Ріжки паспаловая - токсінобразующіе мікроскопічні гриби

Claviceps paspali Stev. et Hall.-ріжки паспаловая
Клавіцепспаспалітоксікоз (Clavicepspaspalitoxicosis)
Поширений на видах Paspalum в тропічних і субтропічних країнах. Отруєння тварин відбуваються як на пасовищах, так і при стійловому утриманні при згодовуванні сіна зі склероціями гриба. Такі отруєння відзначалися, наприклад, в Австралії, Новій Зеландії, Африці, Південній Америці, США, Туреччини та ін. В СРСР вперше відзначено в 1942 р на чорноморському узбережжі Західної Грузії на Paspalum digiiaria і P. dilatatum.
У великої рогатої худоби, коней і ослів спостерігалося захворювання, відоме під назвою «бандани» (Маградзе, 1948).
За Салікової (1944), у коней отруєння протікає у важчій формі, ніж у великої рогатої худоби і свиней. У найбільш важкій формі воно протікає у виснажених тварин і молодняка. Тварини, що перехворіли сприйнятливі до повторних інфекцій. Захворювання розвивається на 2-6-й день після початку згодовування зараженого корму (трави).
Токсичні речовини гриба діють на центральну нервову систему тварин. Перша ознака захворювання - порушення координації рухів. Потім у коней виникають м`язове тремтіння, пригнічений стан і обмеженість рухів, похитування корпусу назад, вперед і в сторони. У корів відзначаються тимчасове слинотеча, хиткість ходи, лякливість, у деяких - розширення зіниць, підвищена збудливість. Температура тіла залишається нормальною або падає нижче норми. Слизова оболонка рота гіперемована. Пульс слабкого наповнення. Перистальтика кілька посилена. Залежно від тривалості хвороби (від 2-3 днів до 1-2 місяців і більше) вгодованість тварин знижується до повного виснаження. Надої зменшуються. Але молоко і м`ясо хворих тварин для людини нешкідливі.
При розтині зазвичай виявляються місцеві вогнищеві ураження слизової шлунка, дегенеративне зміна серцевого м`яза і гіперплазія лімфатичних, особливо мезентеральних, залоз- на запаленої оболонці шлунка є гіперемійовані ділянки і, в невеликій кількості, точкові крововиливи. Більш різко виражені фокусна гіперемія і вогнищеві крововиливи на слизовій оболонці тонкого кишечника. Слизова ободової і сліпої кишок очагово гіперемована і місцями геморагічний збуджена. Відзначається ін`єкція судин спинного і головного мозку і паренхиматозное переродження печінки.
Через два-три дні після зміни корму тварини одужують.

Мал. 13. Структура деяких алкалоїдів С /, purpurea:
а - тетрациклічні ядро алкалоїдів ріжків, 6 - похідні лізергінової кислоти, в - похідні клавінови алкалоїдів.
Запобіжні заходи проти захворювання полягають в ранній косовиці сіна до освіти конідіальной стадії (сфацеліі) і склероциев, недопущення згодовування уражених рослин, знищення паспалума (Paspalum) в чагарниках і т. П.
При отруєнні CL paspali великої рогатої худоби, коней і овець зазначалося, що зрілі склероции гриба менш токсичні.
ніж молоді, але більш токсичні, ніж гриб в стадії сфацеліі (Підо Плічко, 1953).
Багато робіт присвячено дослідженню різних аспектів біології ріжків і Ерготизм, екології гриба, чутливості різних сортів жита до зараження, умов штучного зараження, впливу різних умов на токсичність склероциев, хімічної природі ерготоксин і ін. В останні роки досягнуто значних успіхів у вивченні хімії і фармакології ерготоксин , а також методу сапрофитной культури гриба.
В даний час описано велику кількість токсинів ріжків і їх похідних, що володіють високою біологічною активністю і широко застосовуваних у медицині. Ерготалкалоіди представлені двома основними типами: клавіналкалоідамі, їх похідними і пептидними алкалоїдами, похідними лізергінової кислоти. До складу зазначених типів входить ряд близьких, але відрізняються будовою і властивостями токсинів (рис. 13).
Алкалоїди клавінови типу, мають в основі ерголін (аргоклавін, елімоклавін і ін.), Досить простої будови з молекулярною вагою близько 250. У сапрофитной культурі їх отримують порівняно просто. Більш складний токсіногенез алкалоїдів поліпептидного типу, що мають в складі лізергінову і ізолізергіновую кислоти. Молекулярний вага цих алкалоїдів дорівнює близько 600 вони відзначені переважно в міцелії С /, purpurea. Токсіногенез і освіту алкалоїдів ріжків в сапрофитной культурі при поверхневому і глибинному методах культивування вивчалися багатьма авторами (Abe і ін., 1953, 1955, 1961, 1966- Taber, 1957- Taylor і ін., 1960, і ін.).
Неклавіновие алкалоїди представлені епімернимі парами - амідними похідними лізергінової і ізолізергіновой кислот. Біологічною активністю володіють похідні лізергінової кислоти.
Лізергінової кислоти містить хіноліновий і індольної структури- наявність останньої обумовлює характерне сінефіолетовое фарбування її розчинів з гліоксалевой і концентрованої сірчаної кислотами, яке використовується при якісному і кількісному визначенні ерготал кал оідов.
Простіші амідні похідні лізергінової кислоти (ергометрін і ергометрінін) утворюють один ряд з`єднань, похідні з поліциклічної пептидного ланцюгом (ерготамін і ерготамінін) - інший ряд (табл. 1).
В даний час описано велику кількість похідних клавінови і лізергінової алкалоїдів, виділених з склероциев або з сапрофитной культури З /, paspali і С /, purpurea, що відрізняються фармакологічними, токсичними та іншими властивостями. Так, ерготоксин, ерготамін, ергозін діють на гладку мускулатуру, звужують зіницю, кровоносні судини, викликаючи порушення харчування тканин (ціаноз і гангрену), паралізують рухові симпатичні нерви. Ергометрин в сильній мері скорочує мускулатуру матки, але менш токсичний (не викликає гангрени).
Визначення токсинів проводиться різними способами: фармакологічними, хімічними по кольоровим реакціям і інтенсивності флуоресценції, УФ-спектрометрією і хроматографією (Vining, Taber, 1963).
Таблиця 1
Коротка характеристика деяких алкалоїдів Cl. purpurea

Виділено штами Сz. | Purpurea, що утворюють в паразитного і сапрофітної культурах переважно клавінови алкалоїди або алкалоїди лізергінової кислоти.
Тейбер і Вайнінг (Taber, Vining, 1960) вивчали в сапрофитной культурі ерготалкалоідобразующіе властивості у 41 штаму С /. рігрігеа, виділених з різних рослин, Aspergillus flavus, Coniothyrium fuckelii, Ustilago bulata, U. trebouxii, U. maydis, Penicillium roqueforti.
Відзначено визначається кількість ерготоксину у 18 штамів С /. purpurea і освіту у P. roqueforti речовин, аналогічних за значенням Rf з елімоклавіном, пенніклавіном і аргоклавіном. З досліджених джерел вуглецю найбільш придатними для освіти алкалоїдів виявилися галактоза з домішкою глюкози- зростання не відзначався на середовищі з дульцітом і глюконатом. Як джерела азоту більш придатними виявилися амоній янтарно-кислий, соєве борошно, сечовина, дріжджовий екстракт. На середовищі з азотнокислим калієм, сечовиною і / -тріптофаном, як єдиними джерелами азоту, зростання гриба спостерігався, але при додаванні 500 мг! Л / -тріптофана - до середовища з янтарнокіслим амонієм
вихід ерготоксину в 35-денний культурі майже подвоювався. Не відмічено зростання гриба на середовищі з винної, фосфорної, оцтової кислоти, але хороший вихід ерготоксину отриманий на середовищі з бурштинової кислотою. Автори встановили, що на синтез ерготоксин значно впливає співвідношення джерел вуглецю (галактози) і фосфору (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив співвідношення галактози і фосфору на освіту алкалоїдів Claviceps purpurea

На підставі проведених досліджень встановлено типові показники зростання гриба і освіти алкалоїдів. Останнє настає при виснаженні основних компонентів середовища і значного періоду (до 20 днів) зростання міцелію (рис. 14).

Мал. 14. Зростання і освіту ерготалкалоідов Claviceps purpurea в сапрофитной культурі на середовищі з галактозою.
Штами С /, purpurea відрізняються за здатністю утворювати алкалоїди при зростанні на середовищі з різними цукрами і джерелами азоту. З досліджених штамів 10 утворювали алкалоїди при зростанні на середовищі з галактозою, 8 - на середовищі з сахарозою і тільки один штам - на середовищі з лактозою.
Досліджувані штами розрізнялися також за діапазоном використання цукрів: один штам утворював алкалоїди при використанні п`яти цукрів, три - при використанні чотирьох і т. Д. Однак прямої залежності між здатністю використовувати цукру і освітою алкалоїдів не відзначалося. З п`яти штамів С /. purpurea два утворили алкалоїди при зростанні на середовищі з янтарнокіслим амонієм, три - при зростанні на середовищі з дріжджовим екстрактом і жоден - при зростанні на середовищі з аспарагін.
Відзначено різна активність штамів С /, purpurea і вплив середовища на загальний вихід і склад ерготоксин. Додавання тіаміну і цистеїну кілька підвищувало загальний вихід алкалоїдів. Умови, що сприяють росту міцелію, не завжди сприяють біосинтезу токсинів (Voigt, Keipert, 1967). спостерігається значна
ингибиция біосинтезу токсинів в атмосфері дейтерію (Mrtek і ін., 1967).
Тайберг і Ванінг показали зміни в складі компонентів міцелію С /. purpurea, що відбуваються в період зростання, у зв`язку з утворенням ерготалкалоідов в залежності від різної концентрації в середовищі фосфатів, джерел азоту, а також від процесу адаптації інокулюму до використання галактози (Taber, Vining, 1963).
Отримані результати дозволяють вважати, що інтенсивність росту міцелію не є загальним фактором регуляції освіти ерготалкалоідов. У міцелії культур перед початком освіти токсинів акумулюються поліоли, вуглеводи, ліпіди і вони залишаються вищими концентрація водорозчинного азоту і РНК.
Посилення росту міцелію при високій концентрації фосфатів в середовищі не супроводжується збільшенням освіти ерготалкалоідов- найбільший вміст загального азоту зафіксовано при зростанні на середовищі з низькою концентрацією фосфатів. Акумуляція РНК і водорозчинного азоту є найбільш характерним показником освіти ерготалкалоідов.
Виходячи з цього, автори вважають, що освіта ерготалкалоідов відбувається в період перехідної фази зростання, яка характеризується продовженням акумуляції азоту, але не вуглеводних резервних речовин. При хроматографическом дослідженні цукрів і поліолів міцелію С /. purpurea встановлено, що головними і постійними резервними компонентами його є трегалоза і маніт, наявність інших вуглеводів (глюкози, арабіта, гліцерину, дульціта) залежить від складу живильного середовища для культивування гриба (рис. 15).
Показано значний вплив неорганічних компонентів середовища - різних мінеральних солей і мікроелементів - на ріст і утворення алкалоїдів лізергінової ряду (Rosarra і ін., 1967).
Автори використовували штами Claviceps paspali, що утворюють лізергінову кислоту і її похідні. Зокрема, встановлено істотний вплив мінерального складу водопровідної води на освіту алкалоїдів, в зв`язку з чим рекомендовані середовища зі спеціальним складом мінеральних солей, що стимулюють синтез алкалоїдів лізергінової кислоти.
Автори селекціонували штам З /. paspali, який при культивуванні гриба на цих середовищах утворював понад 1000 мкг алкалоїдів на 1 мл середовища.
У першій стадії росту гриб культивувався на основний середовищі з 4% -ним манітом, 1% -ний бурштинової кислотою і мікроелементами, в другій - на середовищі з 5% -ним манітом і 3% -ної бурштинової кислотою. У третій стадії визначали зростання і освіту алкалоїдів в залежності від наявності деяких мінеральних солей і мікроелементів: Са (N03) 2 - * H2OJ (l, 27 • 10-3), MgS04 • 7H20 (3,25 x X кг3), ZnS04 • 7H20 (1,74 • КГ5), FeS04 • 7H20 (1-80 • 1 (T4), CuS04 • 5H20 (2,01 • 1 (П5), MnS04 • 4H20 (4,48 • 10-5), NaNO,
(1,19 • 10-3), KH2P04 (7,35 • 10 ~ 3) в молях на літр. Встановлено, що для штаму С /, paspali потреба в калії і магнії для росту міцелію була такою ж, як і при алкалоідообразованіі.

Мал. 15. Зміна складу ендогенних цукрів і поліолів в міцелії
Claviceps purpurea в залежності від складу живильного середовища:
а - глюкоза і сукцинат амонію, б - галактоза і сукцинат амонію, в-маноза і сукцинат амонію, г-маніт і сукцинат амонію.
Максимум зростання відзначений при більш низькій концентрації фосфору, заліза, цинку, ніж при утворенні алкалоїдів. Марганець і мідь істотно впливали на синтез алкалоїдів (рис. 16).
Шалагина і співробітники (1965) вивчали освіту алкалоїдів у 32 штамів С /. purpurea, виділених з склероциев злакових трав, пшениці, жита в різних географічних районах СРСР. Гриби культивувалися в поверхневій культурі на середовищі наступного складу (в г! Л): сахарози - 75, сорбіту - 25, амонію лімоннокіслого - 5, КН2Р04 - 0,25, Са (ON3) 2 - 1,5, MgS04 - 0,25 , КС1 - 0,125, ZnS04 - H20 - 0,00003, FeS04. 7H20 - 0,03, цистеїну - 0,01, аневрін - 0,0001, біотину - 0,000001 (pH 6,5). Наявність токсинів в міцелії визначали в півтора-двомісячної культурі. Більшість вивчених штамів при даних умовах утворювали ергокріптін і ерготамін- останній був переважаючим, він становив до 80% всього виходу алкалоїдів.

Мал. 16. Вплив мікроелементів на ріст міцелію і освіту ерготалкалоідов в сапрофитной культурі Claviceps paspali:
а - калій, б - фосфор, в - магній, г - сірка, д - залізо, е - цинк, ж - марганець
з - мідь (1 - міцелій, 2 - ерготалкалоіди).
Їх загальний вміст дорівнювало близько 0,03% по відношенню до сухої ваги міцелію (табл. 3).
Таблиця 3
Склад алкалоїдів, утворених різними штамами CL purpurea

Кастаньолі і Мантл (Costaghnoli, Mantle, 1966) досліджували будову алкалоїдів, утворених в сапрофитной культурі штамами С /, purpurea, ізольованими з різних трав. Було показано, що у штаму ізольованого з Spartina townsendii при pH 8,5 витягується хлороформом з фільтрату близько 40% токсинів, решта - бутанолом при pH 3,5. Хроматографією хлороформного екстракту на папері і в тонкому шарі силікагелю у великій кількості було отримано хеноклавін і в незначному - елімоклавін і ерготоксин. При хроматографії л-бутанольного екстрактів автори у цього штаму виявили d-лізергінову кислоту і її ізомер 6-метілергол-8-ледве-8-карбоксил кислоту. d-лізергінової кислоти в незначній кількості раніше була ізольована з фільтратів штамів С /, purpurea, виділених з Pennisetum typhoideum.
Костаньолі і Тоноло (1966) вивчали освіту ерготалкалоідов CL purpurea і С /, paspali в зануреної культурі. Встановлено, що в сапрофитной культурі синтез ерготалкалоідов відбувається у аспорогенних штамів (що не утворюють конідій). У активних алкалоідобразующіх штамів, особливо в зануреної культурі, гіфи міцелію за характером росту і функціональної активності мають ряд фаз. Фаза, що характеризується наявністю типової склероциальной структури міцелію з короткими потовщеними клітинами і рясними включеннями жиру, пов`язана з утворенням ерготалкалоідов.
При культивуванні штамів С /, purpurea і CL paspali на пептонно-маннітного середовищі відзначено п`ятиразове збільшення виходу токсинів при підвищенні концентрації цукру від 5 до 25%.
Зростаючі клітини і неклітинні екстракти досліджуваного штаму CL purpurea в сапрофитной культурі містять ферменти, які здійснюють різні шляхи метаболізму глюкози. При зростанні в зануреної культурі на сахарозному-мінеральному середовищі або середовищі з сечовиною і дріжджовим екстрактом в неклітинних структурах виявляються гексокіназа, глюкозо-б-фосфатдегідрогенази, дегидрогеназа 6-фосфоглюконової кислоти, альдолаза, ферменти пентозного циклу (Me Donald та ін., 1960). Радіографічних встановлено відносне значення різних шляхів метаболізму глюкози у гриба: 90% глюкози перетворюється зростаючими клітинами в результаті гліколізу і циклу Кребса, 10% глюкози засвоюється шляхом пентозо- фосфатного циклу. Ферментативні шляху руйнування алкалоїдів досліджувалися при окисленні їх пероксидазой хрону (Taylor, Shough, 1967), декарбоксилировании мічених триптофану і його похідних в молекулі аргоклавіна і алімоклавіна (Plieninger і ін., 1967) - виявлені специфічні ферментні реакції гідроксилювання у багатьох видів грибів (Beliveau, Ramstad, 1966, і ін., Оранская, Гончарова, Безбородов, 1969).
Встановлено різна потреба гриба в фосфатах для максимального зростання міцелію і освіти ерготалкалоідов. У процесі росту гриба значно зменшується вміст ортофосфата в культуральної рідини, знижуються освіту кислоторозчинних, кіслотонерастворімих поліфосфатів та використання перших в зв`язку зі збільшенням вмісту РНК (табл. 4).
Таблиця 4
Співвідношення фосфатів в процесі росту Claviceps purpurea

* У відсотках Р04 від екзогенного КН2Р04.

Як видно з табл. 4, в 35-денний культурі CL purpurea при максимумі освіти ерготалкалоідов значна частина екзогенного фосфату використовувалася для освіти РНК. Припускають, що співвідношення рівня освіти РНК і кількості кіслотонерастворімих поліфосфатів типово для токсінобразующего штаму С /, purpurea. Вивчено вплив пуринових похідних і енергетичних фосфатів на синтез РНК, освіту ерготалкалоідов і вміст фосфатів (Waart, 1960, 1961).
Запропоновано ряд схем біосинтезу клавінови алкалоїдів і алкалоїдів лізергінової кислоти. У дослідах з міченим а-триптофан по94 казано, що він є попередником лізергінової кислоти. Грегер (Groger et al., 1961, 1964, 1966) показав, що триптофан є попередником клавінови алкалоїдів у клавінобразующіх штамів CL purpurea в сапрофитной культурі. Послідовність їх біосинтезу йде за схемою: триптофан елімоклавін хеноклавін -gt; агроклавін елімоклавін похідні лізергінової кислоти.
Тейлор і Ремстед (Taylor, Ramstad, 1960) знайшли, що Мевалонова кислота служить попередником з-з-пентеніловой частини лізергінової кислоти.
Плінінгер (Plieninger, 1965) вважає, що біосинтез ерготоксин здійснюється за наступною схемою: агроклавін елімоклавін лізергінової кислоти -gt; ерготалкалоіди.
Костаньолі і Ментл (Costahgnoli, Mantle, 1966) досліджували шляхи біосинтезу карбіноламідной бічного ланцюга - оксіетіламіда лізергінової кислоти, що має структурну схожість з пептидними бічними ланцюгами алкалоїдів типу ерготаміну. У дослідах авторів алкалоїд шляхом піролізу перетворювався в ацетальдегід і амід лізергінової кислоти-було показано, що з багатьох речовин, що входять в молекулу алкалоїду, тільки аланин і піруват в значній мірі включалися в бічний ланцюг (табл. 5).
Таблиця 5
Включення радіоактивних речовин в молекулу а-оксіетіламіда лізергінової кислоти

Мейер, Кіба та Комерсова (Mayer, Kybal, Komersova, 1967) досліджували ерготамін і ерготоксінобразующіе штами гриба. При їх зростанні на середовищі з міченим аланином в гидролизатах ерготоксину значна частина радіоактивності містилася в валін і лейцин. Мічений метіонін не включаються ні в одну із структурних одиниць пептидного ланцюга. Обговорюються можливі шляхи синтезу пептидних ланцюгів.