Живильні середовища - мікробіологія з технікою мікробіологічних досліджень

Для вирішення основних завдань бактеріологічного дослідження (виділення чистих культур бактерій, визначення їх біологічних властивостей і т. Д.) Необхідно вміти вирощувати мікробів в лабораторних умовах. Це здійснюється на поживних середовищах. Правильно приготовані живильні середовища визначають успіх роботи лаборанта-мікробіолога.
До складу поживних середовищ повинні входити:

1. Речовини, необхідні для росту і розмноження, а також для побудови бактеріальної клітини: джерела азоту, вуглецю, кисню і водню.
2. Неорганічні сполуки у вигляді різних солей.
3. Бактеріальні вітаміни, або так звані фактори росту.

Крім цього, поживні середовища повинні мати певну в`язкість, вологість і реакцію середовища. Мікроби пристосовуються до деяких коливань цієї реакції, але для кожного мікроба є кордону, межі яких ці коливання не повинні переходити.
У мікробіологічній практиці існує багато найрізноманітніших поживних середовищ. Залежно від їх властивості, складу і призначення поживні середовища можна розділити на кілька груп.
За походженням розрізняють: а) природні поживні середовища та б) штучні поживні середовища.
До перших відносяться сироватка крові, жовч, яйця, молоко, картопля, морква. До других - поживні середовища, приготовані з м`ясних або рослинних настоянок, до яких додають різні азотисті продукти, вуглеводи і солі, наприклад м`ясо-пептони бульйон, м`ясо-пептони агар і т. Д.
За консистенцією середовища поділяють на щільні, напіврідкі і рідкі. До щільним середах відноситься м`ясо-пептони агар, поживна желатину, згорнута сироватка, згорнутий яєчний білок, картопля і ін. Напіврідких живильним середовищем є 0,5% м`ясо-пептони агар. До рідких середовищ відноситься мясопептонний бульйон, пептонна вода, цукровий бульйон і ін.
По складу всі поживні середовища можуть бути розділені на три групи:

1. середовища основні, або прості, що вживаються для вирощування більшості патогенних мікробів (м`ясо-пептони бульйон, м`ясо-пептони агар, мясопептонний желатину і ін.);
2. середовища спеціальні, або елективні, що застосовуються для виділення і вирощування певних патогенних бактерій, які на звичайних середовищах погано або зовсім не ростуть (цукровий бульйон, жовчний бульйон, агар з кров`ю та ін.);
3. середовища диференційно-діагностичні, службовці одним з допоміжних засобів при визначенні (ідентифікації) чистої культури досліджуваного мікроорганізму (вуглеводи строкатого ряду Гісса, агар Ендо і ін.).

Приготування поживних середовищ

Основні поживні середовища

Найбільш поширеною рідким середовищем є м`ясо-пептони бульйон. Він готується на м`ясний воді.
М`ясна вода. Дрібно нарубані м`ясо, звільнене від жиру і сухожиль, змішують з подвійним за вагою кількістю води (500 г + 1 л води), настоюють 24 години при кімнатній температурі, фільтрують через шматок полотна і ретельно віджимають м`ясо, що залишилося на ньому. М`ясна вода являє собою червону рідину кислої реакції. Вона містить розчинні білкові речовини (альбуміни), екстрактивні речовини і деякі солі. М`ясну воду кип`ятять до згортання білка і фільтрують через паперовий фільтр. При необхідності зберегти м`ясну воду її розливають по флаконах або пляшках і стерилізують в автоклаві при 120 ° протягом 20 хвилин (див. Стор. 74). В даний час також широко застосовується спосіб гарячої екстракції фаршу без замочування його в холодній воді. М`ясний фарш з водою прогрівають 1/2 години, не доводячи до кипіння, а потім вже кип`ятять 1 годину. Цим методом краще користуватися в літню пору.
Приготування м`ясо-пептонного бульйону. Бульйон готують з м`ясною води, до якої для підвищення поживних властивостей додають пептон (1%) і хлористий натрій (0,5%), т. Е. На 1 л м`ясної води беруть 10 г пептона і 5 г хлориду натрію. Суміш кип`ятять 10-15 хвилин при постійному помішуванні. При цьому пептони і сіль розчиняються. Отриманий бульйон має кислу реакцію, при якій більшість патогенних мікробів не дає зростання. Необхідно тому зробити реакцію слабо лужний.
Для встановлення реакції необхідно мати розчини індикаторів і титровані розчини лугів і кислот. У бактеріології вживають різні індикатори, т. Е. Речовини, колір яких змінюється в залежності від реакції середовища, наприклад лакмус, фенолфталеїн, мета-нитрофенол, пара-нитрофенол і ін. Лакмус найчастіше використовується у вигляді лакмусового папірця, фенолфталеїн - у вигляді 0 , 5% спиртового розчину, метанітрофенол- у вигляді 0,3% водного розчину (на дистильованої воді) і пара-нитрофенол - у вигляді 0,1% водного розчину, кислоти і луги - у вигляді нормальних розчинів. Після встановлення реакції бульйон кип`ятять, фільтрують і стерилізують.
Встановлення реакції живильного середовища. В даний час загальновживаним способом визначення реакції середовища є колориметричний метод Міхаеліса. Суть методу полягає в зміні кольору індикатора в залежності від ступеня його дисоціації. Останнє обумовлено концентрацією водневих іонів досліджуваної рідини.
Нейтральної реакції відповідає pH 7,0 рНlt; 7,0 позначає кислу реакцію, рНgt; 7,0 - лужну реакцію. Для колориметрического методу потрібно мати напоготові більшу кількість різних кислих і лужних розчинів, активна реакція яких (pH) заздалегідь визначена електрометричним шляхом. Ці стандартні розчини повинні бути підібрані так, щоб вийшла ціла шкала з поступово наростаючою лужністю (pH): 5,0- 5,2- 5,4- 5,6 і т. Д. Зазвичай Для визначення pH користуються стандартними розчинами в запаяних пробірках , які встановлені рядами в спеціальному ящику з кришкою.

Мал. 22. Компаратор Міхаеліса (пояснення в тексті).

Відео: Мікробіологія. Приготування фіксованих препаратів (Е. Звонарьова)

Щоб визначити pH, користуються компаратором, який являє собою дерев`яну колодку, на верхній поверхні якої є б отворів (по 3 в два ряди) такого ж розміру, як і застосовувані пробірки. Пробірки на половину своєї довжини входять в блок, як в звичайний штатив. Бічні поверхні компаратора гладкі, а на передній і задній стінці є наскрізні отвори, через які проходить світло. На задній стінці проти отворів вставлені матові (молочні) і сині скла (рис. 22).
Визначення реакції живильного середовища проводиться таким чином. В отвір 2 компаратора вставляють пробірку з 2 мл живильного середовища, в яку додають 4 мл дистильованої води і 1 мл індикатора (мета- або пара-нітрофенолу), в отвір 5 - пробірку з дистильованою водою. В отвори 1 і 3 вставляють пробірки, що містять 2 мл тієї ж живильного середовища з 5 мл дистильованої води (без індикатора). В отвори 4 і 6 ставлять стандартні пробірки з такими показниками pH, між якими хочуть встановити реакцію середовища. У 2-й або 1-й або 2-й і 3-й пробірках при спостереженні в прохідному світлі через отвори в бічних стінках компаратора повинні вийти зовсім однакові відтінки кольору рідини. Реакція середовища буде відповідати реакції стандарту, з яким вона за кольором збігається. Якщо в 2-й пробірці колір виявиться більш світлим, ніж у стандартній, то в неї по краплях додають деци-
нормальний розчин лугу, поки забарвлення не стане однаковою зі стандартною. Потім розраховують кількість лугу, необхідне для встановлення реакції 1 л середовища, виходячи з кількості лугу, доданій до 2 мл бульйону.
Приклад. Необхідно встановити в досліджуваному середовищі pH 7,4. В отвори 4 і 6 вставляють стандартні пробірки з позначенням pH 7,4 і 7,6. У пробірку, вставлену в отвір 2, доливають по краплях з градуйованою піпетки децінормальний розчин їдкого натру до тих пір, поки не вийде відтінок, який відповідає стандарту з потрібним pH. Якщо для встановлення pH в 2 мл середовища знадобилося 0,2 мл децинормального розчину їдкого натру, то для 1 л потрібно 0,2 X500 = 100 мл децинормального або 10 мл нормального розчину їдкого натру. Так як при стерилізації середовища pH часто змінюється в бік зменшення лужності, то перед стерилізацією слід встановити pH трохи вище необхідного (на 0,2). Щільні живильні середовища розплавляються перед визначенням pH. Визначення ведеться, як зазначено вище.
Останнім часом випущений в продаж прилад Міхаеліса для визначення pH середовища мікрометодом.
Приготування м`ясо-пептонного агару. До м`ясо-пептонному бульйону додають від 2 до 4% (в залежності від сорту) дрібно нарізаного агар-агар і кип`ятять до повного розчинення. Потім дають охолонути до 50 ° і додають для просвітлення яєчний білок (на 1 л агар беруть збитий і розмішати з невеликою кількістю води білок одного яйця), добре збовтують і поміщають на 4-5 хвилин в автоклав. Білок під час кип`ятіння згортається і захоплює за собою зважені частинки. Отриману каламутну рідину фільтрують в гарячому вигляді через вату, змочену гарячою водою. Можна обійтися і без яєчного білка, але агар виходить недостатньо просвітленим. Гарячий профільтрований агар розливають в пробірки по 5 8 мл або в колби по 50-500 мл і стерилізують в автоклаві 20 хвилин при 120-125 °. Після стерилізації пробірки з ще рідким агаром слід покласти майже горизонтально, щоб агар застиг в скошеному положенні з великою поверхнею, або дати йому застигнути у вигляді стовпчика. У першому випадку вийде скошений. агар, у другому - стовпчик (рис. 23). Скошений агар Повинен мати на дні пробірки конденсаційну воду, Необхідну для нормальної життєдіяльності мікробів.

Мал. 23. Пробірки з агаром стовпчиком і скошеним агаром.

М я з о-пептонна желатину. До 1 л м`ясної води додають 1 г пептона, 5 г кухонної солі і 100 або 150 г дрібно нарізаної желатин. Залишають стояти кілька годин, щоб желатину розбухла. Отриману суміш підігрівають до повного розчинення желатину. Встановлюють слаболужну реакцію, прояснюють яєчним білком, фільтрують через вату, змочену окропом. Після розливання середу стерилізують в апараті Коха 3 дні по 60 хвилин кожен день. Стерилізувати желатину в автоклаві не можна, так як вона після цього втрачає здатність застигати. Желатину плавиться при температурі 23-25 ° і знову застигає при температурі нижче 22 °.

Живильні середовища на переварити Хоттингера. Основний розчин Хоттингера з успіхом замінює м`ясну воду. Він готується в такий спосіб. Нарізають невеликими шматочками 1 кг м`яса, поміщають в посудину, що містить 1,5 л окропу і кип`ятять 15-20 хвилин. Потім м`ясо виловлюють і подрібнюють в м`ясорубці. Остигнула до 40-45 ° рідина переливають в бутель і додають 1,5 г соди, 3-5 г панкреатину і 15-20 г хлороформу, негайно ж закривають гумовою пробкою і струшують. До цієї рідини додають подрібнене м`ясо, жовч (20 мл жовчі на 1 кг фаршу), струшують і залишають бутель стояти при кімнатній температурі на 5 діб або довше (рідина в бутлі щодня по кілька разів на день збовтують), поки вміст її чи не перетвориться в прозору, насичено жовту рідину з дрібним осадом на дні. Достатність перетравлення визначають реакцією на триптофан. Потім рідину фільтрують, розливають по флаконах та стерилізують в автоклаві при 120 ° протягом 20 хвилин. Для приготування бульйону цей основний розчин розводять дистильованою водою в 3-5 або 10 разів. Ступінь розведення залежить від того, для яких мікроорганізмів призначається дана середу, і від якості отриманого розчину Хоттингера. До вже розлученій переварити Хоттингера додають 0,7% хлориду натрію і 0,1 / о фосфорнокислого калію (К2НРО4), кип`ятять, встановлюють бажану реакцію, знову кип`ятять, фільтрують через паперовий фільтр, ще раз перевіряють реакцію, розливають по пробірках і флаконах та стерилізують в автоклаві при 120 ° протягом 20 хвилин.
Розчиняючи в такому бульйоні агар або желатину, отримують відповідну тверду середу.
Пептон Мартена і бульйон з нього. Беруть свинячі шлунки, звільняють від жиру і, не промиваючи, пропускають через м`ясорубку. Фарш опускають в пляшки по 250 г і заливають солянокислим розчином (1 л нагрітої до 50 ° водопровідної води + 10 мл димить соляної кислоти). Суміш залишають для перетравлення в термостаті при 45-50 ° до тих пір, поки фарш не перетвориться в порошкоподібних масу і не з`явиться позитивна реакція на триптофан. Перетравлення зазвичай триває 48 годин. Отриманий таким чином мартенівський пептон стерилізують в тих же бутлях при тиску в 1 атм (понад нормальний).
Для приготування бульйону Мартена з бутля відсмоктують рідину сифоном або піпеткою Мора великої місткості, фільтрують через вату і додають рівний об`єм м`ясної води. Потім встановлюють необхідну реакцію, бульйон кип`ятять 30 хвилин, дають відстоятися, після чого фільтрують через полотно або фільтрувальну папір, розливають по пробірках і колб і остаточно стерилізують під тиском 0,5 атм 30-40 хвилин.

Спеціальні поживні середовища

Цукровий бульйон і цукровий агар готують шляхом додавання до звичайного бульйону або розплавленому простому агару того чи іншого вуглеводу в кількості від 0,5 до 1%. Вуглевод розчиняють в невеликій кількості води, а потім додають до живильному середовищі. Стерилізацію цукрового бульйону і агару роблять в апараті Коха 3 дні поспіль по 1 годині.
Агар з кров`ю, сироваткою або з асцитической рідиною готують при дотриманні суворої асептики. До готового слабо-лужного розплавленому і знову охолодженого до 45 ° агар, розлитого в пробірки або флакони, додають 20-25% стерильною сироватки або асцитичної рідини або 5-25% стерильної дефибринированной крові. Після ретельного перемішування (уникати утворення міхурів і піни) агар в пробірках скошують, а вміст флаконів розливають по чашках Гейденрейха.
Бульйон з сироваткою, асцитической рідиною або кров`ю готують таким же способом, як агар, але без нагрівання. Для контролю стерильності бульйон ставлять в термостат на 48 годин при 37 °.
Середа Леффлера. Сироватка виходить з крові коня, бика або барана. Три частини отриманої сироватки змішують з однією частиною слабощелочного цукрового бульйону (1% пептона, 0,5% хлориду натрію і 1% глюкози) і розливають в пробірки по 8 мл. Пробірки поміщають в спеціальний апарат для згортання в похилому положенні і нагрівають по 1 годині при 80-90 ° протягом 3 днів. При цьому сироватка згортається. Для контролю стерильності пробірки ставлять на 48 годин в термостат при 37 °. Таким же чином готують пробірки зі згорнутої кінської сироваткою, що не розведеним бульйоном (середа Ру). Нагрівання потрібно виробляти повільно, щоб уникнути утворення бульбашок. Серед застосовуваних для виділення дифтерійної палички.
Диференційно-діагностичні середовища.
Середовище Ендо. Готується безпосередньо перед вживанням. До ЮО мл м`ясо-пептонного агару або агару на бульйоні Хоттингера (pH 7,6) стерильно додають 1 г хімічно чистої лактози, розчиненої в 5 мл стерильної води, охолоджують до 70 ° і додають суміш 0,5 мл насиченого розчину основного фуксину і 1 , 25 мл свіжоприготованого 10% розчину серністокіслого натрію, збовтують і розливають по чашках. Для підсушування відкриті чашки поміщають на 30 хвилин у термостат при 37 °.
На середовищі Ендо кишкова паличка дає колонії червоного кольору з металевим відтінком, а бактерії тифозних-паратифозної і дизентерійної групи - безбарвні колонії (див. Рис. 77 на вклейці).
Строкатий ряд вуглеводів (середа Гіссен). До ЮО мл води додають 1 г пептона, 0,5 г кухонної солі. Пептон і сіль розчиняють в гарячій воді протягом декількох хвилин і фільтрують через паперовий фільтр (розчин повинен бути абсолютно прозорим). Встановлюють pH 7,0. У вказаному середовищі розчиняють 1% одного з застосовуваних вуглеводів, на дно пробірок опускають поплавці для уловлювання газу (що свідчить про глибоку розщепленні цукрів) і додають індикатор. Як індикатор використовують:
а) лакмусовий настойку - 5 мл на 100 мл середовища. У кислому середовищі лакмусовий настоянка показує почервоніння, в лужному - посіненіе- б) азолітмін, який являє собою очищений препарат лакмус, його калійну сіль (на 1 л середовища додають 0,25 г азолітміна) - в) бромтимолблау - на 1 л середовища 1 мл 1,6% спиртового розчину індикатора (середа набуває зеленого кольору, синіє при утворенні лугу, жовтіє при утворенні кислоти) - г) індикатор Андреде, який складається з 1 г кислого фуксину, 400 мл дистильованої води і 64 мл нормального розчину їдкого натру. До живильному середовищі додають 1% індикатора. Середовище в пробірці повинна придбати солом`яно-жовтий колір без рожевого відтінку. У кислому середовищі колір середовища змінюється на червоний (рис. 24 на вклейці).
Індикатор додають для того, щоб визначити зміни реакції живильного середовища, яка відбувається під впливом ферментації вуглеводів, т. Е. Для виявлення біохімічної активності мікробів. Останнє має велике значення для мікробіологічної діагностики ряду інфекційних захворювань (черевний тиф, дизентерія, холера та ін.). Середовища з вуглеводами і індикатором розливають в стерильні пробірки і стерилізують дрібно при 100 ° протягом 3 днів.

Сухі поживні середовища

Застосування сухих поживних середовищ набуває все більшого практичного значення. Стандартність, простота зберігання, транспортування та виготовлення роблять сухі поживні середовища досить зручними для роботи.
Сухі поживні середовища являють собою світло-жовті гігроскопічні порошки без грудок, з вологістю до 10%. У сухому місці, в добре закупореній посуді їх можна зберігати тривалий час. Вони повинні добре розчинятися в дистильованої воді при кімнатній температурі в концентрації 1,5-6%.
Сухий поживний бульйон. 25 г порошку розчиняють в 1 л холодної дистильованої води при підігріванні, розливають і стерилізують. Після стерилізації при 120 ° протягом 15- 20 хвилин отримують прозорий, без осаду розчин блідо-жовтого кольору з нейтральним pH. З сухого поживного бульйону можна готувати бульйон, диференціальні середовища з вуглеводами, поживний агар і тверді диференціальні середовища.
Сухий поживний агар. До 1 л дистильованої води додають 50 г порошку, розплавляють, встановлюють необхідну реакцію, пропускають через ватно-марлевий фільтр, розливають, стерилізують при 120 ° протягом 25-30 хвилин.
Сухий агар Ендо. 5 г порошку світло-бузкового кольору (що швидко псуються під впливом світла) всипають в 100 мл холодної дистильованої води, потім розплавляють, кип`ятять протягом 5 хвилин. Після охолодження до 50 ° масу збовтують (для рівномірного розподілу осаду) і розливають в чашки.
Середовища Гіссен з вуглеводами і індикатором ВР.

1 г порошку всипають в 100 мл холодної дистильованої води, підігрівають до розчинення, розливають в стерильні пробірки з поплавками, стерилізують 5 хвилин при 110 ° (відповідно до інструкції). Випущена і друга модифікація цього середовища - напіврідка (розливати без поплавців). Середовища після стерилізації і охолодження мають жовтувато-рожевий або блідо-рожевий колір. Рідке середовище прозора, напіврідка з опалесценцією. Індикатор ВР є сумішшю розоловой кислоти і водної блакитною фарбою. У кислому середовищі індикатор має інтенсивно синій колір, в лужному - від слабо-рожевого до червоного.

Суха жовч. 7 г порошку розчиняють в 100 мл води, розливають, стерилізують в автоклаві. Вживають як середовище збагачення при виділенні бактерій з крові при черевному тифі і паратифах.
Суха середу Леффлера. 100 г порошку розтирають у ступці з невеликою кількістю теплої води до отримання однорідної маси, додають теплої води до 1 л, фільтрують через два шари марлі, розливають по пробірках, стерилізують в свертивателе Коха протягом 3 днів при 90 ° по 1 годині.
Суха молочна сироватка з індикатором ВР. 1 г порошку сірувато-бузкового кольору всипають в 100 мл холодної дистильованої води, розливають по пробірках і стерилізують текучою парою протягом 20 хвилин. Середа аметистового кольору. Палички черевного тифу і дизентерії не змінюють кольору середовища. При зростанні Е. coli довкілля різко синіє. Бактерії паратифу В забарвлюють середу в блакитний колір.

Фільтрування та розливання поживних середовищ

Рідкі поживні середовища та розплавлену желатину фільтрують або через складчастий фільтр з фільтрувального паперу, попередньо змоченою водою, або через фільтрувальне полотно, що накладаються на скляну воронку. Практичний користуватися полотняними фільтрами, бо вони можуть служити довгий час, тоді як паперові фільтри використовуються тільки одноразово. Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Агар наливають на фільтр гарячим. Після фільтрування поживні середовища розливають в посуд (флакони, пробірки).
Для розливання поживних середовищ в пробірки користуються лійкою або бюреткою, на нижній кінець якої надіта коротка гумова трубка з маленьким скляним наконечником і затискачем Мора.

Відео: Культивування мікробів - Єлизавета Бонч-Осмоловський