Аспергіллотоксікози - токсінобразующіе мікроскопічні гриби

Aspergillus Mich. - Аспергилл аспергіллотоксікози (aspergillotoxicoses)
Аспергіллотоксікози людини і сільськогосподарських тварин широко поширені в багатьох країнах світу. Численні повідомлення про виникнення Ензоотія аспергіллотоксікозов в США, Франції, Англії, Польщі, Норвегії, Італії, Індії, Аргентині, Новій Зеландії та інших країнах світу. Аспергіллотоксікози відзначені в СРСР.
Обсемененность кормів і промислової сировини аспергиллами - А. fumigatus, А. flavus, А. niger, А. clavatus и др викликає захворювання людей аспергіллозом і аспергіллотоксікозом. Частіше хворіють працівники лабораторій, елеваторів і складів, солодовщікі пивоварних, спиртових та інших заводів, працівники тваринницьких ферм і т.д. Багато видів Аспергилл описані як збудники бронхо-і дермомікозов людини і тварин. В останні роки аспергіллози відзначаються як вторинні інфекції після антибіотикотерапії (Austwick, 1965).
Токсичність і патогенність деяких видів аспергиллов, що вражають корми і продукти, вивчені недостатньо, тому взаємозв`язок токсінобразованія і паразитування в тваринному організмі не ясна. Відомо, що зазвичай аспергіллози виникають при ослабленні тканин і організму під впливом інших факторів. Можна думати, що утворення токсичних метаболітів має певне значення в розвитку аспергіллозов. До числа найбільш вивчених в останні роки відноситься аспергіллофлавотоксікоз (афлатоксікоз). Численні дані вітчизняних і зарубіжних авторів свідчать про те, що A. flavus є одним з переважаючих видів грибів, що вражають зерно-фураж, комбікорми та інші види концентратів (ураження цих субстратів досягає 40-100%).
Оустуік (Austwick, 1965) класифікує захворювання тепло- і холоднокровних тварин, що викликаються видами Аспергилл, на три групи:

1. Мікози (аспергіллози). Характеризуються ураженням живих тканин різних органів шляхом: а) первинної інфекції - проникнення збудника (гриба) в клітини тканини здорового, чутливого органу-б) вторинної інфекції - впровадження гриба в тканини, уражені туберкульозом, гістоплазмоз, карциномою і т. Д., Після поранень , ускладнень після антибіотико-і кортикостероїдної терапії або в тканини, ослаблені впливом інших факторів.
2. Алергія. Виникає від інгаляції конідій або від інших контактів з грибом. Виявляється у вигляді сінної лихоманки, кон`юнктивітів, дерматитів, іноді бронхіальної астми.
3. Аспергіллотоксікози. Виникають після впливу токсичних метаболітів, утворених в продуктах чи кормах, уражених грибом.

Мікози та алергія відносяться до захворювань, які виникають, головним чином, респіраторним шляхом, мікотоксикозів - до захворювань, які виникають головним чином аліментарним шляхом.

Aspergillus flavus Link - аспергилл жовтий

Аспергіллофлавотоксікоз, афлатоксікоз (Aspergilloflavotoxicosis,
aflatoxicosis)

Викликає захворювання молодняку птиці, а також інших тварин.
Токсичність гриба для тварин вперше встановлена Шило (1940). Вивчаючи дію Aspergillus на організм кроликів і пацюків, автор показав, що витяжки з кормів, заражених грибом (30-денні культури), як і з культури гриба, вирощеної на середовищі Ролена, мають токсичну дію. При введенні тваринам результат був летальним залежно від дози і термінів введенія- при пероральному введенні дози, вдвічі більшою, ніж при внутрибрюшинном, спостерігалося виражене токсичну дію, але без летального результату. Автором відзначено неоднакова токсичність витяжок з корми, зараженого А. flavus, і з культури гриба.
Левитський і Конюкова також відзначали токсичність штамів A. flavus (1947). Кулик (1957) встановив токсичну дію гриба і ураженого їм харчового гороху. Автор показав, що отруйними властивостями володіють вільні і пов`язані ліпіди гороху, зараженого грибом. Вони діють на кон`юнктиву ока кролика- при пероральному введенні кішці виникали блювота, пронос, різкий лейкоцітоз- летальна доза вільних ліпідів становила 9-11 пов`язаних - 8-9 г / кг. Фракція жирних кислот більш токсична, летальна доза 4,5-5 г / кг при введенні тваринам менших доз відзначалися ознаки вираженого отруєння.

Встановлено токсичність окремих штамів A. flavus, виділених із запліснявілого корму, який викликав захворювання свиней в США (Burnside і ін., 1957- Forgacs, Carll, 1962).
Подальше дослідження токсичних властивостей А. flavus пов`язано з вивченням захворювання молодняку птиці (індичат). У 1960 р на птахофермах в Англії загинуло близько 100 000 індичат. У полеглих тварин виявлені гострі гепатіческіх некрози, пов`язані з проліферацією клітин епітелію жовчних проток. Спочатку були висловлені припущення про токсичну дію алкалоїдів крестовника. Потім з`ясувалося, що захворювання каченят і індичат викликалося скармливанием арахісової муки, імпортованої з Бразилії. При годуванні протягом декількох тижнів молодих самців і самок щурів їжею, що містить 20% токсичної арахісової муки, у тварин виникали затримка росту, зниження засвоюваності їжі, а при більш тривалому годуванні - сильні ураження печінки. При патологоанатомічному дослідженні щурів, убитих через 9 тижнів після такої дієти, відзначено, що печінка зморщена, з численними субкапсул яр ними жовтими фокусними пораженіямі- у щурів, убитих через 30 тижнів, печінка ненормально збільшена (за вагою в два рази більше, ніж у контрольних тварин), коричнево-жовтого кольору, з неправильною вузлуватої поверхнею, з червоними, зеленими цистами і численними жовтуватими фокусними ураженнями. Після шести місяців годування у 9 з 11 щурів виявлені численні пухлини печінки, у двох - з метастазами в легенях. Таким чином, встановлено, що токсична арахісова мука при тривалому годуванні Карциногенний для щурів (Sargeant і ін., 1961).
З екстрактів токсичної борошна отримано кристалічна речовина, яка при пероральному введенні в дозі 20 мкг викликало загибель одноденних каченят через 24 ч. При хроматографії на папері в п-бутанолі і 5% -ний оцтової кислоти воно дає одну пляму з Rf 0,7 і блакитну флуоресценцию в ультрафіолетових променях. Хлороформний екстракт з культуральної рідини A. flavus на середовищі Чапека або при зростанні на нетоксичному стерильному горосі при хроматографії на папері утворював аналогічне пляма. Отриману речовину також мало токсичними властивостями, воно було названо афлатоксином.
Несбітт і співробітники (Nesbitt і ін., 1962) провели подальшу очистку афлатоксина. При хроматографії на колонці алюмінію в хлороформ-метанол (98,5: 1,5) отримано два плями в ультрафіолетових променях. Одне з них з Rf 0,6 і фіолетово-блакитний флуоресценції названо афлатоксином В- Друге, що має більш низьку величину Rf і зелену флуоресценцію, названо афлатоксином G.
Токсичні метаболіти отримували при зараженні грибом стерильного зерна гороху і культивуванні його на середовищі Чапека - Докса з додаванням ZnS04. Через 5-7 днів після зараження токсини екстрагувати гарячим метанолом, концентровані екстракти розлучалися водою, а потім знежирюють 40-60 ° -ним петролейним ефіром. Після видалення метанолу токсин повторно екстрагували хлороформом. Хлороформний розчин пропускали через колонку сілікагеля- флуоресціююча в ультрафіолетових променях фракція насухо випаровувалася, і залишок перекрісталлізовивают з бензолу або метанолу. З культуральної рідини кристалічний токсин отримували прямий екстракцією хлороформом і наступною хроматографією на силікагелі.
Суміш токсинів містилася в апарат противоточного поділу в систему хлороформ - чотирихлористий вуглець - вода - метанол (2: 2,5: 1: 3). Температура плавлення афлатоксину В (з розкладанням) становить близько 270 ° С, молекулярний вагу 312-314, елементарний склад С17Н1206. Спектри поглинання в ультрафіолетових променях - максимум 223, 265, 363 ммк, в інфрачервоних променях - 1755 і 1688 см-1. Оптичне обертання розчину афлатоксину в хлороформі = -562 ± 15 / с = 0,115. ЛД50 для одноденних каченят - менше 20 мкг.
Афлатоксин Q1 в кристалічному вигляді отриманий при повторній кристалізації. Температура плавлення 247-250 ° С, молекулярний вагу 326-328, елементарний склад С17Н1207, максимум поглинання в ультрафіолетових променях при 265,363 ммк, в інфрачервоних лу-
чах - 1125-1140 см-3 [се] = - 533 ± 5 (з = 0,133). ЛД50 для
одноденних каченят становить близько 60 мкг.
Ченг і ін. (Chang і ін., 1963) встановили наявність другого токсичної речовини - афлатоксина В2, також дає блакитну флуоресценцію в ультрафіолетових променях, але може похвалитися меншою токсичністю. При культивуванні афлатоксінобразующего штаму А. flavus на стерилизованном зерні пшениці вихід афлатоксина В2 відносно не великий. Автори вважають, що В2 є дигідро-афлатоксином В1 з температурою плавлення 286-289 ° С (розкладання) - максимум поглинання в ультрафіолетовому спектрі - 222, 265, 362 ммк, в інфрачервоних променях - 1760, 1 685, одна тисячі шістсот двадцять п`ять, 1600 см-1.
Карнаген, Хартлі і Окелло (Carnaghan, Hartley, Okeolly, 1963) провели порівняльне вивчення токсичності, флуоресценції та інших властивостей афлатоксинов B1, В2, G1, G2. ЛД50 афлатоксинов для одноденних каченят: В1 - 18,2, В2 - 84,8, G1 - 39 і G2- 172,5 мкг, т. Е. Відновлення ізольованою подвійного зв`язку в кінцевому дігідрофурановом кільці афлатоксинов В1 і G1 з утворенням В1 і G2 знижує їх токсичність дещо, ніж в чотири рази (В2 - в 4,66 рази в порівнянні з В1, G2 - в 4,4 рази в порівнянні з G1).
Хімічна природа і будова афлатоксинов В1 і G1 вивчені
Acao (Asao і ін., 1963, 1965) і іншими авторами (Zijden і ін., 1962- Chang і ін., 1963- Cheung, Sim, 1964). Ці сполуки є похідними дігідрофурана (рис. 18). Компоненти В2 і G2 є гідропроізводние відповідно афлатоксинов В1 і G1 за подвійним зв`язком в кінцевому дігідрофурановом кільці.

Мал. 18. Будова і токсичність різних афлатоксинов.

У багатьох наступних досліджень вивчалося токсінообразованіе штамів A. flavus різного походження. Девіс і співробітники (Davis, Diener, Eldridge, 1966) показали, що активність освіти афлатоксинов і окремих його компонентів у різних штамів не однакова (табл. 10). У дослідах авторів гриби культивувалися на середовищі з сахарозою (20%) і дріжджовим екстрактом (2%) в стаціонарній культурі. Протягом 6-8 днів токсин екстрагували з культуральної рідини хлороформом і хроматографіровался на тонкому шарі силікагелю (розчинник - 2,5% -ний розчин метанолу в хлороформі). Активність визначалася візуально за інтенсивністю флуоресценції в ультрафіолетових променях в порівнянні зі стандартною калібрувальної. Показано, що штами, виділені не тільки з арахісу, але з кукурудзи, зерна інших злаків і кормів, при культивуванні на горосі і синтетичному середовищі мають різну активність освіти афлатоксинов. Відзначено рясний ріст гриба і активне утворення афлатоксинів (від 10-100 мкг / мл) на вуглеводної середовищі з органічним джерелом азоту.
Культури інших видів аспергиллов, виділених з арахісу (A. amstelodani, A. chevalieri, A. ruber, A. terreus, А. restrictus,
A. candidum, A. microviridocitreus), а також Penicillium citrinum виявилися практично нетоксичними для каченят. При згодовуванні їм протягом трьох тижнів сухого знежиреного залишку фільтрату істотної втрати у вазі не відзначалося, в той же час при згодовуванні такого ж препарату з фільтрату А. flavus тварини значно втрачали у вазі і гинули на четвертий - сьомий день. При дослідженні виявилися характерні патологоанатомічні зміни органів.
Таблиця 10 Освіта афлатоксинов різними штамами A. flavus

Таким чином, наведені дані показують, що афлатоксини є одними з характерних метаболітів A. flavus.
Шотуелл і ін. (Shotwell і ін., 1966) вивчали освіту афлатоксинов активним штамом A. flavus при його культивуванні на стерильному зерні рису. Після екстракції хлороформом зараженого зерна неочищені препарати афлатоксина облягали гексаном, хроматографією на колонці силікагелю, очищені компоненти - хроматографією на тонкому шарі силікагелю. Досліджуваний авторами штам A. flavus утворював переважно афлатоксин В1, максимальна кількість якого зазначалося на п`ятий день зростання гриба і залишалося на високому рівні до 12-денного віку. Максимальний вміст афлатоксину G1 відзначено тільки на четвертий-п`ятий день культивування гриба (табл. 11). Вихід неочищеного токсину в восьми ферментації (в міліграмах на грам субстрату) становив: 1,0- 0,16- 0,8- 1,11- 1,1- 0,74- 1,19- 0,88. Співвідношення компонентів В1, В2, G1, G2 дорівнювало 1,0: 0,15: 0,22: 0,02, т. Е. В середньому вихід неочищеного токсину становив 1 мг на 1 г зерна з переважним утворенням афлатоксина В1.
Шредер (Schroeder, 1966) показав, що кукурудзяний екстракт стимулює ріст міцелію і освіту афлатоксинов A. flavus (рис. 19). Сумарне освіту афлатоксинов на середовищі Чапека збільшувалася пропорційно підвищенню концентрації кукурудзяного екстракту: максимум токсінобразованія збігався з максимумом зростання міцелію гриба, але потім зниження вмісту токсину наступало швидше, ніж лізис міцелію.
Таблиця 11
Освіта афлатоксинов Aspergillus flavus при культивуванні на зерні рису

Крог і ін. (Krogh і ін., 1966) досліджували освіту афлатоксинов у восьми штамів Л. flavus, виділених з грубих і концентрованих кормів, які викликали б у Данії мікотоксікозоподобние захворювання різних сільськогосподарських тварин (корів, телят, свиней, коней).

Мал. 19. Вплив тривалості культивування (а) і концентрації кукурудзяного екстракту (б) на активність утворення афлатоксинів
Aspergillus flavus на середовищі Чапека.
Автори показали, що вивчені штами A. flavus при культивуванні на зерні жита і ячменю утворюють комплекс афлатоксіноподобних речовин, більш-менш чітко ви
є хроматографически, по майже не дають позитивного токсичного ефекту в дослідах з каченятами.
З восьми вивчених штамів тільки три володіли токсичністю, менш вираженою в порівнянні з еталонним, що створює афлатоксин штамом британського походження. Чи не встановлена залежність між антибиотическими і токсичними властивостями досліджених культур.

Таблиця 12
Освіта афлатоксинов і Коев кислоти штамами різних видів Aspergillus і Penicllliutn

При порівняльному аналізі освіти афлатоксина і Коев кислоти різними штамами видів Аспергилл і Пеницилл Перріш і ін. (Parrish і ін., 1966) також знайшли, що освіта афлатоксина характерно головним чином для культур A. flavus, A. parasiticus, в той час як Коев кислота виявлена у всіх вивчалися штамів A. flavus (92 з 93), а також у деяких штамів інших видів аспергилл і Пеницилл (табл. 12). Гриби культивувалися на глюкозо-амміачнонітратной середовищі з мікроелементамі- поділ Коев кислоти і афлатоксинов в хлороформних екстрактах вироблялося хроматографією на силікагелі в системі розчинників бензол-оцтова кислота - вода (3: 1: 1).
Ниреді і Бондар (Nyirody, Bondar, 1966) при вивченні мікрофлори понад 300 зразків кормів встановили, що 118 з них вражені A. flavus. При культивуванні виділених культур у 64 штамів відзначено активне утворення афлатоксина.
Ребі і Смелі (Rabie, Smalley, 1965) встановили, що оптимальна температура для росту A. flavus (в їх дослідах 18 ° С) не збігається з оптимальною температурою для освіти афлатоксинов (24 ° С).

Шайндлер і ін. (Shindler, Palmer, Eisenberg, 1967) вивчали вплив температури (від 2 до 52 ° С) на ріст і утворення афлатоксина В2 двома ізолятів А. flavus. Максимальне зростання міцелію на п`ятий день відзначений при 29 і 35 ° С, максимум освіти афлатоксина - при 24 ° С не спостерігалося (в цей же термін) освіти афлатоксина при температурі нижче 18 ° і вище 35 ° С. Не відмічено протягом 12 тижнів афлатоксина у ізолятів A. flavus, що ростуть при температурі 2,7 і 41 ° С обидва ізоляту, що ростуть при 13 ° С, утворювали афлатоксин через три тижні. Автори виявили різне забарвлення хлороформних екстрактів культуральної рідини ізолятів, що ростуть при неоднаковою температурі, і її зв`язок з активністю освіти афлатоксинов. Залежно від штаму і температури культивування співвідношення між освітою окремих компонентів афлатоксинов В1 і G1 змінюється.
Аугустінавічюс (1965-1967) встановив токсичність 16 штамів А. flavus, виділених з кормів в Литовської РСР, а також з грунту, зерна хлібних злаків в різних географічних зонах СРСР. При проведенні шкірної проби і на найпростіших найбільша токсичність проявляється при культивуванні гриба на стерильному горосі, середовищі Чапека - Докса з сульфатом цинку. Речовини, елюіровать з зон ефірних, хлороформних і інших екстрактів, що дають синьо-блакитну флуоресценцію з Rf 0,5-0,7, володіли токсичним і дермонекротіческім дією. Штами A. flavus викликають також характерні патологоанатомічні зміни органів, в першу чергу легенях та печінці. Залежно від властивостей штаму захворювання проявляється з більш вираженими ознаками флавоаспергіллоза або аспергіллофлавотоксікоза.
Японські автори вивчали освіту афлатоксина у 214 штамів Aspergillus різного походження і тривалості культивування. Наявність токсину визначалося по флуоресценції щільною середовища (зворотного боку колонії гриба), флуорометр і тонкошарової хроматографії в гелі екстрактів культуральної рідини. Відзначено наявність багатьох інших речовин, ідентичних афлатоксину, і кілька одиночних штамів, що утворюють афлатоксин (Muracami, Takase, Ishii, 1967).
Як уже згадувалося, одним з найбільш важливих біологічних властивостей афлатоксинов є Карциногенний дію, що виявляється при низькій дозі токсину в хронічних дослідах (Lancaster, Genkins, Philp, 1961). У щурів через 30 тижнів після змісту на дієті з 20% арахісу, зараженого A. flavus, печінку важила вдвічі більше, ніж в нормі, мала коричнево-жовту неправильну, вузлувату поверхню, червоні і зелені цисти і численні жовтуваті фокусні ураження. Вузлики пухлини печінки представляли собою щільні жовтуваті гепатоми часточок, наповнені кров`ю і жовчю цісти- жовті фокусовані поразки відзначалися і в більш ранній термін. Клубочки на оболонці нирок наповнені гомогенної еозинофільної массой- горбки складаються з подовжених клітин з великими вазікулярнимі ядрами і щедрою вакуолизированной протоплазми. У деяких тварин на зрізах легенів виявлені інфільтрації з анапластичної гематомою клітин, мітози і інші зміни. Наявність пухлин в печінці при відсутності цирозів, некрозів клітин або клітинної інфільтрації дозволило вважати, що токсин діє безпосередньо на клітини.
Карнаган (Carnaghan, 1965) вивчав Карциногенний вплив корму, зараженого A. flavus, на каченят, які найбільш чутливі до Афлатоксини. У дослідах досліджувалися семиденні каченята, що містяться на нормальній дієті з додаванням 0,5% токсичної арахісової муки (близько 7 мкг афлатоксина В1). Через 14 місяців після початку згодовування у 8 з 11 птахів були виявлені пухлини печінки.
Під впливом афлатоксинов В1 і G1 у білих мишей розвиваються первинні пухлини не тільки в печінці, але і в мезентерій, шлунку, легенів, порожнини рота і слинних залозах, які морфологічно визначаються як саркоми і фібросаркоми. Утворені під впливом афлатоксинов пухлини приживалися при перевивку іншим тваринам (Barnes, Butler, 1964- Newborne, Carlton, Wogan, 1964).
Освіта гепатит у форелі відзначено при згодовуванні їй протягом 6-7 місяців неочищених препаратів афлатоксина, отриманих з зерна пшениці, зараженого А. flavus. При введенні в дієту чистого афлатоксина В1 або G2 через 10-15 днів виникав гострий токсикоз з летальним результатом (Ashley, Halver, Wogan, 1964- Ashley і ін., 1965). Молоді лососі були в 10 разів стійкіше. Багато видів риб переносять високі дози афлатоксину в кормі (Halver, 1965).
Карцинома підшлункової залози виникала у щурів, що містяться на дієті з афлатоксином (Barnes, Butler, 1964). Ряд авторів вказує, що при інтрамуральної ін`єкції щурам Карциногенний поліциклічних вуглеводнів виникають незначні ураження карциномою, але при пероральному введенні цих речовин результат був негативний. При введенні через рот інших Карциногенний речовин (N, N, 1, 2,7-флуореніл-біс-ацетаміду, N-нитрозо-1М-метілуретана) відзначені випадки аденокарциноми шлунка у щурів.
У дослідах з щурами п`ятитижневого віку через 66-76 тижнів після початку годування токсичної арахісової борошном в двох випадках автори спостерігали виникнення типової аденокарциноми шлунка-в одному випадку відзначені розрослися метастази, гістологічно ідентичні аденокарциноме. У наступних дослідах шість самців щурів у віці одного року отримували токсичну арахісову муку з 3-4 мкг токсину (50% дієти). У трьох з п`яти піддослідних тварин, які прожили понад 39 тижнів, виявлена анапластична гепатоцеллюлярная карцінома- у одного з цих тварин згодом утворилася аденокарцинома прямої кишки, у іншого - аденокарцинома шлунку. У дослідах з молодими щурами, які отримували протягом трьох тижнів дієту з токсичним кормом, а потім нормальну, у одного з шести тварин через 106 тижнів після змісту на звичайній дієті діагностована карциному-саркома шлунка.
Таким чином, афлатоксини представляють інтерес для вивчення і, мабуть, мають етіологічне значення при виникненні карцином печінки у людини в географічних районах, де можливе тривале вживання слаботоксіческіх продуктів з арахісу.
Проведено вивчення токсичності та карциногенності афлатоксинов на качат з метою встановлення дози, яка, не викликаючи загибелі тварин в експерименті, дозволяла б відтворювати характерні патологічні ознаки (Wogan, 1965). Патогистологическим аналізом показано, що ступінь гіперплазії епітелію жовчних проток, ураження клітин паренхіми печінки і приріст ваги тварини залежать від дози токсину.
Випробувані дози 2-31,25 мкг афлатоксина В1 на одного каченяти, що вводяться перорально протягом п`яти днів-на сьомий день птахів забивали і вироблялося розтин. Згідно з даними дослідів, добова доза 1,56 мкг на тварину викликає депресію зростання і атрофію печінки каченят, але все застосовувалися дози в різного ступеня викликали проліферацію клітин епітелію жовчних проток, яка тим більше, чим сильніше загальне ураження печінки (т. Е. Що стоїть доза). Найбільш чіткі зміни в метаболізмі глюкози - зменшення вмісту глікогену, збільшення ліпідів - відзначені при дозі афлатоксина В1, що дорівнює 6 мкг на 100 г живої ваги.
Афлатоксин В1 порушує метаболічні функції печінки. При його введенні утятам протягом п`яти днів в дозі 60 мкг / кг значно зменшувався вміст глікогену і вітаміну А, підвищувався вміст ліпідів, ігібіровалось включення глюкози і лейцину в м`язи (Shank, Wogan, 1964- Allcroft, 1965).
Афлатоксин В1 пригнічує багато ферментів клітин печінки і клітинних структур, знижує активність тріптофанпірролази і тірозінтрансамінази у щурів, яким одночасно вводили триптофан і гідрокортизон (Wogan, Friedmann, 1965- Pong, Wogan. Ступінь ингибиции залежить від дози і тривалості дії. Встановлено порушення метаболізму ядерної РНК під впливом афлатоксину В1: при введенні щурам 5 мг / кг (ЛД50) інгібувати включення цитидину на 62-73%, змінювалося ставлення РНК: ДНК в клітинах печінки на 23-28% (Friedmann, Wogan, 1966).
Аналогічні дані про вплив афлатоксину Вх на активність ДНК-полімерази, синтез білка (ДНК), освіту нитчастих форм відзначені у Е. coli (Wragg, Ross, Legator, 1967).
Вже через годину після введення афлатоксину в клітинах печінки мавп і пацюків зазначалося освіту капсул навколо ядер, ингибиция мітозу в клітинах, в гомогенатах печінки під впливом афлатоксину зменшувалася співвідношення РНК і ДНК (Svoboda, 1966- Rogers, Newborne, 1967). У тварин, хворих на цироз печінки, при введенні афлатоксина спостерігається посилене розмноження ціррозних клітин (Lovenstein, Lec, 1966).
Токсична дія афлатоксину на клітини печінки пояснюють його здатністю хімічно зв`язувати ДНК, пригнічувати утворення передавачів (месенджерів), несучих генетичну інформацію для синтезу білка. Зниження синтезу білка в уражених клітинах настає при короткому періоді впливу токсину (через 15 хв), хоча загибелі клітин не спостерігається (Clifford, Rees, Stevens, 1967). З`ясовано інші біологічні властивості афлатоксинов. У низьких концентраціях вони руйнують культивовані клітини нирок теляти (Juhasz, Greczi, 1964), викликають вакуолізацію і руйнування клітин нирок мавп, інгібують включення С14-лейцину в білки препаратів печінки (Smith, 1965), пригнічують мітози диплоїдних і гетероплоідних клітин в культурі тканини легенів ембріона людини, пригнічують ріст клітин і синтез ДНК.
Екстракти з арахісу, зараженого A. flavus, проявляли високу цитотоксичність при введенні в одношарову культуру тканин нирки теленка- через 48 год в уражених клітинах спостерігалося руйнування цитоплазми і ядра при концентрації афлатоксину 0,1 - 0,5 мкг / мл. У зазначених дослідах Гюхаз і Грекзі афлатоксини з токсичного арахісу екстрагувати метанолом, очищалися за допомогою хлороформу та води, потім метанолом і петролейним ефіром, а також хроматографією на папері із застосуванням розчинника з суміші n-бутанолу, оцтової кислоти і води (4: 1: 5 ). У дослідах авторів токсичністю для клітин нирки теляти володіла не містить афлатоксинов петролейного фракція (т. Е. Ліпіди), вона становила 0,1 токсичності метанольной фракції (афлатоксінсодержащей). Елюат плям з Rf вище, ніж у афлатоксинов, також були токсичні. Автори вважають, що крім афлатоксинов в токсичному арахісі є ще й інші цитотоксичні метаболіти.
Встановлено чутливість курячих ембріонів до Афлатоксини. Випробовувалися чисті препарати афлатоксинов B1, G1, екстракти з токсінобразующей культури A. flavus, афлатоксин В1, отриманий з неочищеного препарату за допомогою тонкошарової хроматографії. В якості контролю вводилися відповідні екстракти з неураженого грибом арахісу і виробів з нього. Розчини вводилися в яйця курей породи Білий Леггорн перед інкубацією. Введення афлатоксина вироблялося двома шляхами - через жовтковий мішок або повітряну камеру. Токсин вводився в розчині пропілен-гліколю в кількості не більше 0,04-0,05 мл-протягом чотирьох днів інкубації відбиралися всі нежиттєздатні ембріони. Встановлено, що токсичність афлатоксина для курячих ембріонів залежить від способу введення токсину: ЛД50 відповідає 0,25 мкг при введенні через повітряну камеру і 0,048 мкг - при введенні через жовтковий мішок (рис. 20).
При високих дозах афлатоксина В1 більшість ембріонів гине на 8-10-й день, при більш низьких - до 21-го дня. Афлатоксин G1 значно менш токсичний: його введення в жовтковий мішок в дозі 1 мкг викликало загибель лише 60% ембріонів, в дозі 2 мкг - 90%. У ембріонів, загиблих від введення афлатоксину В1, в більшості випадків відзначалися різке гальмування росту, едема, геморагії, недорозвинення мезенцефалона (у ембріонів, загиблих до сьомого дня) - поверхня печінки була поцяткована та гранульований. Інші компоненти афлатоксинов (В2 і G2) були нетоксичні для курячих ембріонів (Verrett, Marliac, Laughlin, 1964).

Мал. 21. Вплив афлатоксину B1 на кількість клітин в культурі тканин легенів ембріона людини (концентрація від 0,5 до 5,0 мкг / мл).

Мал. 20. Токсичність афлатоксину В, для курячих ембріонів (смертність на 21-й день 1 - інфекція через жовтковий мішок, 2 - через повітряну камеру).
Легатор, Уайсроу (Legator, Withrow, 1964) вивчали вплив двох комплексних препаратів афлатоксина, що містять 15% В19 9% Gl9 менш ніж 1% В2 і G2 (перший) і 25% В1, 17% G1 і 2-5% В2 і G2 (другий), а також кристалічного афлатоксина В1 на мітози культивованих клітин легкого ембріона людини. Афлатоксин в розчиннику додавався в середу. Придушення митозов гетероплоідних клітин на 50-55% відзначено при концентрації 0,5 мкг / мл афлатоксина, диплоїдних клітин на 50% проти контролю - при концентрації 0,1 мкг / мл (рис. 21). Автори вважають, що за ступенем придушення мітозів протягом 24 год можна визначити 0,01 мкг / мл афлатоксина в досліджуваному матеріалі.
Афлатоксин в залежності від концентрації виявляв інгібуючу вплив на ріст клітин гетероплоідной культури легких ембріона людини, процеси синтезу білка, викликав зміна їх морфології. При низькій концентрації (0,05 0,1 мкг / мл) через 48 і до 93 год після додавання число клітин підвищувався проти контролю, але при внесенні 5 мкг / мл відзначалося різке пригнічення росту, зниження вмісту білка при концентрації афлатоксину 0, 5 мкг / мл перераховані симптоми особливо різко виявлялися через 65-93 годин після введення (рис. 22-24). Радіографічним методом з мічений тимидин вивчався вплив афлатоксину на синтез ДНК. Клітини инкубировались з токсином протягом 16 год, після цього 20 хв витримувалися в розчині міченого тимідину в концентрації 0,5 мкг / мл, потім середу віддалялася і замінювалося рівній сумішшю свіжою і інкубаційній середовища-через 12 год клітини відділялися, і після відповідної обробки визначалося число мічених клітин не менше ніж в 1000 переглянутих в будь-якому вигляді досвіду. Синтез ДНК ингибировал на 40% при концентрації афлатоксину 1 мкг / мл, при цьому неочищений препарат був більш ефективний, ніж кристалічний. Інгібуючу дію залежить від часу інкубації клітин з токсином (див. Рис. 23). Морфологічні зміни клітин культури легкого ембріона людини виражаються в освіті гігантських клітин, число яких при концентрації токсину 0,1 мкг / мл через 12-18 год збільшилася майже вдвічі в порівнянні з контролем (0,3%). Встановлені біологічні властивості афлатоксина - придушення мітозів, ингибиция біосинтезу ДНК, яка виняткова освіту гігантських клітин, Карциногенний - призводять автора до переконання, що афлатоксини близькі до добре вивченим алкилирующим речовин, що є мутагенними і антінеобластіческімі агентами.
Таблиця 13
Токсичність афлатоксина (через 48 год) в клітинних культурах

Примітка: ТД50 - токсична доза (концентрація токсину), що викликає ураження від 25-50% клітин ІД50 - ингибирующая доза, яка викликає зниження білка клітин на 50% - ЛД60 - летальна доза, що викликає загибель 50% ембріонів качок і курей.
Афлатоксин в дуже низькій концентрації індукує бактеріофаг у деяких лізогенних культур (Legator, 1966) (рис. 25).
Встановлено токсичну дію афлатоксину В2 на клітини культури різних тканин. Воно визначалося по морфологічних змін, числу клітин в культурі, вмістом білка і нуклеїнових кислот. Найбільш чутливими до токсину виявилися клітини ембріона качки, потім печінки людини, ембріона курки, клітини Ні-La (табл. 13).

Мал. 22. Вплив афлатоксину В1 на мітози в залежності від концентрації (а) і часу дії (б) (1 - середнє трьох визначень, 2 - індивідуальне визначення).

Мал. 23. Вплив афлатоксину В1 на біосинтез білка в культурі легких ембріона людини:
1 - контроль, 2 - досвід (0,5 мкг / мл токсину).

Мал. 24. Ингибиция включення Н3-тимідину в ДНК в залежності від концентрації афлатоксину (а) і часу дії (б):
1 - контроль, 2 - неочищений афлатоксин 1 мкг / мл, 3-5 - афлатоксин В1 в концентрації 1,0 0,1 0,05 мкг / мл.

Первісне дію токсину проявляється в ингибиции клітинного росту, збільшення грануляції, округленні, нарешті, звисанням клітин зі скла. Мінімальна доза, при якій проявляються ці ознаки не менше ніж у 25% клітин, становить: для печінки і ембріона качки - 0,1, ембріона курки-1-5, клітин Ні-La-5 мкг / мл. Чутливість клітин ембріонів качки в 4-5 разів вище, ніж клітин ембріонів курки. Зменшення числа клітин (т. Е. Ингибиция їх поділу) і підвищення вмісту білка, ДНК і РНК в перерахунку на живі клітини підтверджує, на думку авторів, можливість їх подовження (рис. 26) (Gabliks, Schaeffer, Friedman, Wogan, 1965) .

Мал. 25. Вплив афлатоксину B1 на індукцію фага у Staphylococcus aureus (М204). На осі ординат - індекс індукції - число фагів плям в досвіді в порівнянні з негативним контролем.
До Афлатоксини чутливі багато видів тварин (каченята, індичата, кури, курчата, поросята, телята, корови, собаки, тхори, мавпи).

Мал. 26. Вплив афлатоксину B1 на зростання (кількість клітин) Flavobacterium aurantiacum, кількість білка, РНК і ДНК в перерахунку на культуру (а) і на живу клітину (б):
1 - контроль (інкубація протягом 30 год), 2-4 - концентрації афлатоксину відповідно 0,1 1,0 5,0 мкг / мл.
При згодовуванні афлатоксина мавпам резус по 1 мг в день у тварин через два тижні розвинулися апатія, анорексія, і через 4 тижні вони загинули. У великої рогатої худоби згодовування зараженого А. flavus корми викликало депресію, різке зниження надоїв, втрату апетиту, понос- при розтині відзначені підшкірні крововиливи, асцит, гіперплазія клітин жовчних проток, жирова дегенерація, некрози і фібрози печінки, набряк нирок і білкові дегенерація епітелію ниркових канальців. Для овець, кіз і кроликів токсичними виявилися штами, виділені з макухи і силосу. Відносна стійкість характерна для щурів, білих мишей, овець.
Епізоотії токсичних гепатитів у свиней в південних штатах США пов`язані з наявністю в кормах афлатоксінообразующіх штамів А. flavus. При експериментальному афлатоксікозе або додаванні в корм кристалічного токсину виникало захворювання, подібне зі спостережуваним в природних умовах (Wilson та ін., 1967).
Ступінь патологічної дії залежить від дози токсину. У дослідах Гінтц і співробітників у свиней 12-14-тижневого віку, які отримували низькі дози афлатоксину В1, відзначені незначні зміни ваги і зниження ступеня перетравності корма- при дозі, що викликала загибель тварин, відзначалася сильно виражена дегенерація печінки (Hintz, Booth, 1967). При експериментальному афлатоксікозе показано, що загибель щурів і інтенсивність утворення пухлин печінки або інших органів залежить від змісту білків в дієті (Madhavan, Gopalan, 1968).
У зв`язку з встановленням токсичності афлатоксинов не тільки для каченят, а й для інших тварин проведена серія цікавих досліджень долі афлатоксина в організмі, перш за все у зв`язку з з`ясуванням питання: чи є токсичним молоко корів, що утримуються на дієті з афлатоксин містить арахісом?
Показано, що екстракти молока корів, яких годували афлатоксінсодержащей арахісової борошном, викликають ураження печінки у одноденних каченят, аналогічне спостережуваному при введенні їм афлатоксина або токсичної арахісової муки. Хроматографією на тонкому шарі силікагелю афлатоксин В1 в токсичному екстракті з молока не виявлено, але знайдено речовину, названу «молочним» афлатоксином, «М» -токсіном, відмінне від афлатоксина В1. У зв`язку з цим були проведені дослідження шляхів перетворення афлатоксина В1 в «молочний» токсин у корів і інших ссавців.
Досліджувалися 2 кг сухого молока корів, яким в раціоні згодовували 15% високотоксичному арахісової муки. Екстракцію токсичного молока корів, що харчувалися травою і арахісом, зараженим A. flavus, проводили метанолом і хлороформом- після видалення з екстрактів розчинників осад знову розчиняли в 85% -ному метанолі, знежирювали петролейним ефіром і 40% -ний водно-метаноловий розчин екстрагували хлороформом. Поділ виробляли хроматографією на тонкому шарі силікагелю (0,3 мм). При прояві пластинок в ультрафіолетових променях виявлені значні відмінності плям екстрактів з токсичного і нетоксичного молока. У першому випадку відзначено фіолетове чітко флуоресціююча пляма з Rf 0,4, вище якого розташовуються плями з жовто-зеленої флуоресценції і ледь помітне пляма, що відноситься до афлатоксину В1 в другому випадку - плями з низьким Rf, зеленувато-жовтої і жовтою флуоресценцією. Екстракти з арахісу, зараженого A. flavus, давали чіткі плями, відповідні Афлатоксини В1, G1, а також фіолетова пляма, аналогічне виявленому в токсичне молоко (рис. 27). Екстракти з токсичного молока були розділені хроматографією на колонках сілікагеля- при прояві колонок встановлені фракції, аналогічні отриманим при хроматографії на тонкому шарі.

Мал. 27. Тонкошарова хроматографія афлатоксинов:
А - екстракти молока (1 - чистий афлатоксин В1, 2 - екстракт коров`ячого молока, 3 - екстракт токсичного коров`ячого молока, 4 - екстракт культури Л. flavus, 5 - екстракт молока щурів, 6 - екстракт токсичного молока щурів).
Б - екстракти печінки, нирок і сечі овець (1 - суміш афлатоксинов B1 і G1, 2-3 - екстракти печінки і нирок овець, які отримували афлатоксини, 4-5 - екстракти сечі овець до і після отримання афлатоксинов. 6 - екстракт токсичного коров`ячого молока - контроль). Флуоресценція: ф - фіолетовий, г - блакитний, з - зелений, ж - жовтий, з-ф - синьо-фіолетовий, з-з - синьо-зелений, ж-з - жовто-зелений.
Випробування на токсичність для одноденних каченят показало, що тільки фракція, яка дає фіолетова пляма з Rf 0,4, володіє токсичністю і викликає характерне розростання клітин епітелію жовчних протоків печінки, т. Е., Що токсичний «молочний» афлатоксин, ідентичний виявленому в незначній кількості в екстрактах з арахісу, зараженого A. flavus (табл. 14). Досліди на лактуючих щурах, яким вводили чистий афлатоксин В1 або згодовували арахіс, заражений A. flavus, показали, що в організмі тварин афлатоксин В1 перетворюється в «молочний» токсин (Jongh і ін., 1962). Батлер і Клайфорд (Butler, Clifford, 1965) вивчали метаболізм афлатоксина B1 у відносно стійких до нього тварин - щурів і овець. У щурів, щодо стійких в гострих дослідах, при одноразовому введенні афлатоксина В1 відзначаються стійкі характерні ураження печінки, що розвиваються набагато повільніше, ніж при введенні Карциногенний речовин - чотирихлористого вуглецю або діметилнитрозаміну.

Токсичність для каченят хроматографических фракцій екстрактів з
токсичного коров`ячого молока

Примітка. У кожній серії досвіду було четверо одноденних каченят (позначені цифрами), які щодня протягом п`яти днів отримували екстракт, еквівалентний 3 л молока.

Некрози з`являються вперше через 36-48 год і прогресують протягом місяця-регенерація паренхіми печінки протікає також повільно, і цей період характеризується проліферацією жовчних проток і гіперхроматіей паренхіматозних клітин. При одноразових пероральному і внутрибрюшинном введениях афлатоксина В1 самцям щурів в дозі ЛД50 він виявляється через 0,5-1 год, через 6 год вміст афлатоксину В1 знижувалося, а через 24 годин після введення відзначені тільки сліди. Через 2 год на хроматограмі чітко виявлялося друга пляма, що володіє сінефіолетовой флуоресценцией з Rf 0,2 воно зменшувалося через 6 ч, і тільки сліди його виявлялися через 24 ч. Аналогічні компоненти знайдені в печінкової і загальної крові. Через тиждень після введення афлатоксину В1 останній, як і другий компонент, в екстрактах печінки щурів не виявлявся. Таким чином, було показано, що в печінці і крові відбувається інактивація афлатоксина В1, можливо часткова, і з`являється новий токсичний компонент, аналогічний «молочному» токсину. Автори припускають, що афлатоксин В1 і продукти його перетворення можуть викликати незворотні зміни в тканинах печінки щурів, що наступають в наступний період після їх повного зникнення в печінці (через 24 год) і гістологічно виявляються тільки після цього часу. При одноразовому введенні вівцям комплексного препарату через 2 ч в екстрактах печінки були виявлені афлатоксини В1, G1 і «М» -токсін. В екстрактах з нирок інтенсивність флуоресценції плям В1 і G1 на хроматограмі менше, ніж плями «М» -токсіна. Екстракти з сечі через один і дві години після введення афлатоксину давали інтенсивну флуоресценцію плями, відповідного «М» -токсіну, слабку - афлатоксинов G1 і В1. Автори пропонують використовувати метод виявлення «М» -афлатоксіна в сечі для діагностичних цілей.
Антюков (1965-1966) встановив, що при згодовуванні поросятам їжі, зараженої A. flavus, у них до 10% зменшується кількість протромбіну, до 15% - гамма-глобуліну і до 12% - альбумінів в сироватці крові. Автор вважає, що гриб впливає на зниження белкообразовательной функції печінки, резистентність організму і вироблення антитіл (відзначено різке зниження, до 77%, фагоцитарної активності лейкоцитів). Передбачається, що токсичні речовини A. flavus спочатку активізують моторно-секреторну функцію організму (через 1-3 дні після введення), потім пригнічують і викликають різку атонію кишечника.

Афлатоксин В1 при введенні мишам пригнічує плазмоцитарна реакцію лімфатичних вузлів і селезінки і різко пригнічує утворення антитіл (Галікеев, Раіпов, Маняшева, 1968).
Афлатоксин викликає патологічні зміни в хромосомах білих мишей (Lorna, 1965), проявляє фітотоксичної властивості, викликаючи альбінізм рослин (Schoental, White, 1965).
Таблиця 15
Руйнування афлатоксина В1 спочивають клітинами Flavobacterium aurantiacum

Примітка. Густота бактеріальної суспензії 10 »мл.

Дія неочищеного афлатоксина вивчалося на 329 різних мікроорганізмах. Препарат афлатоксина, екстрагований хлороформом з зараженого А. flavus рису і обложений гексадеканом, містив такі компоненти: В1 - 23,8, В2 - 6,3, G2 - 0,9% (Вагmeister, Hesseltine, 1966). Поданим авторів, 35 досліджених видів міцеліальних грибів, що відносяться до 16 родів, виявилися стійкими до афлатоксину в дозі 30 мкг / мл дріжджі - до концентрації 40 мкг / мл-найбільш чутливими були штами В. brevis (їх зростання ингибировал при концентрації 10 мкг / мл , в той час як зростання деяких штамів В. megatherium - при 15 мкг / мл).

Мал. 29. Поглинання афлатоксина B1 автоклавуватися клітинами Flavobacterium aurantiacum.
Циглер і ін. (Ciegler і ін., 1966) досліджували близько 1000 культур різних мікроорганізмів-дріжджів, міцеліальних грибів і їх спор, актиноміцетів, водоростей і бактерій. Вивчені культури проявляли значну стійкість до Афлатоксини В1 і G1 добре росли на містять його середовищах, але не виявляли характерних флуоресціюючих зон навколо колоній.

Мал. 28. Пригнічення росту Flavobacterium aurantiacum афлатоксином В1:
1 - контроль, 2 -3 - концентрації 10 і 15 мкг / мл.
Афлатоксин руйнувався більшістю штамів видів Pseudomonas і не руйнувався вивченими штамами дріжджів, актиноміцетів, водоростей. З мікроскопічних грибів афлатоксин зрідка інактивувався представниками серії A. niger (після порівняно тривалого періоду інкубації - 11 днів). В останньому випадку афлатоксини В1 і G1 не виявляються, а виявляється нове, з більш інтенсивної блакитної флуоресценції речовина з Rf 0,25. У Penicillium raciborskii після зростання на середовищі з афлатоксином В1 на хроматограмі виявлялося речовина з Rf, близьким до Rf афлатоксина В2. Спори більшості видів грибів неспецифічні адсорбувати афлатоксин, після обробки хлороформом він швидко знімався, але частково перетворювався конидиями A. terreus, A. flavus і A. luchinesis в серію з`єднань, що володіють світло-блакитний флуоресценції. Афлатоксин руйнується тільки штамом Flavobacterium aurantiacum, що ростуть і покояться клітини якого більшу частину використаного токсину поглинають протягом 88-112 год інкубації (табл. 15). Високі концентрації токсину інгібували зростання і викликали освіту нетипових форм клітин (рис. 28). Поглинання афлатоксина знижувалося при підвищенні його концентрації в інкубаційному середовищі. Автоклавуватися клітини F. aurantiacum також мали здатність поглинати афлатоксин В1 з розчину (рис. 29).
Таблиця 16
Поглинання афлатоксина з водного розчину живими і автоклавуватися клітинами Flavobacterium aurantiacum

Живі клітини F. aurantiacum поглинали афлатоксин, доданий до розчинів молока, арахісового масла, а також з арахісу, кукурудзи, сої, штучно заражених токсінобразующім штамом A. flavus. Розчини, що містять токсин після інкубації з клітинами F. aurantiacum, були не токсичні для каченят.
Клітини F. aurantiacum, що росли при концентрації афлатоксину до 50 мкг / мл і вище, давали змінені форми - збільшення розмірів, потовщення кінців, часто розгалуження. Аналогічні зміни морфології клітин були відзначені при зростанні на середовищі з пеніциліном. При 10 і 15 мкг / мл афлатоксина В1 спостерігається ингибиция біосинтезу ДНК на 73 і 96% після 28 год, при цьому токсин повністю поглинається зростаючими клітинами F. aurantiacum. При чотирихвилинного обробці клітин ультразвуком після впливу афлатоксину в концентрації 2,5 і 5 мкг / мл відмічено відповідно 25 і 35% розірваних клітин проти 15% у контролі. Отже, клітини з токсином проявляють більшу чутливість до обробки. Потворних форм не виявлено при концентрації 2,5 мкг / мл, виявлено мало - при 5 мкг / мл. Афлатоксин B1 поглинався клітинними оболонками бактерій так само, як і автоклавуватися клітинами. Виходячи з цього автори вважають, що токсин впливає на утворення клітинної оболонки.
Живі і автоклавуватися клітини поглинали певну кількість афлатоксину B1 незалежно від тривалості інкубаційного періоду, але характер поглинання абсолютно різний. У першому випадку поглинений афлатоксин зв`язувався клітинами і не переходив в розчин при відповідній обробці, у другому - легко переходив в розчин при промиванні клітин водою (табл. 16).
За даними Араи і ін. (Arai, Tatsuya, Koyama, 1967), багато грампозитивні і грамнегативні бактерії стійкі до афлатоксину в концентрації 100 мкг / мл, але зростання досліджених авторами штамів Streptomyces і Nocardia гальмувався при концентрації 25-50 мкг / мл.
Найбільшу чутливість виявляв S. olivoreticuli- його зростання затримувався в концентрації 10 мкг / мл. порівняльне
визначення неочищеного афлатоксина при хроматографії на тонкому шарі силікагелю і при біоавтографіческом прояві показало, що антимікробна активність відноситься до афлатоксину B1.

Мал. 30. Зміна спектра поглинання афлатоксина B1 Nocardia asteroides 8 (pH 7,0).
При інкубації з токсином суспензії клітин штамів N. asteroides 2, 5. virginica 1026, N. asteroides 3, Е. coli, S. aureofaciens +1042, N. rangonensis 23, N. asteroides 8, стійких і чутливих до афлатоксину, тільки у суспензії клітин N. asteroides 8 вже через годину не виявлялися сліди афлатоксина, в той час як з клітинами інших штамів афлатоксин виявлявся майже без зміни протягом 38ч. Після 6 год інкубації суміші афлатоксина В1 і клітин N. ast