Дендродохіотоксікоз - токсінобразующіе мікроскопічні гриби
Dendrodochium Bonord.- дендродохій.
Дендродохіотоксікоз (Dendrodochiotoxicosis)
Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bil.- дендродохій токсичний
Викликає аліментарний токсикоз і пневмотоксікоз у людини і сільськогосподарських тварин. Дендродохіотоксікоз вперше описаний при вивченні захворювання коней в 1937 р на півдні УРСР. Воно характеризувалося швидкою загибеллю коней, головним чином в період зимово-весняного стійлового утримання. Етіологія захворювання встановлена в 1939 р в результаті комплексного вивчення- відтворена на конях клініка- досліджені патоморфология і деякі фармакологічні властивості утвореного грибом токсину (Борисевич 1947- Підоплічко, Білай 1947- Пономаренко, 1947- Петровський, Платонова-Петровська, 1949).
Всебічне вивчення мікофлори грубих кормів дозволило виявити певний взаємозв`язок між вживанням запліснявілих кормів і захворюванням, а також новий остротоксіческій гриб Dendrodochium toxicum. Було показано, що цей гриб відноситься до числа найбільш токсичних видів мікроміцетів. При згодовуванні тваринам уражених навіть в незначній мірі грубих кормів виникають отруєння. Як уже згадувалося, характерною особливістю захворювання є швидка загибель тварин, що наступає нерідко вже через 12-24 годин після поїдання смертельної дози токсичного корму. За даними Пономаренко (1947), при зовнішньому огляді трупів тварин виявлені різко виражений ціаноз видимих слизових оболонок (кон`юнктиви очей, слизової носа і передодня рота), а іноді і виділення пінистої або кров`яної рідини з носової порожнини. При розтині з`ясувалося, що органи і тканини передньої частини тіла переповнені кров`ю, є вогнищеві студневидного інфільтрати, найчастіше в клітковині грудних м`язів, а також крововиливи, частіше множинні, точкового типу, ціаноз слизової рота. У носовій порожнині - транзитна піниста, іноді забарвлена в рожевий колір рідина-легкі набряклі, під легеневої плеврою, на епікарді і під ендокардит, - крововиливи. Відзначаються також анемія органів черевної порожнини і дрібні крововиливи в тонкому кишечнику. Іноді виявляються прижиттєві або посмертні розриви шлунка, застій в судинах і субстанції мозку і різних його відділів, множинні крововиливи точкового типу. В окремих випадках спостерігаються ураження атріовентрикулярного пучка серця-волокна Пуркіньє набряклі, з жировими включеннями.
Відтворення захворювання стало можливим після врахування ряду особливостей росту і токсінобразованія гриба в природних умовах при ураженні грубих кормів. У дослідах по з`ясуванню етіології було кілька груп коней, яким згодовували заражені грибом солома і полова, а також культура гриба. Загинули коні, яким було задано 400-450 г. зараженої січки або культури гриба D. toxicum на Суслова агарі з 190 чашок Петрі. Однак картину захворювання, що виникла при поїданні природно зараженого D. toxicum корми, відтворити не вдалося. Воно було більш тривалим і характеризувалося головним чином важким гастроентеритом з різким геморагічним запаленням. Наступна група коней, отримувала заражений корм в суміші з доброякісним в пропорціях 1: 1 і 1: 5, також загинула, але при менш схожою картині клінічних і патологоанатомічних ознак, характерних для даного захворювання. І тільки в групі тварин, яким згодовували заражену грибом суміш нестерильного корми (50% полови пшеничного, 16% сіна конюшини лугової і 34% сіна мятлика лугового), вдалося відтворити характерне захворювання, назване дендродохіотоксікозом. Експериментальний дендродохіотоксікоз може протікати не тільки в гострій, але також (в залежності від дози токсичного корму) в затяжний, колічной формі. В останньому випадку відзначаються ураження слизової рота, набряклість губ, пригнічений стан тварини, порушення серцевої діяльності і зміна складу периферичної крові, а також стоматит, гінгівіт, некротичні явища в порожнині рота і важкі некротичні ураження, головним чином у відділі товстих кишок.
Пономаренко (1947) встановив, що раптова загибель коней викликається специфічним дією токсину гриба на судинну систему тваринного. Автор вказує, що до встановлення цієї нової нозології, т. Е. Дендродохіотоксікоза, в порівняльній патології не були відомі захворювання з подібним блискавичним летальним результатом (крім сибірки).
За даними Борисевича (1947), через 15-16 год після згодовування отруйного корму в умовах експерименту у коней відзначаються пригнічений стан, прискорення пульсу і мале його наповнення, тахікардія, аритмія, посилення серцевого поштовху, розщеплення першого тону, слабкі коліки, загальна слабкість. Спостерігаються уповільнення седиментации еритроцитів, збільшення кількості гемоглобіну, еритроцитів і лейкоцитів. В лейкоцитарній формулі відзначається нейтрофилия з дегенеративним зрушенням ядра.
При нанесенні культури гриба D. toxicum або ефірних, хлороформних, спиртових екстрактів на депілірованних шкіру кроликів настає їх загибель з проявом характерних патологоанатомічних ознак. При згодовуванні чистої культури гриба або екстрактів відзначалася швидка загибель лабораторних тварин різних видів (Підоплічко, Білай, 1947).
Карпова-Бенуа (1954), Самсонов (1956) встановили зв`язок між захворюваннями людей на хлопкообрабативающей підприємствах, а також ураженням сировини D. toxicum і St. alternans.
Карпова-Бенуа досліджувала зразки бавовни-сирцю з республік Середньої Азії і показала, що вологе сировину уражається багатьма видами грибів, в тому числі токсичними. Під час переробки цвілого сировини конідії отруйних грибів розсіюються в повітрі, при вдиханні осідають на слизових оболонках дихальних шляхів або викликають захворювання при безпосередньому контакті працюють з ураженим токсичними грибами сировиною. У цьому випадку виникають ураження шкіри, особливо в області потоотделітель-них залоз. При нанесенні ефірного екстракту з культури D. toxicum, виділеного з бавовняного сировини, на депілірованних шкіру кролика настає загибель з явищами гіперемії і набряклості ураженої ділянки шкіри, ін`єкції коронарних судин, ураженнями серця, легенів, печінки. У хронічному досвіді відзначений ентерит з виділенням шматків слизової тканини кишечника разом з рідкими випорожненнями. За характером дії токсину на шкіру людини виникає реакція, що нагадує опік металом.
Самсонова (1960) в експерименті з морськими свинками, яких заражали конидиями D. toxicum респіраторним шляхом, встановили наявність характерних патологоанатомічних змін: катарально-десквамативний запалень слизових трахей і бронхів, мелкоочаговой бронхопневмонії, а також вогнищ серозногеморрагіческого інтерстиціального запалення, ателектазу і емфіземи, дистрофічних і запальних процесів у печінці, менше в нирках, явищ інтоксикації і серозногеморрагіческіх запалень в м`язах серця. Розвитку міцелію гриба в запалених ділянках не спостерігалося. На думку авторів, відмічені зміни свідчать про резорбтивном дії токсинів конідій і фрагментів міцелію гриба, що надходять через дихальні шляхи.
Спесивцева (1964) зазначає, що захворювання людей дендродохіотоксікозом зазвичай виникає при безпосередньому контакті з ураженим кормом або необережної роботі з культурою гриба. Найбільш характерні клінічні ознаки - дифузне запалення шкіри обличчя і різкий катаральний кон`юнктивіт. Таким чином, уражені грибом корму, промислове, головним чином целюлозовмістні сировину і рослинні залишки в грунті можуть служити причиною виникнення захворювань людини і сільськогосподарських тварин дендродохіотоксікозом. Як уже згадувалося, D. toxicum виявлений в грунті ризосфери і на коренях сільськогосподарських рослин в різних кліматичних зонах УРСР. Поодинокі штами гриба виділені з ризосфери кормових культур Литовської РСР, a D. toxicum разом з D. caucasicum був виділений з ризосфери кенафа на болотно-підзолисті грунті (Хасанов, 1963), з злаків Алтайського краю, Воронезької області, сіна суданської трави Краснодарського краю і інших субстратів (Саркісов, 1954).
Можна припустити, що гриб існує на рослинних рештках у грунті, промисловому целюлозовмістні сировину і деяких продуктах його переробки.
Згодом було встановлено, що дендродохіотоксікозом хворіють вівці (Спесивцева, 1964 і ін). У дослідах з слаботоксіческім штамом D. toxicum відзначені ознаки отруєння овець через 2 години після дачі суспензії конідій гриба з культури на стерильному вівсі. У тварин спостерігалися пригнічений стан, посилення серцевого поштовху, слабка рулінація і уповільнена перистальтика кишечника. Після трьох-і особливо п`ятикратного згодовування суспензії ознаки захворювання були гостро виражені: пригнічений стан, тварина періодично скреготало зубами, з`явилася тремтіння, був відсутній апетит і жвачка- слизові кон`юнктиви і ротової порожнини анемічні, пульс аритмічний і слабкого наповнення. Проби сечі на индикан і уробилин були позитивні. Зміни крові відзначалися після першого введення: збільшення кількості лейкоцитів (з 6,8 до 13,5 тис. В 1 мм 3), зменшення гемоглобіну (від 48 до 32), еритроцитів (від 5,2 до 3,6 млн. В 1 мм 3 ). В лейкоцитарній формулі відзначені нейтрофилия зі зрушенням ядра вліво до паличкоядерних і токсичназернистість в протоплазмі клітин. Загибель тварин наступала через 3-13 днів після введення культури.
За даними Спесивцевої, особливо чутливі до токсину D. toxicum кури. Згодовування 15-20 г зараженого зерна ячменю викликало загибель птахів через 18-20 год, часто без прояву клінічних симптомів, але завжди з різко вираженою синюшностью гребеня, що відзначається незабаром після початку годування. При менших дозах отруйного зерна (5 г щодня) клінічні ознаки розвиваються постепенно- різкий ціаноз гребеня в перший день досвіду, на 6-8-й день - слабкість ніг, млявість, в подальшому - тремор, хиткість ходи. Зміни в картині крові незначні до 6-8 го дня, перед загибеллю іноді збільшується кількість еритроцитів і гемоглобіну.
Мал. 41. Вплив дендродохіна на вагу щурів (самців) в залежності від тривалості дії і концентрації:
1 - контроль, 2-4 - 0,025, 0,05 н 0,075% дендродохіна в дієті.
Малашенко (1961) і Спесивцева (1964) показали, що до токсину гриба чутливі також багато видів дрібних лабораторних тварин: кролики, морські свинки, миші, щура. Спесивцева зазначає, що при згодовуванні зараженого зерна вівса, ячменю, культури гриба або водних екстрактів з нього в залежності від ступеня токсичності настає загибель тварин з проявом характерних ознак гострого токсикозу.
У дослідах Малашенко молодим і старим щурам скармливался корм, заражений спиртовим розчином комплексного препарату дендродохіна, що містить в 100 г корму відповідно 25, 50, 75 мг токсину. Показано, що починаючи з першого дня введення в корм препарату вага молодих тварин знижується (рис. 41). У тварин, які отримували корм з вмістом 25 мг дендродохіна (100г корму), приріст ваги припинявся з першого дня досвіду, зниження ваги зазначалося з 21-го дня-у тварин, які отримували 50 мг токсину (100 г корму), вага знижувався в значно більшій ступеня, і між 6-10 цілодобово всі тварини погібалі- серед отримували 75 г токсину при ще більш різке зниження ваги загибель наступала на 7-й день досвіду. Самки щурів виявилися кілька чутливіші самців. Дія токсину розвивалося в залежності від віку тварин: втрата ваги у дорослих була більшою, ніж у молодих, але виживаність у молодих виявлялася меншою, ніж у дорослих.
Порівняльна токсичність дендродохіна вивчалася на різних видах лабораторних тварин. Досліджувався токсин в концентрації 13,7 мг) мл в розчині оливкового масла при внутрибрюшинном і частково пероральному введенні. Найбільш чутливі до дендродохіну кролики, потім миші, морські свинки і щури (табл. 20). Чутливість залежить також від способу введення токсину, наприклад, при введенні мишам вона значно вище, ніж при пероральному введенні. У хворих тварин спостерігалися слабкість і інші ознаки отруєння, втрата рухливості (у щурів і мишей), кров`яні виділення з очей, утворення кров`яних ексудатів і т. Д.
Значення МЛД, ЛД50, ЛД100 дендродохіна для різних
лабораторних тварин
Чутливість дендродохіна для кроликів прийнята за одиницю.
Патологоморфологічний аналіз токсичної дії дендродохіна (Пономаренко, Скирта, Малашенко, 1961) показав, що тварини гинуть в першу чергу в результаті змін, що виникають в гемодинамической системі. Крім того, дендродохін впливає на м`язову систему бронхолегеневого м`язового каркаса, а також надає общетоксическое резорбтивна дія. Общетоксическое вплив і паралітичні зміни в легенях особливо чітко проявилися у щурів. Таким чином, було доведено, що дендродохін є діючий початок D. toxicum, що викликає захворювання дендродохіотоксікоз.
Зміна складу периферичної крові вивчався на кроликах в гострих, підгострих і хронічних дослідах. Тварини отримували щодня дозу ЛД100, ЛД50, МЛД, а також МЛД один раз на вісім днів, 1/10 і 1/20 МЛД - тричі на тиждень. При гострому досвіді, коли наступала загибель тварин (через 36-48 год), вже через 6 годин після введення дендродохіна відзначалося збільшення кількості лейкоцитів і зменшення - лімфоцитів, число яких до 36-ї години спостережень досягло відповідно 17 000 іноді 26 000 проти вихідного 7425 , лімфоцитів - до 905 проти вихідного 4205. Збільшувалася число сегментоядерних і паличкоядерних елементів, кількість еритроцитів зростала від 5289 тис. до 6396 тис., гемоглобіну - від 64 до 76 од. Таким чином, зміни в крові під впливом дендродохіна в гострих дослідах були ідентичні спостережуваним у коней при захворюванні дендродохіотоксікозом.
При введенні ЛД50 кількість лейкоцитів збільшувалося від 7462 до 8600 через 6 годин після введення, наростало до 11 600 на 5-ту добу, знижувалося до норми на 10-й і до 30-го дня спостережень. Аналогічна картина спостерігалася відносно лімфоцитів- їх кількість знижувалося з 4378 до 1129 через 12 годин після введення, досягало 3484 на 5-й день, на 10-30-й день поверталося до норми. Збільшення кількості палички-і сегментоядерних елементів спостерігалося при введенні ЛД50 протягом 12-24 чу потім - поступове зниження до норми також на 5-ту добу. Збільшення еритроцитів з 5170 тис. До 6000 тис. Відзначено на 1-2-й день після введення. Нарешті, при одноразовому введенні МЛД через три доби кількість еритроцитів збільшувалася з 5386 тис. До 7012 тис.- повернення до норми зазначалося на 20-ту добу. Число лейкоцитів збільшувалося від 7152 до 10 000 на другу добу і поверталося до норми на 15-е. Кількість лімфоцитів знижувався з 4016 до тисяча чотиреста двадцять одна через 24 год і поверталося до норми через 10 діб після введення. Таким чином, характерними змінами при дендродохіотоксікозе можна вважати лейкоцитоз, лімфопенія, збільшення числа еритроцитів, підвищення відсотка гемоглобіну, а також поява незрілих форм нейтрофілів, збільшення кількості паличкоядерних і сегментоядерних елементів, моноцитоз. Залежно від дози рівень і тривалість цих змін коливаються. При багаторазовому введенні МЛД характерні зміни периферичної крові наступні: поява молодих нейтрофілів, збільшення кількості палички-і сегментоядерних форм, швидкий розвиток лимфопении, збільшення плазматичних клітин, зменшення числа еритроцитів, відсотки гемоглобіну, кольорового показника крові. При тривалому введенні 1/10 МЛД до кінця другого місяця з`являються незрілі форми нейтрофілів, зменшується кількість лімфоцитів- при введенні У МЛД до кінця другого місяця відзначаються тільки незначні зміни периферичної крові і швидке їх відновлення. При гострому і підгострому токсикозах швидке відновлення крові настає в першу черги за рахунок лімфоцитів, повільне - за рахунок нейтрофілів.
Токсини D. toxicum утворюються як при ураженні природних субстратів, так і при культивуванні на різних середовищах. Білай і Підоплічко (1958) показали, що при культивуванні гриба на синтетичному середовищі з глюкозою або сахарозою токсин утворюється в міцелії і культуральної рідини при поверхневому і глибинному зростанні. Після екстракції ефіром, хлороформом або адсорбції активованим вугіллям, оксидом алюмінію культуральна рідина не містила токсину. У той же час екстракти або Елюат з активованого вугілля проявляли загальне і місцеве остротоксіческое дію. При порівняльному вивченні токсичності препаратів, отриманих після елюції різними розчинниками (хлороформом, ефіром, етиловим і метиловим спиртом), було показано, що найбільшою токсичністю володіли препарати, елюіруемие хлороформом, етанолом, найменшою - елюіруемие метиловим спиртом. Ці токсичні речовини були названі дендродохінамі.
Дендродохін в дослідах на лабораторних тваринах викликав патологоанатомічні зміни, аналогічні спостережуваним при дендродохіотоксікозе (Пономаренко, 1961).
Дендродохін є характерним метаболитом гриба, він виявляється тривалий час як в культуральної рідини, так і в міцелії гриба. Вивчення динаміки біосинтезу дендродохіна (в культуральної рідини і міцелії) в залежності від віку показало, що токсин виявляється в культуральної рідини починаючи з 24 год до 8-9-денного віку при зануреної культурі і до 60-денного віку при стаціонарної. Накопичення дендродохіна (Д1 - спирторозчинною фракції хлороформного елюата) в культуральній рідині залежить від способу посіву і ряду інших чинників. Так, при посіві суспензією конідій максимальний вміст відзначається на 10-й день, при посіві інокулюму 48-годинної культури на гойдалці - на 7-й день. При глибинної ферментації зростання біомаси і накопичення дендродохіна проходять значно швидше, максимум відзначений на 5-й день при посіві суспензією конідій і на 3-й день - при посіві інокулюму 48-годинної культури на гойдалці (табл. 21).
Таблиця 21
Накопичення дендродохіна в культуральної рідини в залежності від віку D. toxicum
* Посів конидиями.
** Посів інокулюму 48-годинної культури.
Примітка: НД - неочищений дендродохін- Ф-1 - токсична спірторастворімую фракція- Ф-2 - нетоксичний маслянистий залишок.
* Вперше запропоновано Л. М. Кульберга, співробітником Київського науково-дослідницького інституту гігієни харчування.
Як видно з табл. 21, в залежності від віку гриба співвідношення між спіртонерастворімой (неактивною, що містить стерини) і спирторозчинною (дендродохінсодержащей) фракціями змінюється в бік значного збільшення першої в більш старому віці і відсутності або незначного вмісту цієї фракції в ранньому віці культур, коли вже відзначається наявність дендродохіна в культуральної рідини.
У міцелії міститься незначна кількість дендродохіна. В обох варіантах стаціонарної культури (при посіві суспензією конідій і інокулюму) і при посіві інокулюму струшувати культури спіртонерастворімая (неактивна) фракція не виявлялася. Ці дані, очевидно, свідчать про те, що в процесі метаболізму гриба токсин може змінюватися.
У стаціонарній культурі зміст дендродохіна в міцелії при посіві суспензією конідій складає 2,5-11% загальної кількості до 30-денного віку, у віці 45 днів - 38, 60 днів - 89%. При глибинному культивуванні концентрація дендродохіна становить 47% в трьох - п`ятиденному, 25% -у п`ятиденному і 30% - в дев`ятиденний віці.
Таблиця 22
Вплив продуктів життєдіяльності D. toxicum на зростання його міцелію і токсінобразованіе
умови досвіду | Вага міцелію, мг | pH | Освіта конідій | Дендродохін, мкг / мл |
Контроль (посів на середовище) Посів на фільтраті | 370 | 5,61 | немає | 45 |
однодобового культури | 420 | 5,71 | » | 244 |
дводобовій » | 520 | 6,85 | » | 21 |
тридобової » | 600 | 7,25 | » | 29 |
четирехсуточнон » | 860 | 7,82 | рясне | 31 |
Дендродохін, мабуть, не робить токсичної дії на D. toxicum - при значному накопиченні його в культуральної рідини ріст міцелію з віком культури збільшується. Культивування D. toxicum на фильтратах різного віку не тільки не пригнічує, а й стимулююче діє на ріст міцелію, спорообразование і в окремих випадках - на біосинтез дендродохіна (табл. 22). При цьому відзначається пряма залежність між стимуляцією росту міцелію гриба на фильтратах культур чотирьох-трьох-денного віку в порівнянні з фільтратами культур двох-одно-денного. Найбільший вихід дендродохіна відзначений тільки у культури гриба, вирощеної на фильтратах одноденного віку D. toxicum. Наведені дані показують, що з віком в культурі D. toxicum утворюються метаболіти, що стимулюють ріст міцелію, і інгібітори токсінобразованія.
Методом збірної хроматограми проведено вивчення культуральної рідини D. toxicum в різному віці. Для висхідній хроматографії була застосована ленінградська швидка (ЛБ) папір. Культуральну рідину по 0,02 мл наносили на смужки фільтрувального паперу розміром 30 X 1 см. Після підсушування оброблялися різними розчинниками, знову просушують і виявлялися на газонах тест-культури Candida stellatoidea 63 на сусло-агарі при 28 ° С після 24 годин росту, а також в ультрафіолетових променях.
Таблиця 23
Хроматографія культуральної рідини D. toxicutn різного віку при прояві на тест-культурі
Candida stellatoidea 63
Облік результатів хроматографії виробляли за наявністю і розмірами стерильних зон. В результаті дослідження культуральної рідини протягом 10 днів зростання гриба в ній було виявлено ряд речовин. Одне з них - токсична речовина, розчинна у хлороформі, ефірі, бензолі, ідеалі, ацетоні, бутанолі, етилацетаті, має Rf 0,85-0,94 і відзначається в культуральної рідини протягом усього терміну спостережень, т. Е. При глибинному культивуванні до десятиденного віку (табл. 23). Дендродохін в петролейном ефірі не розчиняється. Надалі при вивченні хімічної природи дендродохіна і фізіології гриба для якісного і кількісного визначення користувалися методом паперової, а в ряді випадків тонкошарової хроматографії. У першому випадку прояв і кількісне визначення проводилося за допомогою тест-культури С. stellatoidea 62. D. toxicum характеризується високою активністю гідролітичних ферментів: амілази, целюлази, мальтази, ксиланази, інвертази та інших, а також, мабуть, специфічних ферментів, що окислюють глюкозу та інші гексози, гліцерин, маніт, фумаровую, мурашину і оцтову кислоти (на інших органічних кислотах зростання не відзначалося).
Білай і Харченко (1966, 1969) вивчали придатність різних з`єднань як джерел вуглеводу та азоту для росту D. toxicum і токсінобразованія при глибинному культивуванні гриба. Найбільш інтенсивний ріст міцелію відзначений на середовищах з клітковиною, крохмалем, глюкозою, сахарозою, мальтозою, манітом, фруктозою, галактозою і деякими іншими, які вносилися (крім крохмалю і клітковини) в еквівалентній кількості до змісту вуглецю в 3% -ної глюкози в середовищі ( рис. 42).
Мал. 42. Вплив різних джерел вуглецю на ріст міцелію і антибіотичну активність D. toxicum:
г - глюкоза, до - крохмаль, з - сахароза, г-л - галактоза, м - мальтоза, ф - фруктоза, м-н - манноза, ар - арабиноза, кс - ксилоза, л - лактоза (у% зростання на глюкозе- заштриховані ділянки - антибіотична активність в одиницях по відношенню до Candida stellatoidea 63).
Незначний ріст міцелію спостерігався на середовищі з етиловим, метиловим, пропилові спиртами, зростання був відсутній на середовищі з бутіловим спиртом, а також на середовищі з винною кислотою і натрієм виннокислих, хоча при внесенні 1/3 і 1/10 еквівалента цих речовин спостерігалося проростання конідій. Чи не відзначалося зростання міцелію на середовищі з лимонної і щавлевої кислоти і їх натрієвими солями.
Найбільш активне утворення дендродохіна відзначено при зростанні гриба на середовищі з сахарозою, крохмалем, мальтозою, глюкозою, фруктозою, гліцеріном- при хорошому зростанні міцелію спостерігалося незначне утворення дендродохіна на середовищі з арабінозою, маноза, манітом, сорбітом. Мінімальна концентрація, що затримує ріст Candida stellatoidea 62 при високій активності освіти дендродохіна, коливалася від 0,01 до 0,05 мкг / мл, при низькій - підвищувалася до 1,6-10,5 мкг / мл. Це свідчить про те, що при культивуванні на середовищах із зазначеними джерелами вуглецю в спирторозчинною фракції міститься неактивний компонент.
Хроматографічне дослідження спирторозчинною фракції хлороформного екстракту культуральної рідини з середовищ з різними джерелами вуглецю при використанні етанолу і хлороформу в якості розчинників і біоавтографіческом прояві
на С. stellatoidea 62 показало, що у всіх варіантах дослідів речовина мало Rf в межах 0,85-0,95, т. е. характерне для дендродохіна.
Вивчення динаміки росту міцелію D. toxicum на середовищах з рядом джерел вуглецю, освіти білка (осаждаемого ТХК) і дендродохіна показало, що максимум змісту останнього настає в період різкого зменшення вмісту білка в міцелії, очевидно, в результаті вторинного метаболізму. Сумарний вміст загального та білкового азоту в міцелії і ставлення білкового до загального залежить від віку культури і джерела вуглецевого живлення. Найбільш високе співвідношення білка до загального азоту відзначено в міцелії триденного віку культури. Значно знижується воно в шестиденному віці на середовищі з сахарозою, крохмалем, маноза і в дев`ятиденний - на середовищі з глюкозою.
Таблиця 24
Зростання міцелію і освіту дендродохіна на середовищах з різними джерелами вуглецю в залежності від віку культури D. toxicum
джерело вуглецю | Вік культури, дні | ||||||||
3 | 6 | 9 | |||||||
Вага міцелію, мг | Азот білка, мг на 1 г міцелію | Дендро-дохін, | Вага міцелію, мг | Азот білка, мг на 1 г міцелію | Дендро-дохін, | Вага міцелію, мг | Азот білка, мг на 1 г міцелію | Дендро-дохін, | |
глюкоза | 600 | 95,4 | 800 | 1150 | 49,2 | 3200 | 1500 | 30 | 1000 |
сахароза | 490 | 74,4 | 800 | 1100 | 37,6 | 4000 | 2200 | 17,0 | 2800 |
лактоза | 90 | 84,8 | 20 | 1050 | 38,6 | 400 | 3750 | 31,8 | 200 |
манноза | 470 | 90,6 | 800 | 1150 | 38,8 | 100 | 1540 | 32,8 | 200 |
крохмаль | 770 | 52,4 | 800 | 1300 | 25,6 | 4000 | 2700 | 16,2 | 800 |
Значне зниження білкового азоту в міцелії в перерахунку на 1 г для всіх варіантів досліду спостерігалося в триденному віці і збігалося з максимумом освіти дендродохіна (табл. 24). У той же час максимальне збільшення ваги міцелію відзначено до 9-го дня, а при зростанні на середовищі з лактозою - на 6-й і особливо 8-й день росту. Ці дані дозволяють припустити, що біосинтез дендродохіна пов`язаний з процесами вторинного метаболізму, а збільшення ваги міцелію при значному зниженні вмісту білкового азоту в 1 г міцелію відбувається за рахунок синтезу і небілкових компонентів (рис. 43, 44). Максимум накопичення міцелію, в абсолютному значенні неоднаковий для різних вуглеводів, настає на 6-8-й день, а значне зменшення - на 10-й день росту. Маннит є найбільш придатним для росту в порівнянні як з відповідним цукром (маноза), так і з глюкозой- на середовищі з сорбітом зростання більш інтенсивний, ніж на середовищі з сорбоза.
Рівень автолиза міцелію найнижчий на середовищі з сорбітом. Однак висока антибіотична активність по відношенню до С. stellatoidea і токсичність для тварин відзначені тільки при зростанні на середовищі з глюкозою. 
Мал. 43. Динаміка росту міцелію
Мал. 44. Зміст білкового азоту в міцелії D. toxicum (в мг! Г сухого ваги) в залежності від джерел вуглецю і віку культури (занурене культивування).
Позначення ті ж, що на рис. 43.
D. toxicum і освіти дендродохіна
в залежності від джерел вуглецю
і віку культури (занурене
культивування):
1 - суха вага міцелію в мг / мл-2 - утримання дендродохіна в культуральної рідини-г - глюкоза, з - сахароза, м - манноза, л - лактоза, до - крохмаль.
У всіх інших випадках дослідів антибіотична активність і токсичність були надто низькими (рис. 45, табл. 25).
Таблиця 25
Антибіотична активність дендродохіна в залежності від джерел вуглецю
джерело вуглецю | Мінімальна концентрація, що затримує ріст С. stellatoidea 63 (мкг / мл) | ||||
Вік культури гриба, дні | |||||
3 | 4 | 6 | 8 | 10 | |
глюкоза | 0,06 | 0,07 | 0,1 | 2,5 | 6,2 |
ксилоза | - | 10,0 | 2,5 | - | |
арабиноза | 2,5 | 9,7 | 3,7 | - | - |
манноза | 0,2 | 3,7 | 22,0 | 87,0 | 2,5 |
маннит | 5,0 | 7,0 | 18,7 | - | |
лактоза | 2,5 | 1,0 | - | -------; | |
Рамноза | -; | 20,0 | - | - | _______ |
сорбоза | 5,0 | 10,0 | 2,5 | 30,0 | 25,0 |
сорбіт | 20,0 | 2,5 | - | - | - |
В процесі метаболізму гриба в одних випадках утворюється високоактивний екзотоксин - дендродохін, в інших - малотоксичного метаболіт. Токсінобразованіе у D. toxicum залежить також від використання грибом різних джерел азоту.
Мал. 45. Зростання міцелію D. toxicum на середовищі з різними джерелами вуглецю в
зануреної культурі:
г - глюкоза, м - манноза, мт - маніт, з - сорбоза, cm -сорбіт, до - ксилоза,
а - арабиноза, л - лактоза, р - Рамноза.
Значне підвищення активності освіти дендродохіна при високому рівні зростання міцелію відзначено при зростанні D. toxicum на середовищі з азотнокислим і фосфорнокислим амонієм в порівнянні з ростом на середовищі з нітратних азотом. Підвищення змісту дендродохіна при низькому рівні зростання міцелію спостерігалося при використанні сірчанокислого, виннокислого, роданистого і оцтовокислого амонію. Одночасне інгібування росту міцелію і освіти дендродохіна відзначено при зростанні гриба на середовищі з щавлевокислого, вуглекислим і хлористим амонієм.
Харченко (1966) в дослідах з культивуванням D. toxicum на агарових середовищах, що містять повний або неповний набір амінокислот, встановила, що гриб в процесі свого росту потребує різних амінокислотах. За даними автора, зростання D. toxicum угнетаетсяпрі виключення з середовища аспарагина і в-аланіну, стимулюється при виключенні валина, а3-фенілаланіну, гістидину, норлейціна, цистеїну, тирозину, триптофану і ін. При культивуванні D. toxicum на середовищах з амміачнонітратним азотом відзначаються вищий рівень зростання міцелію і низький рівень споживання цукру (табл. 26).
Таблиця 26
Вплив джерел азоту на ріст міцелію і використання
цукру D. toxicum
джерело азоту | Культура гриба 72 год | Культура гриба 96 год | ||
вага міцелію, мг / мл | споживання цукру,% | вага міцелію, мг / мл | споживання цукру,% | |
KN03 + 1% глюкози | 1,0 | 90 | 1,6 | 92 |
+ 2% » | 4,0 | 69 | 5,8 | 82 |
+ 3% » | 4,3 | 61 | 6,0 | 68 |
NH4N0g + 1% » | 5,8 | 70 | 6,5 | 91 |
+ 2% » | 5,7 | 55 | 7,0 | 72 |
+ з% » | 6,5 | 39 | 7,3 | 57 |
З досліджених амінокислот як джерел азоту та вуглецю хороший зростання D. toxicum спостерігався при використанні валина, норваліна, р-аланіну, а-аланіну, аргініну, серину, глутамінової та аспарагінової кислот і їх амідов- не відзначалося зростання на середовищах з ароматичними і сірковмісними амінокислотами .
Зростання міцелію D. toxicum в різного ступеня спостерігався на середовищах майже з усіма амінокислотами, які окремо додавалися в середу в якості єдиного джерела азоту, і в більшості випадків незначно відрізнявся від зростання на цій же середовищі з нітратних азотом (рис. 46).
Максимальне зростання міцелію спостерігався при використанні глутамінової кислоти, Р-аланіну, Р-феніл-а-аланіну, найбільш низький рівень - при зростанні на середовищі з р-феніл-р-аланином, цистеїном. Найбільш активне утворення дендродохіна відзначено при використанні в якості джерел азоту Р-аланіну, глутамінової кислоти, лейцину, лізину, орнітину.
Хроматографією на колонці окису алюмінію виділені чотири речовини, названі умовно Д1, Д2, Д3, Д4: препарати Д1 і Д3 повторної хроматографією і багаторазової перекристаллизацией з бутанола отримані в аналітично чистому вигляді. За значенням Rf (хроматографія в тонкому шарі Селикагель), спектрами в ультрафіолетових і інфрачервоних променях вони представляють собою індивідуальні речовини (Білай, Степанов, Михайлов, Юрченко і Др., 1962, 1966).
Мал. 46. Вплив різних джерел азоту на ріст і антибіотичну активність D. toxicum:
1-калій азотнокислий, 2 - амоній азотнокислий, 3 - амоній фосфорнокислий, 4 - амоній лимонно, 5 - амоній фосфорнокислий однозаміщений, 6 - амоній янтарнокіслий, 7 - амоній щавлевокислий, 8- амоній сірчанокислий, 9 - амоній сірчанокислий, 10 - амоній виннокислий , 11 - амоній хлористий, 12 - амоній вуглекислий, 13 - амоній роданистий, 14 - калій азотнокислий, 15- глутамінова кислота, 16 - в-аланін, 17 - в-феніл-в-аланін, 18- гистидин, 19- валін, 20 -аргінін солянокислий, 21 - лейцин, 22 - серин, 23 - аспарагінова кислота, 24 - а-аланін, 25 - орнітин, 26 - аспарагін, 27 - норвалін, 28 - гліцин, 29 - ЕФЕН-а-аланін, 30 - цистеїн (міцелій у відсотках зростання на середовищі з азотнокислим каліем- заштриховані ділянки - антибіотична активність в одиницях, незаштриховані - вага міцелію).
Дендродохін I - це кристалічна речовина, що розкладається без плавлення при температурі вище 300 ° С. Розчинний в хлороформі, бензолі, спирті, погано розчинний у воді, не розчинний в петролейном ефірі, питоме обертання + 187 ° (в СНС13) - спиртовий розчин має максимум поглинання в ультрафіолетових променях 280 ммк (4,15-4,20 од.) - молекулярна вага 330-350, формула С18Н2406. Містить одну гідроксильну групу, три активних атома вуглецю, дві метальних групи, одну подвійну зв`язок, пов`язану КАРБОНІЛИ, що входять в б-лактонное кільце. Дегідропроізводное дендродохіна I-дегідродендродохін - біла кристалічна речовина з температурою плавлення 223-225 ° С, питоме обертання [а] + 56 ° (в СНС13).
Дендродохін III -біле кристалічна речовина, розкладається без плавлення при температурі вище 300 ° С, питоме обертання + 43 ° (в СНС13), максимуми поглинання в ультрафіолетових променях 220 і 260 ммк, молекулярна вага 360, формула С20Н24О6. Інфрачервоні спектри Д3 і Д1 і їх дегідропроізводних близькі, що дозволяє вважати подібним будова цих компонентів дендродохіна.
Дендродохін II - біла кристалічна речовина з температурою плавлення 271 ° С (розкладання), максимум поглинання в ультрафіолетових променях 262 ммк (3,91 од.), Формула C14H2105, молекулярна вага 269.
Компоненти дендродохіна значно відрізняються біологічною активністю (табл. 27). Найбільшою токсичністю по відношенню до С. stellatoidea 63 і токсичністю для білих мишей має Д3, потім Д1 і значно нижчою - Д2. Відзначено розходження в фармакологічній дії цих компонентів на кров`яний тиск, судини вуха кролика і ізольоване серце жаби (табл. 28). Дендродохін I в концентрації 0,1-0,5 мкг / мл викликає зниження кров`яного тиску і розширення кровоносних судин, в той час як дендродохін III в таких же концентраціях пригнічує серцеву діяльність (Харченко, 1966).
Таблиця 27
Порівняльна токсичність дендродохінов
Мінімальна концентрація, що затримує ріст Candida stelatoidea 63, мкг / мл | Токсичність для білих мишей, мг / кг | ||
МЛД | ЛД50 | ЛД100 | |
Д1 0,002 | 5,0 | 5,7 | 6,5 |
Д2 0,01 | 6,8 | 7,2 | 8,7 |
Д3 0,0002 | 1,9 | 2,5 | 3,3 |
За даними Петровського і Платоновой-Петровської (1949), токсин D. toxicum викликає в залежності від концентрації більш-менш виражену дію на органи кровообігу. При внутрішньовенному введенні собакам 1% спиртової, водної або ефірної витяжки з культури гриба в фізіологічному розчині різко знижувався кров`яний тиск. У більш низької концентрації токсин гриба викликав зміна діяльності ізольованого серця лягушкі- спочатку відзначалася тахікардія при нормальній амплітуді, яка змінювалася аритмією. Ще більш низькі концентрації токсину викликали спочатку незначне звуження, а потім стійке розширення кровоносних судин. Автори відзначають, що спостерігається під впливом токсину зниження кров`яного тиску обумовлено розширенням периферичних кровоносних судин.
Таблиця 28 Фармакологічна дія дендродохінов
* Метод Кравского - Писемського. ** Метод Миколаєва.
Вивчено вплив дендродохіна на деякі метаболічні процеси. Так, в гострих дослідах встановлено значну зміну змісту фосфорних сполук в тканинах органів морських свинок (табл. 29). Значно збільшується вміст неорганічного фосфору, зменшується вміст загального, Кислоторозчинні, органічного і особливо фосфору АТФ і АДФ. Значно знижується загальна дегідрогеназну активність і активність сукцін- і ізоцітріко-, лактіко- і глутамікодегідрогеназ в м`язах, нирках, печінці та головному мозку кроликів при одноразовому введенні дендродохіна в дозах ЛД1оо, ЛД50, МЛД. Відновлення активності при введенні МЛД відбувалося в тканинах м`язів, нирок, печінки на 4-5-е добу, а загальна відновна активність ферментів мозку залишалася в ці терміни спостереження зниженою в порівнянні з нормою. Встановлено вплив дендродохіна на вміст білкових і небілкових сульфгідрильних груп в крові і органах кроликів при одноразовому введенні МЛД і в хронічному досліді. Значно знижується кількість небілкових SH-груп в сироватці в крові, нирках, еритроцитах, легенів, печінки, селезінці в гострому і хронічному дослідах і збільшується відразу після введення МЛД, досягаючи норми на треті добу-в хронічному досліді їх зміст підвищується до кінця другого тижня, а потім дещо знижується.
Таблиця 29
Вплив дендродохіна на вміст фосфору в тканинах морських свинок (гострий досвід)
тканини | Загальний фосфор | Кислоторозчинні | неорганічному | органічний | фосфор | ||
креатин | АТФ | АДФ | |||||
м`язи | - 18 | -6 | +25 | -15 | -18 | -23 | -23 |
печінка | - 10 | -5 | 4-24 | - 14 | - 15 | -20 | -20 |
мозок | -6 | -5 | +23 | - І | - 12 | -15 | -5 |
Примітка: - кількісне зменшення, + збільшення.
Дендродохін в значній мірі пригнічує поглинання кисню гомогенату печінки, легенів щурів трохи знижує поглинання кисню гомогенату мозку, м`язів, нирок. Одночасно з цим відмічено підвищення гликолитической активності під впливом дендродохіна (рис. 47, 48). Дендродохін в дослідах in vitro знижує активність глюкозо-6-фосфатази в печінці, що викликає в гомогенатах печінки зниження вмісту глюкози, глюкозо-6-фосфату, фруктозо-6-фосфату, фруктозо-6-дифосфата і підвищення концентрації глюкозо-1-фосфату і неорганічного фосфору. Дендродохін значно підвищує активність альдолази і глюкофосфатізомерази, майже не впливає на активність лактікодегідрази (рис. 49). Таким чином, дендродохін, мабуть, порушує функцію печінки, пов`язану з регулюванням вмісту цукру в крові - пригнічує процеси перетворення глюкозо-1-фосфату і звільнення глюкози (Савченко, 1969а, 19696).
Мал. 47. Вплив дендродохіна на поглинання кисню гомогенату органів щурів:
а - печінку, б - легкі, в - могз, г - нирки, д - м`язи (/ - контроль, 2 - досвід).
Мал. 48. Вплив дендродохіна на гліколітичну активність гомогенатов органів щурів:
1 -контроль, 2 - концентрація 450 мкг. Інші позначення ті ж, що і на рис. 47.
Мал. 49. Вплив дендродохіна на активність ферментів гліколізу в гомогена-
тах печінки щурів (на сирої тканини)
Фітотоксичної властивості дендродохіна. При нанесенні екстрактів з культури D. toxicum на стебло або листову пластинку квасолі, соняшнику (за наявності двох - чотирьох справжніх листків) або вівса через 48 год відмічено утворення чітко окреслених, безбарвних некротичних плям, потім скручування, ссиханіі тканини, а також відставання в рості проростков- на стеблинках виникали чіткі бурі, увігнуті, довго не гояться плями, що нагадують опіки. При мікроскопії зрізів ураженої тканини виявлені сплющені клітини з рясними зернистими включеннями на межі зі здоровою тканиною. Аналогічну дію виявлялося при нанесенні екстрактів на бульбу картоплі, корінь моркви, зелений плід помідора, при цьому найбільш пізно реакція виникала на бульбі картоплі (через 10-15 днів). Встановлено, що D. toxicum різному впливає на листову тканину різних видів вегетуючих рослин. Чутливими були листя вівса, пшениці, молоде листя берези (утворювалися безбарвні розпливчасті плями на 3-5-й день) - на листі вишні, клена американського, дикого винограду, подорожника також на 3-5-й день з`являлися чітко окреслені обідком опробковілими клітин наскрізні некротичні безбарвні або бурі плями. Стійкими до токсину були клітини листя півонії, троянди, слабочувствітельнимі - листя бузку, жоржини. Можна припустити, що чутливість рослинних клітин до токсину D. toxicum залежить як від віку та інших особливостей рослин, так і від можливої наявності інактиваторів токсину в клітинах (Білай, 1948).
Таблиця 30
Вплив дендродохіна на схожість насіння та ріст проростків
(Розведення СРФ 1: 100)
рослина | Схожість,% | Довжина корінців, см | Довжина проростків, см | ||||||
До | про | У% | До | про | У% | До | про | У% | |
Озима пшениця | 99 | 98 | -1 | 4,1 | 1,6 | -61 | 2,2 | 0,4 | 82 |
Ярова » | 96 | 78 | -16 | 4,1 | 1,5 | -64 | 2,2 | 0,3 | 87 |
Ячмінь | 83 | 0 | - 100 | 3,6 | 0,6 | -84 | 1,5 | 0,0 | 100 |
Овес | 83 | 0 | -100 | 4,3 | 0,2 | -96 | 0,8 | 0,0 | 100 |
Кукурудза | 96 | 96 | -0 | 3,8 | 2,4 | -37 | 1,0 | 0,8 | 20 |
льон | 87 | 86 | -1 | 3,2 | 1,2 | -63 | 1,0 | 0,4 | 60 |
Клевер | 95 | 51 | -44 | 1,5 | 0,6 | -60 | 1,7 | 0,2 | 88 |
Люпин | 80 | 0 | - 100 | 2,9 | 0,8 | -73 | 0,4 | 0 | 100 |
квасоля | 76 | 0 | - 100 | 2,8 | 0,8 | -73 | 1,1 | 0 | 100 |
горох | 97 | 71 | -26 | 3,2 | 2,3 | -30 | 0,3 | 0 | 100 |
огірок | 85 | 87 | +2 | 4,4 | 1,0 | -77 | 0,9 | 0,3 | 67 |
бавовник | 73 | 50 | -23 | 4,3 | 0,8 | -82 | 0,8 | 0,4 | 50 |
Примітка: К - контроль, О - досвід, (+) - збільшення, (-) - зменшення.
Дендродохін у високій концентрації надає остротоксіческое дію на схожість і ріст проростків різних рослин (табл. 30). Інгібуючий вплив токсину проявлялося при одноразової замочки насіння або багаторазовому поливі проростків розчином Кноппа з більш низькими концентраціями дендродохіна. При утриманні дендродохіна 250 мкг / мл розчину ингибиция всхоже-
сти гороху становила 80, квасолі - 35, сої - 20% - при концентрації 100 мкг / мл ингибиция схожості пшениці дорівнювала 40, вівса - 25%. Фітотоксичної дію дендродохіна значно сильніше, ніж стахіботріотоксіна і спорофузаріотоксіна (рис. 50).
Дендродохін викликав зміну в змісті вуглеводів і азотистих з`єднань в восьмиденних проростках рослин.
Мал. 50. Зміна змісту вуглеводів і азотистих речовин в проростках рослин під впливом дендродохіна (100 мкг неочищеного препарату на 1 мл розчину Кнопа):
1 - загальний азот, 2 - білковий азот, 3 - сума цукрів, 4 - сахароза, 5 - моносахара- перші стовпчики зліва - контроль, другі -
досвід.
Антибіотичні властивості дендродохіна. Неочищені і кристалічні (аналітично індивідуальні) препарати дендродохіна мають виражений інгібуючу дію на міцеліальні гриби і дріжджі. Так, неочищені спиртові розчини дендродохіна затримували ріст грампозитивних і грамнегативних бактерій в концентрації 0,62- 10 мг / мл: St. aureus- 1,1, В. subtilis - 0,66, В. mucoidеs- 1,6,
В. proteus - 2,5, X. malvacearum-10, Ps. fluorescens - 1, Ps. tumifaciens - 10 мг / мл. Зростання міцеліальних сапрофітних і фітопатогенних грибів затримувався в концентрації 5-1000 мкг / мл. Botrytis сепегеа - 5, Rhizoctinia solani - 10 різних видів Fusarium - 14- 250, видів Penicillium - 20-1000, Aspergillus, Alternaria, Trichoderma і інших - 200-1000 мкг / мл. При цьому на більш стійких до дендродохіну грибах проявлялося переважно фунгістатичну дію, а на чутливих - і фунгіцидну. Значно більш чутливими виявилися патогенні гриби: зростання Trichophyton gipseum затримувався при концентрації 40-200- Tr. crateriforme-14-25- Epidermophyton KW - 20-200- Е. rubrum- 15-60- Microsporum lanosum - 16-30- Achoroin gypseum - 14 - 60 мкг / мл.
Високу чутливість до дендрохіну виявляють багато видів дріжджів. Зростання Candida albicans і С. mycotorulloides затримувався при концентрації токсину від 10 до 100 мкг / мл, Rhodotorulaaurantiacum, Zygosaccharomyces sp. при концентрації 5-100 та 20- 100 мкг / мл відповідно. Подальше вдосконалення методів культивування дозволило отримувати неочищені і індивідуальні препарати дендродохінов, вищою протівогрібной активності, які затримували ріст С. stellatoidea в концентрації 0,02-0,0001 мкг / мл і більше.
Таблиця 31
Порівняльна чутливість до дендродохінам різних видів дріжджів
