка з досліджуваного зразка корму. Для цього зразок корми і соломинки нарізають дрібними шматочками, складають у колбу, заливають чистою водою до занурення всього шару і протягом 20 хв періодично збовтують. Отриману таким чином суспензія спор чистої піпеткою наносять краплями на предметні скельця (не менше 20 крапель). Краплі накривають покривними стеклами і переглядають під мікроскопом.
Цей метод може бути з успіхом застосований і для встановлення наявності на субстраті інших видів грибів, що утворюють спороношения на поверхні, але за умови, якщо суперечки легко змиваються водою. Якщо суспензія спор виходить недостатньо густий, що ускладнює можливість зробити чіткі висновки, тоді водну суспензію з колбочки треба злити, осадити суперечки за допомогою центрифуги і осад досліджувати, як зазвичай.
Застосування двох зазначених методів дозволить встановити наявність зараження субстрату багатьма видами грибів. Однак визначення грибів тільки у спорах далеко не завжди можливо, хоча, користуючись методом зіскоблювання, в препаратах виявляються і інші органи. Крім того, на досліджуваному зразку гриби не завжди бувають у вигляді спор, а часто лише в міцеліальних стадії. До того ж і міцелій може перебувати, принаймні в основній своїй масі, всередині зерна, стебел і інших органів рослин. Визначити вид гриба тільки по міцелію, за небагатьма винятками, майже неможливо. Для дослідження сапрофітних грибів на кормах їх в більшості випадків потрібно вирощувати або навіть виділяти в чисті культури. Тому в якості доповнення до першого з описаних методів вельми зручно застосовувати так званий метод накопичення. Досліджуваний субстрат нарізається шматочками (якщо це зерно, то цілком) і накладається в стерильні чашки Петрі на декілька шарів стерилізованої фільтрувального паперу. Потім в чашки додають стерилізовану воду в кількості 5 мл на чашку діаметром 12 см і залишають при температурі близько 25 ° С. Слід уникати освіти надлишку води, так як наявність водної плівки на поверхні корму затримує зростання багатьох грибів. Гриби, що знаходяться в субстраті в більш-менш розвиненому стані, зазвичай на другий-третій день дають рясний ріст. Зростання суперечка на поверхні субстрату помітний лише через кілька днів.
Розвиток грибів на досліджуваному зразку спостерігають протягом тижня. Іноді термін збільшують, якщо виникає необхідність простежити за розвитком певних видів грибів. Щоб уникнути підсихання субстрату в чашці при продовженні терміну спостереження в неї додають кілька мілілітрів стерильної води. Аналіз грибний флори проводиться найкраще за допомогою бінокулярної лупи зі збільшенням 24. Для розглядання окремих спороношений іноді потрібні більш сильні збільшення. Даний метод дозволяє проводити якомога повніший аналіз видового складу сапрофітних грибів. Цікавлять дослідника гриби знімаються препаровальной голкою або скальпелем, наносяться на предметні скельця і досліджуються під мікроскопом.
Виділення чистих культур при такому методі дослідження проводиться дуже просто. Для цього стерильною платинової голкою з конидиеносца або спорангия в поле зору об`єктива знімається кілька суперечка, які потім переносяться на живильне середовище в пробірки. Помітити окремі конідієносци багатьох грибів і зняти з них конідії платинової голкою можна користуючись збільшенням 24.
Даний метод в поєднанні з соскабливанием дає цілком задовільні результати. Гриби, які вразили зерно або грубий корм, легко виявляються, якщо чашки Петрі із зразками помістити в термостат з температурою 37 ° С.
Для виділення чистих культур грибів з субстрату можна користуватися методом змиву. Для цього після 20-хвилинного збовтування досліджуваного зразка в стерильній воді і в стерильній колбі отриману суспензію в кількості 0,5 мл відбирають стерильною піпеткою і переносять в стерильну пробірку, куди додають 4,5 мл стерильної води. Після збовтування суміш висівають на агарові середовища в чашки Петрі. Посів краще проводити шляхом додавання 1 мл суспензії до 9 мл розплавленої і остигнула до 45 ° С агарового середовища, яка потім розливається в чашки Петрі. У міру зростання колоній з чашок робляться пересівання суперечка або міцелію в окремі пробірки або чашки з живильним середовищем. В деталях цей метод можна видозмінювати. Однак для отримання чистих культур грибів з зерна, продуктів і кормів він має обмежене значення. По-перше, далеко не всі гриби, які вразили субстрат, можуть перебувати в стадії спороношення і, як уже говорилося вище, не всі суперечки в однаковій мірі доступні смиву- по-друге, можуть змиватися спори грибів, за своїми біологічними особливостями не здатні вражати даний вид зразка в природних умовах і тому є случайнимі- по-третє, види, що вразили субстрат, на штучному середовищі нерідко можуть бути пригнічені саме випадковими грибами і не дати зростання.
Ураженість злаків ріжків визначається за наявністю склероциев ( «ріжків») в колосках хлібних злаків і кормових трав або в навішуванні зерна за діючими правилами обліку. Для визначення ерготоксин в борошні користуються якісною реакцією на соду. Наводимо пропис реакції по Мішустін і Трісвятскій. До 10 г борошна додають 20 мл сірчаного ефіру, підкисленого 1 мл 10% -ної H2S04- після збовтування закриті пробірки залишають на 6-12 год для екстракції токсину, а потім відділяють ефір від муки фільтруванням. До фільтрату додають 2 мл розчину соди (1: 14) і дають деякий час відстоятися. При наявності ріжків осад набуває чіткий фіолетовий колір. Чутливість методу досягає 0,05%.
* Забрудненість зерна сажкою визначається шляхом прямого підрахунку уражених зерен, а також спор гриба в навішуванні. Облік розпорошених сажкових спор в навішуванні виробляють шляхом змиву з зерна водою і за допомогою лічильної камери.
Придатність для вживання досліджуваних партій харчового і кормового зерна визначають відповідно до існуючих ГОСТам. Ступінь ураженості зерна грибами встановлюють при пророщування не менше 400 зерен з різних частин зразка прямим підрахунком і мікроскопією ділянок міцелію, що виріс з ураженого зерна з подальшим визначенням видів в виділених чистих культурах. При цьому необхідно враховувати, що поразка, особливо видами Fusarium, може відбуватися як під час вегетації рослин, так і при зберіганні, яке при сприятливій погоді (підвищеної вологості) протягом тривалого періоду може виявитися значним. При глибокому ураженні колоса під час вегетації фузаріозні зерна легко відрізняються за зовнішнім виглядом: щуплі світло-рожево-червоно-коричневого відтінку, нерідко на поверхні мають рожеві або помаранчеві спородохій або слізевідние піонноти.
У перші терміни спостереження на зерні зазвичай з`являється (наприклад, у фузаріїв) білий пухнастий міцелій, частіше без спороношення. У цей час зручно проводити відсів в пробірки для отримання культур. При глибокому ураженні видами Аспергилл, пеницилла або інших в ранньому періоді також проводять підрахунок уражених зерен і виділення культур. У семиденнім зростанні встановлюють ступінь ураженості і мікроскопічним методом визначають основні види грибів.
Для виділення грибів, що руйнують целюлозу, суспензія спор можна висівати на стерилізовану фільтрувальну папір, покладену на дно стерильної чашки Петрі і зволожену рідкої синтетичної живильним середовищем без додавання джерел вуглецю.
*
Живильні середовища для вирощування чистих культур грибів
- Середовища невизначеного складу: а) природні (стебла, зерно, овочі, молоко і т. Д.) - Б) штучні, отримувані шляхом переробки природних субстратів.
- Середовища певного складу (синтетичні), які завжди є штучними.
За консистенцією розрізняють середовища щільні (тверді), напіврідкі (напівтверді) і рідкі.
Середовища невизначеного складу, що містять різноманітні пітельние речовини, найбільш придатні для висіву грибів з природних субстратів і їх тривалого культирование. Однак такі середовища мають загальний недолік. Хімічний склад субстратів, з яких вони готуються, може коливатися в залежності від різноманітних умов. Так, наприклад, коренеплоди, бульби, стебла і інші органи навіть одного сорту рослини можуть мати в тій чи іншій мірі різний склад в залежності не тільки від віку, але і від умов зростання, зберігання і т. П. Тому в точних дослідах повторність однакових умов вирощування грибів на таких середовищах досягається важко. Цього недоліку позбавлені середовища синтетичні. Але з огляду на те, що вони не містять живильних речовин, властивих середах невизначеного складу, зростання і спороношення багатьох грибів на них часто відбуваються гірше. Тому склад синтетичної середовища доводиться підбирати з урахуванням фізіологічних особливостей гриба. Зазвичай синтетичні середовища застосовуються при вивченні фізіології грибів, для діагностики і вивчення культуральних ознак. Як вказував Наумов (1937), «синтетичними» в строгому сенсі слова можна вважати лише ті середовища, до складу яких входять тільки хімічно чисті речовини. Середовища з агаром або желатином вже будуть не цілком синтетичні, так як ці речовини не володіють постійністю складу. Природні середовища для вирощування сапрофітних грибів, виділених з певного субстрату, найкраще готувати з того ж виду, на якому гриб виявлений. Для цього стеблинки, а часто і листя кормової рослини нарізають шматочками рівними, складають у вигляді пучка і вставляють в пробірку, в яку вливається вода, з таким розрахунком, щоб пучок соломинок в нижній частині був занурений у воду. Потім пробірки з приготованим таким чином грубим кормом стерилізуються в автоклаві при тиску 1-1,5 атм протягом 30 хв. Після стерилізації середовище готове до вживання. Середовищем, що складається з стерилізованого корму, доводиться користуватися в ряді випадків для виділення чистої культури гриба або для отримання типових для нього спороношений. Точно так же в пробірках можна приготувати середу з зерна, виробів з нього або з інших досліджуваних продовольчих або кормових субстратів.
Природні середовища також нерідко готують з бульб картоплі, коренеплодів моркви, буряка, різних плодів і т. П. Для цього зазначені органи рослин ретельно обмивають, нарізують скибочками відповідно діаметру пробірок, в які їх поміщають, потім 30 хв стерилізують під тиском 0,5 атм . На такі стерилізовані скибочки в пробірках висівають звичайним способом гриби. Скибочки досить швидко підсихають, що стає на заваді для зростання гриба. Щоб уникнути цього, користуються пробірками Ру, мають перетяжку, на яку скибочку впирається, а в резервуар, розташований нижче, наливають воду до стерилізації. Якщо немає пробірок Ру, то перш ніж закладати скибочки в звичайні пробірки, в них слід опустити короткі скляні циліндрики і наливати воду з таким розрахунком, щоб вона не досягала підстави скибочки.
Для вивчення окремих груп грибів часто застосовується стерилізований рис. Для цього його насипають в потрібній кількості в пробірки або колбочки, додають 2-2,5 обсягу води і потім проводять стерилізацію при тиску 0,5-1 атм протягом 30 хв. Таким же чином готують середовища з зерна інших злаків або крупи.
З рідких природних середовищ часто застосовується стерилізоване знежирене молоко. Його розливають в пробірки і стерилізується текучим паром три доби по 20 хв щодня.
Штучні середовища невизначеного складу зазвичай готують із застосуванням агару або желатину. До рідкому відвару або екстракту з природного субстрату додають 1-2% агару або 10-20% желатини. Потім середу гріють на киплячій водяній бані або в стерилізаторі до тих пір, поки агар або желатину повністю не розплавиться, потім розливають в потрібну посуд і стерилізують. Агарові середовища невизначеного складу іноді подкисляют соляної або сірчаної кислотою. Такі середовища придатні для вирощування багатьох видів грибів, а розвиток бактерій на них в більшості випадків гальмується. При значному подкислении середовища, приблизно до pH 4, потрібно мати на увазі, що агар в такому середовищі після стерилізації (особливо під тиском) НЕ твердне. Тому сильне підкислення можна виробляти лише після стерилізації, додаючи стерилізовану кислоту в ще не остигнула агарове середовище. Додається кислота повинна бути слабкої концентрації - 1: 10 або 1: 15 нормального розчину. На 1 л середовища зазвичай потрібно 12-15 мл такого розчину.
При виготовленні штучних середовищ невизначеного складу (як і середовищ синтетичних) для вирощування грибів з метою морфологічних досліджень слід уникати внесення зайвих кількостей поживних речовин, так як це часто призводить до жахливому розвитку грибів.
Суслова агар. Звичайне пивне сусло розбавляють водою до 7 ° щодо ареометру Баллінг (часто для цього додають три обсягу води), потім до нього додають 1,5-2% агару. Надалі Середовище готується як зазвичай, стерилізується при тиску 0,5-1 атм.
Картопляний агар. 200 г нарізаної скибочками, попередньо очищеного і обмитого картоплі варять 30 хв в 1 л води, потім отфільтровуют через марлю, до фільтрату додають воду до колишнього обсягу, вносять 1,5-2% агару і надалі середу готують, як зазвичай.
До картопляного агару часто додають 1-3% глюкози. Глюкоза сприяє більш інтенсивному росту грибів, культуральні ознаки яких в даному випадку виявляються більш чітко. Однак великі кількості глюкози, що рекомендуються деякими зарубіжними дослідниками, небажані, так як при підвищеному її змісті в середовищі зазвичай спостерігається потворне розвиток грибів.
Вівсяний агар. 30 г вівсяного борошна або 125 г вівсянки варять в 1 л води 30 хв, потім фільтрують через марлю і додають воду до колишнього обсягу, потім агар готують, як зазвичай.
Таким же чином готується середа через муки або роздробленого зерна інших злаків (кукурудзи, пшениці), а також з зерна бобових рослин.
При виготовленні середовищ з фруктів, листя або сіна 50 г потрібного матеріалу варять в 1 л води 30 хв, потім відвар отфільтровуют, додають воду до колишнього обсягу, потім - агар або желатину і т. Д. В середовища, виготовлені з листя або сіна, бажано додавати джерело вуглецю, наприклад глюкозу в кількості 1-3%.
Синтетичні середовища. Є велика кількість рецептів, запропонованих різними авторами для вирощування тих чи інших груп грибів. По суті багато з цих середовищ подібні за своїм складом і найчастіше відрізняються один від одного кількістю внесених в них поживних речовин.
При складанні рецептів синтетичних середовищ виходять з необхідності введення в їх склад основних хімічних елементів, важливих для харчування тих чи інших грибів і знаходяться в засвоюваних з`єднаннях. Джерелами вуглецю найчастіше служать: глюкоза, сахароза, мальтоза, розчинний крохмаль, гліцерин і маніт. Для спеціальних досліджень застосовують крім перерахованих і інші вуглеводи і спирти, а також солі органічних кислот, амінокислоти, які є одночасно джерелом вуглецю та азоту, і т. П. Для руйнують целюлозу грибів як джерело вуглецю застосовують звичайну фільтрувальну папір (краще всього беззольні фільтри), іноді - гигроскопическую вату, зволожену рідкої мінеральної середовищем.
Для грибних середовищ використовують різноманітні джерела азоту. При цьому враховують неоднакову здатність багатьох грибів засвоювати нітратний, аміачний та амінний азот. Джерелами нітратного азоту найчастіше є азотнокислий калій, хлористий натрій і азотнокислий аммоній- останній служить одночасно джерелом аміачного азоту.
Аміачний азот вносять в середу у вигляді амонійних солей різних кислот. Найчастіше для цього застосовують сірчанокислий, хлористий, азотнокислий або фосфорнокислий амоній. Останній одночасно є джерелом фосфору (в залежності від необхідної реакції середовища використовують одно-, дво- або трехзамещенний фосфат).
Як джерела фосфору в синтетичних середовищах зазвичай застосовується фосфорнокислий калій або фосфат натрій. Воліють однозаміщені солі фосфорної кислоти, як більш кислі. У деяких випадках, однак, застосовують також двузамещенного солі. Іноді для отримання потрібної реакції середовища однозаміщені сіль при додаванні в середу змішують навпіл з двузамещенного. Як джерело фосфору іноді застосовують і фосфорнокислий амоній (частіше однозаміщений), який є одночасно і джерелом азоту.
Джерелами сірки в синтетичних середовищах зазвичай служать солі сірчаної кислоти, найчастіше сірчанокислий магній, джерелами магнію - сірчанокислий або хлористий магній. Як джерела калію найчастіше використовується фосфорнокислий (зазвичай однозаміщений) або хлористий калій.
Як видно з викладеного, в складі кожної синтетичної середовища повинні бути основні хімічні елементи-вуглець, азот, фосфор, сірка, калій і магній. Однак для нормального харчування грибів часто необхідні і інші хімічні елементи, але в самих незначних кількостях. Це так звані мікроелементи. Було доведено, що нормальна чорне забарвлення конідій гриба Aspergillus niger відсутня, якщо в середовищі немає міді. Для того, щоб утворилася ця забарвлення в культурі, необхідно взяти кілька мікрограмів міді на літр середовища. Проте на звичайних синтетичних середовищах, до складу яких з`єднання міді окремо не вносять, цей гриб розвивається, утворюючи чорні конідії. Це пояснюється тим, що при складанні середовищ важко отримати абсолютно чисті хімічні сполуки, до того ж з цими сполуками зазвичай вносяться і невелику кількість ряду хімічних елементів, які не байдужі для нормального розвитку гриба.
Чимале значення має і якість скла лабораторного посуду, в якій вирощуються культури грибів. Ряд сполук може вилуговувати в живильне середовище зі скла. В цьому відношенні особливо відрізняються сорти лужного скла, які в залежності від буферности середовища можуть сприяти більш-менш швидкого її подщелачиванию. Тому для досліджень застосовують посуд з нейтрального скла «пирекс». Для більш точних дослідів користуються не тільки спеціально і найретельнішим чином очищеними реактивами, але також особливим способом перегнанной кілька разів дистильованою водою і кварцовою посудом. Синтетичні середовища в незрівнянно більшою мірою забезпечують порівнянність умов при повторності дослідів, ніж середовища невизначеного складу.
Більшість синтетичних середовищ, запропонованих для вирощування чистих культур багатьох видів грибів, має pH від 4,5 до 6,5. Кислотність в таких межах є найбільш сприятливою.
середа Чапека
Сахароза 30 г
Натрій азотнокислий 2 »
Калій фосфорнокислий однозаміщений 1 »
Магній сірчанокислий 0,5 »
Калій хлористий. 0,5 »
Залізо сірчанокисле (закисне) .. 0,01 »
Вода дистильована до .. 1 л
Агар 15-20 г
Зазначена Серед найбільш часто застосовується для дослідження грибів. Джерело вуглецю - сахароза може бути замінений в таких же вагових кількостях гліцерином, глюкозою та іншими вуглеводами (pH 6-6,2) Якщо необхідно довести цю середу до реакції, близькою до нейтральної, то, замість звичайних прийомів подщелачивания, нерідко вносять 0,5 г фосфорнокислого однозамещенного калію і 0,5 г двузамещенного на 1 л середовища.
Спрощена середу Ролена
Сахароза 30 г
Азотнокислий амоній 2,5 »
Калій фосфорнокислий однозаміщений 1 »
Магній сірчанокислий 1 »
Залізо сірчанокисле (закисне) 0,01 »
Агар .. 20 »
Вода дистильована. 1 л
Целлюлозная середу. Чисту фільтрувальну папір (краще за все взяти беззольні фільтри) нарізають смужками, складають так, щоб вийшли поздовжні складки, і закладають в пробірки. Після цього в них додають 2-3 мл рідкого середовища Чапека або спрощеної середовища Ролена без джерела вуглецю (мінеральну частину) з таким розрахунком, щоб смужки паперу занурилися в неї своїми підставами. Потім стерилізують при 15 ° С протягом 30 хв. Посів грибів виробляють на вологий папір. За активністю зростання на фільтрувальної папері судять про здатність гриба руйнувати целюлозу. Іноді в якості джерела вуглецю в аналогічних випадках застосовують гигроскопическую вату.
Культивування грибів на предметних стеклах
Культивування грибів на штучних поживних середовищах дає можливість всебічно вивчати їх морфологію і фізіологію. Однак при вивченні морфології грибів під час їх росту буває необхідно виробляти спостереження над процесами зростання і спороутворення безпосередньо під мікроскопом. Для цієї мети багато видів сапрофітних грибів культивують на предметних стеклах.
Поверхня чистого предметного скла прокаливают над полум`ям спиртового пальника і кладуть в горизонтальному положенні (прокаленной стороною вниз) на будь-яку підставку так, щоб скло спиралося на неї лише своїми краями. Потім на прокаленную сторону скла стерильною платинової петлею знизу наносять невеликий шматочок агаровой стерильного середовища. Після цього на прикріплений таким чином шматочок середовища стерильною платинової голкою або петлею наносять міцелій або суперечки досліджуваного виду гриба. Після посіву беруть чисте покривне скельце, прожарюють над полум`ям спиртового пальника, дають йому кілька охолонути і прикладають до предметного скла знизу, притискаючи шматочок агарового середовища. Предметне скло після цього можна зняти, а покривне скло слід обережно притиснути таким чином, щоб агарового середовища утворила тонкий шар. Покривне скло повинне лежати на предметному так, щоб однією стороною впритул доторкалося до предметного скла і розташовувалося по відношенню до нього під кутом 10-15 °. Для зменшення можливості забруднення культури іноді буває доцільно залити розплавленим парафіном три суміжні боку покривного скла, крім одного боку, найбільш віддаленої від поверхні предметного скла. Щоб уникнути підсихання середовища отриманий «живий препарат» поміщають у вологу камеру з таким розрахунком, щоб найбільш відкрита сторона культури була спрямована вниз або, іншими словами, щоб вершина кута, що утворюється покривним і предметним склом, була спрямована вгору. Вирощування гриба на предметному склі проводиться при потрібній температурі в термостаті або в кімнаті. Спостереження під мікроскопом можна проводити в будь-який час-в періоди між спостереженнями препарат потрібно зберігати у вологому камері.
Приготування препаратів для мікроскопічних досліджень
Найпростіший вид препаратів для мікроскопічних досліджень грибів - це водні препарати. На чисте предметне скло наносять краплю чистої води, потім на кінчику препаровальной або платинової голки в неї вносять невелику кількість досліджуваного матеріалу і вкривають чистим покривним склом. Після цього препарат готовий для розглядання під мікроскопом. Однак такі препарати мають суттєві недоліки. Вода в них швидко висихає, і препарат стає непридатним для розглядання під мікроскопом. Тому при тривалому вивченні препарату доводиться постійно додавати воду під покривне скло. Крім того, у воді швидко розпадаються ланцюжка суперечка і розчиняються оболонки спорангіев більшості видів мукорових грибів, що ускладнює мікроскопічні дослідження. Цих недоліків в значній мірі позбавлені препарати, в яких замість води застосовується суміш зі спирту, гліцерину і води, взятих у рівних обсягах. У такому розчині ланцюжка суперечка розпадаються повільніше, ніж у воді, і виготовлені на ньому препарати можуть зберігатися протягом декількох тижнів.
У ряді випадків для виявлення ланцюжків суперечка під мікроскопом доводиться готувати препарати на чистому спирті, додаючи його під покривне скло у міру підсихання об`єкта. Для зменшення висихання препарату буває доцільно заливати його по краях покривного скла парафіном і закладати вазеліном.
Препарати, які потрібно зберігати протягом багатьох місяців можна готувати на гліцерин-желатині наступного складу:
Желатину вищої якості 1 вагова частина
Гліцерин чістий7 вагових частин
Вода. 6 »»
Тимол або фенол .. Сліди
Після нагрівання гліцерин-желатину утворює гомогенну масу і зберігається в закритому посуді. Перед вживанням її розріджують нагріванням, і краплю наносять на предметне скло. Потім в цю краплю вносять у вологому вигляді досліджуваний матеріал, щільно покривають покривним склом при слабкому підігріванні і досліджують під мікроскопом.
Для виявлення проросткових пір при спостереженнях за будовою оболонок суперечка і спороносного апарату у грибів дуже зручний метод мацерації. До розглядання під мікроскопом досліджуваний об`єкт поміщають в краплю міцного розчину їдкого калію на предметне скло, нагрівають майже до кипіння над полум`ям спиртівки і прикривають покривним склом. Можна також застосовувати міцний розчин хромової кислоти, краплю якої вводять під покривне скло водного препарату.
При мікроскопічному дослідженні безбарвних об`єктів вельми корисно проводити їх фарбування. При приготуванні тимчасових препаратів застосовують метод так званої вітальної забарвлення. Для цієї мети використовується ряд фарб: з основних - генціан-віолет, метилен-Блау, сафранін, нейтраль-рот, анілін-Блау, метил-віолет і інші, з кислих-еритрозин, оранж і деякі інші. Концентрація барвника в розчині зазвичай не повинна перевищувати 0,001-0,005%, але в ряді випадків забарвлення краще вдається при концентрації, рівній 0,01%. Інтенсивність забарвлення оболонки і вмісту клітини залежить як від самої фарби, так і від досліджуваної групи грибів. Загальним може бути таке положення: при підвищенні концентрації розчину барвника вище певного оптимуму забарвлення об`єкта виходить занадто густа і суцільна, що ускладнює дослідження, а при надмірно слабкої концентрації розчину забарвлення залишається недостатньою. Для розчинення фарб, крім води для водорозчинних фарб, може застосовуватися, наприклад, молочна кислота (для анілін-Блау), гліцерин (для метилен-Блау) та інші розчинники, хоча забарвлення в цих випадках не може вважатися прижиттєвої.
Про методи дослідження токсичності
Встановлення видів грибів, токсичних для людини і тварин, є необхідною умовою для попередження отруєнь. Цілком зрозуміло, що воно повинно передувати вивчення властивостей токсичних речовин, що утворюються цими грибами, характеру їх дії на організм тварин, розробці способів знешкодження і методів лікування отруєнь.
Встановлення токсичності окремих видів грибів і особливо встановлення їх етіологічної ролі в тих чи інших захворюваннях зазвичай є важким завданням і вимагає участі відповідних фахівців різних галузей біологічної і медичної наук. Успішне вирішення цього завдання залежить від застосовуваних у таких дослідженнях методів, в яких повинні всебічно враховуватися особливості біології та пластичності того чи іншого виду токсичної гриба і мікроорганізму (або тварини), характер захворювання і т. Д.
При з`ясуванні природи отруєнь і встановленні їх збудників методи та шляхи вирішення завдання в кожному конкретному випадку можуть змінюватися. Тому нижче наводяться лише загальні міркування щодо методів випробування токсичності грибів, що випливають головним чином із завдань мікологічних досліджень. Вони включають три основні шляхи визначення токсичності грибів: встановлення токсичності субстрату, штучно зараженого культурою гриба в аліментарних дослідах на тварин-відтворення захворювання, аналогічного по симптомокомплексу природному отравленію- виділення токсичних метаболітів, вивчення їх хімічної природи і біологічної дії.
У тому випадку, коли на зразку не виявлено розвитку вже відомого виду токсичної гриба, на токсичність повинні досліджуватися перш за все види грибів, що зустрічаються на цих зразках в більш-менш значній кількості. Пр і цьому, звичайно, дуже бажано досліджувати якомога більшу кількість зразків, так як іноді вид гриба (збудника захворювання людини або тварин) може виявитися в невеликій кількості або навіть залишитися непоміченим. Крім ретельного аналізу таких зразків із застосуванням соскабливания, слід також користуватися якомога більшою, ніж зазвичай, повторністю аналізів за методом накопичення.
Виділені в чисті культури гриби потім висіваються в потрібній кількості. Питання про середовищах для вирощування грибів з метою отримання матеріалу для токсикологічних досліджень має важливе значення. Відомо, що умови харчування грибів роблять значний вплив на утворення ними токсичних речовин. Найбільш придатною середовищем для вирощування грибів при вивченні їх токсичних властивостей є субстрат, що викликав отруєння тварин. Для цього цілком доброякісний субстрат стерилізують в автоклаві і заражають чистої культурою досліджуваного гриба при відповідному зволоженні. У ряді випадків гриби можна вирощувати на середовищах невизначеного складу, наприклад на Суслова агарі, борошняних агарових середовищах і т. П.
Основним і вирішальним методом дослідження токсичності гриба для тварин є згодовування його або ураженого їм суб
страта. У дослідах по згодовування дуже важливе значення мають також встановлення дозувань матеріалу, скармливаемого тварині, вид тварини, його стан, а також раціон годування.
Аліментарні досліди з лабораторними тваринами проводять в двох серіях: а) гострі, одноразові згодовування субстрату, зараженого грибом або згодом виділеним з нього речовиною, і б) хронічні (тривале введення в організм малих доз корму, зараженого токсичним грибом, або токсину). Це дозволяє встановити характерні клінічні та патологоанатомічні ознаки, а також стадії перебігу аліментарного микотоксикозами.
Для вирішення окремих завдань при вивченні токсичності грибів або досліджуваного матеріалу можуть застосовуватися й інші методи: внутрішньовенне, внутрішньочеревне або підшкірне введення тваринам екстрактів з токсичного матеріалу, нанесення їх на депілірованних (звільнену від волосся) шкіру кролика або слизову оболонку ока. Ці методи можуть бути цінними при перевірці токсичності гриба, властивості токсичних речовин якого вже в тій чи іншій мірі вивчені. Якщо ж властивості цих речовин не відомі, то в аліментарних дослідах зазначені методи без перевірки токсичності гриба можуть привести до помилкових висновків. При парентеральному введенні в організм тварини або при нанесенні на слизову оболонку очей ті чи інші речовини можуть надати токсичну дію, а при згодовуванні деякі з них виявляються нешкідливими і, отже, не викликають аліментарного микотоксикозами. З іншого боку, при дослідженні токсичності гриба по нашкірної пробі ряд токсинів, утворених грибами, помітно не діє на шкіру і в той же час може викликати отруєння тварин при поїданні зараженого корму. Крім того, при нанесенні екстрактів з досліджуваного матеріалу на шкіру або слизову оболонку ока кролика або при парентеральному введенні необхідно, щоб ці екстракти дійсно містили в собі токсичні речовини, що утворюються грибом.
Хімічний метод визначення токсичності зерна (і інших субстратів), ураженого Fusarium sporotrichiella, запропонував Оліфсон. Він заснований на взаємодії токсичних стеролів з лугами, резорцином і фуксінсерністой кислотою. Поданим автора, відзначено збіг в 82-85% з даними біопроб.
Досліджуваний зразок спочатку екстрагують 50% -ним етанолом, насухо висушують, потім екстрагують етиловим ефіром ліпіди і токсичні стероли. Після видалення розчинника залишається масло, в якому якісно визначаються токсичні речовини наступними методами.
- Лужна реакція. Заснована на взаємодії стеролов, що містять шестичленное лактонное (кумаліновое) кільце з лугами. Додавання до розчину лугу ефірного екстракту при наявності стеролов викликає утворення бурого кільця на кордоні двох шарів.
- Резорциновий реакція. Заснована на освіту забарвлених продуктів конденсації лактонов з резорцином при наявності концентрованої соляної кислоти. Характерна також для кумарину, кумаліна, ароматичних альдегідів.
- Реакція Лібермана - Бухарда для визначення стеринів з подвійними зв`язками.
- Реакція на фуксінсерністую кислоту при наявності невеликої кількості аміаку. Якщо є токсичні стероли, то альдегидная група, утворена при дії на них аміаку, дає червоне забарвлення.
- Флуоресцентний метод. Флуоресценція лужних розчинів токсичних стеролів має жовто-зелений колір (спорофузаріоненін, поефузаріогенін, стахіботріотоксіни).
Крім специфічних хімічних реакцій для визначення токсинів останнім часом використовують хроматографічний метод. Після попереднього очищення речовина хроматографіруют зазвичай на тонкому шарі силікагелю з використанням певних систем розчинників і за значенням Rf визначають наявність токсину. Хроматограми виявляють за допомогою реактивів, що дають кольорові реакції з токсином, а також визначенням флуоресценції в ультрафіолетових променях або біоавтографіческім методом з використанням чутливих тест-мікроорганізмів.
Подальша елюція плями, виявленого на хроматограмі відповідними розчинниками, дозволяє виробляти кількісні визначення змісту токсину.
Первинні біологічні дослідження на наявність афлатоксинів проводяться на качат одноденного віку, у яких виявляються характерні ураження печінки.
Методи визначення токсичності арахісу і виробів з нього були предметом досліджень, що проводяться в багатьох лабораторіях Англії та інших країн Європи і США. В основному вони зводяться до отримання метанольних або хлороформних екстрактів з токсичного арахісу або виробів з нього, видалення розчинника і вторинної екстракції токсину метанолом, потім хроматографії екстракту на тонкому шарі окису алюмінію із застосуванням як розчинник 1,5% -ного метанолу в хлороформі або силікагелю з 5% -ним метанолом в хлороформі. У цих випадках компоненти афлатоксинов В1, G1, В2, В2 визначаються по флуоресценції в ультрафіолетових променях і відповідного значенням Rf, відомому для кристалічних препаратів, подальшої елюції плям хроматограмм з індивідуальними афлатоксинами і отриманням кристалічних препаратів.
Для достовірності флуоресцентного аналізу і відмінності афлатоксинов від інших флуоресціюючих речовин в екстрактах з токсичного арахісу використовуються також конфірматорние тести. Запропоновано три реакції з афлатоксином В1, засновані на здатності олефінове зв`язку фенольного ефірного кільця вступати в реакцію з гідроксильною групою під впливом сильної кислоти (афлатоксин Bj містить енольну ефірну одиницю в фуранового кільці): а) тест з оцтовою кислотою і тіонілхлорідом- б) з мурашиної кислотою і тріонілхлорідом- в) з трихлороцтової кислотою. Після додавання зазначених кислот до Хлороформний розчину афлатоксину суміш після видалення розчинника Хроматографіруют на тонкому шарі в 5% -ному метанолі в хлороформі. У типових випадках (т. Е. За наявності і зразку афлатоксина В1) продукти реакції «а» утворюють два плями однакового розміру і зі значеннями Rf близько 0,50 і 0,43 (Rf чистого афлатоксина - 0,50) - продукти реакції « б »дають одну пляму з Rf, рівним близько 0,18 продукти реакції« в »утворюють дві плями: одне, аналогічне афлатоксину B1, інше з Rf, рівним близько 0,20. Ці тести можуть бути застосовані і для афлатоксину G1.
Кількісне визначення афлатоксинів засноване на вимірі оптичної щільності метанолових елюатів з хроматографічних пластинок (363 mmk 363 ммк = 22 000). Токсична арахісова мука спочатку екстрагується петролінейним ефіром, потім - метанолом (6 год) - метанольний розчин розводиться дистильованою водою і знову екстрагується протягом 6 ч хлороформом. Концентрований хлороформний розчин Хроматографіруют на тонкому шарі силікагелю (750 мк) при використанні в якості розчинника діетілефіра і 2% -ного метанолу в хлороформі. Елюіруют холодним метанолом тільки чітко флуоресціюючу смужку або пляма, вільне від інших флуоресціюючих речовин. Кількість токсину в метанольна елюаті визначають по оптичної щільності розчину при 363 ммк (практично 210-400 ммк). За даними авторів, чутливість методу досягає 0,001 мкг. Запропоновано багато різних модифікацій цього методу.
