Електрофорез - біоматеріаловеденіе - полімери медичного призначення
Відомо, що пропускання електричного струму через систему, яка містить статично заряджені молекули або інші частинки, викликає спрямовану міграцію останніх до позитивного або негативного електроду в залежності від знака заряду частинок. Використання цієї закономірності для поділу, очищення, ідентифікації молекул і частинок і для інших процесів називається електрофоретичної аналізом [38, 39]. В області біоматеріаловеденія практикуються дві методики електрофорезу. Перша, звана «зонним електрофорезом», полягає в тому, що в якості підкладки-носія використовують фільтрувальний папір, агар-агар, а також гелі типу крохмалю або полиакриламида. Друга методика, яка називається мікроелектрофорезу, або клітинний електрофорезом, полягає в безпосередньому прослеживании міграції заряджених мікрочастинок за допомогою оптичного мікроскопа. Нижче обидві ці методики розглянуті досить докладно.
Гель-електрофорез
Для поділу складових білка, адсорбируемого на поверхні полімеру при його контакті з кров`ю, Lyman і співр. [40] застосовували електрофорез- носієм служив гелеобразний полиакриламид. На зоологічному рівні методика експериментів зводилася до наступних маніпуляцій.
У спадні аорти собак вставляли і закріплювали дакроновий муфтами перехідні трубки однакового діаметра, виконані з досліджуваних полімерів. Схема кріплення і моделі перехідних трубок показані на рис. 84. Кров пропускали через перехідник протягом певного часу, потім знімали його і занурювали в фізіологічний розчин, що містить нейтральне поверхнево-активна речовина Triton Х-100 1% концентрації. Дослідники повідомляли, що використання такого агента майже виключає денатурацію білка: практично весь білок, адсорбована на трубці після 45-годинного протікання крові (при 25 ° С), вдалося перевести в розчин і регенерувати.
Мал. 84. Перехідні трубки трьох моделей з медичних полімерів, що вставляються в спадну аорту.
А, Б, В - моделі А, Б, В.
Отриманий розчин пропускали через ультрафільтраційну кювету з діафрагмою РМ 10 (фірми Amicon), елімінуючи речовини з молекулярною масою менше 10 000, потім концентрували і відразу ж піддавали екстракт (200 мкл) електрофорез з використанням поліакріламідного гелю. Міграційний аналіз вели при постійній напрузі 300 В і температурі 20 ° С протягом 47 хв-як буфер використовували систему 0,065 М борної кислоти (pH 9). По завершенні міграції гель фарбували і знебарвлювали і проводили сканує денситометрію, в результаті чого вдалося здійснити градуювальну ідентифікацію складових білка.
Мал. 85. Картина електрофорезу білка (альбумін), адсорбованого на поверхні сополимера ефіру з уретаном і сечовиною (матеріал PEUU 1025 м).
1 контакт 45 хв-2 - контакт 9 хв.
Мал. 86. Картина електрофорезу білка (альбумін), адсорбованого на поверхні різних полімерів медичного призначення.
1 - поліфторетілен-пропілен, 30 хв-2 - силіконовий каучук, 45 хв-3 - сополімер ефіру з уретаном і сечовиною, 45 хв.
На рис. 85 показана картина електрофорезу білка (альбуміну), адсорбованого після пропускання крові через відвідну трубку з сегментированного сополимера ефіру з уретаном і сечовиною (PEUU 1025) - кров пропускали протягом 9 хв, а також 45 хв. З кривих видно, що 45-хвилинного зіткнення полімеру з кров`ю досить для досягнення адсорбційної рівноваги. Для порівняння було здійснено електрофорез білка (альбуміну), адсорбованого за тією ж методикою на ненаповненому силіконовому каучуку (SR) і на поліфторетілен-пропілену (FEP). Загальна картина міграції представлена на рис. 86- цифрові дані наведені в табл. 46. Графічний та цифрової матеріали свідчать про те, що природа полімеру надає на склад адсорбируемого білка плазми надзвичайно великий вплив.
Таблиця 46. Адсорбція білка на поверхні деяких медичних полімерів (in vivo)
Таблиця 47. Адгезія тромбоцитів на поверхні полімерних матеріалів медичного призначення
Очевидно і те, що склад білка зазнає також тимчасові зміни. Впадає в очі, що з двох сополімерів ефіру з уретаном і сечовиною той, у якого молекулярна маса поліефірного блоку більше, т. Е. Матеріал PEUU 1025, відрізняється виключно високою виборчої здатністю по відношенню до альбуміну.
Початковий етап тромбоутворення полягає в тому, що на поверхні полімеру адгезируются і когезіруются, потім агглютинируются і утворюють аггрегацію тромбоцити, і чим вище селективна адсорбційна здатність полімеру до альбуміну, тим менше адгезія на ньому тромбоцитів. Така закономірність чітко простежується за даними табл. 47.
Таблиця 48. Адгезія тромбоцитів до поверхні полімерного матеріалу, покритого білком
Всі ці спостереження дозволили Lyman вивести робочу гіпотезу про те, що антітромбогенность полімерного матеріалу знаходиться в тісному зв`язку з його адсорбційної вибірковістю по альбуміну. Пропозиція це повністю підтверджується даними, наведеними в табл. 48. Цифри були отримані в результаті серії експериментів, проведених на зразках ненаполненного силіконового каучуку (SR), попередньо покритих альбуміном, фибриногеном або у-глобуліном. Їх вводили в контакт з кров`ю і після закінчення певних відрізків часу вимірювали обсяг адгезірованних тромбоцитів. Методика перекладу адгезірованних білка в розчин з наступним електрофоретичним аналізом дозволяє отримати цінну інформацію, проте вона пов`язана з досить важкими проблемами, вирішення яких вимагає подальших розробок.
Так, наприклад, дана методика виявляється поки безсилою для аналізу самій початковій стадії тромбоутворення, яка протікає на поверхні полімеру за перші кілька секунд контакту з кров`ю і розглядається як виключно важлива, може бути, що визначає. Крім того, можливості гель-електрофорезу не поширюються на багато особливостей конформаційних змін адсорбованого білка, які розпізнаються і реєстровані іншими аналітичними методами. Нарешті, вельми проблематично і те, що весь адсорбований білок цілком і повністю переходить в розчин при обробці поверхнево-активною речовиною [41]. Є й інші питання в галузі гель-електрофорезу, що вимагають дозволу.
Мікроелектрофорез (клітинний електрофорез)
Сутність мікроелектрофорезу досить добре відома і зводиться до того, що частинки речовини (включаючи клітини біологічних субстанцій), що несуть електричний заряд, зважують в розчині електроліту в кюветі для електрофорезу і безпосередньо спостерігають міграцію цих частинок в електричному полі постійного струму за допомогою оптичного мікроскопа. Принципова схема установки для аналізів способом мікроелектрофорезу показана на рис. 87.
Під дією власної маси частки седіментіруются. Одночасно вони переміщаються у напрямку до протилежно зарядженого електроду зі швидкістю, пропорційної поверхневої концентрації зарядів. Таким чином, результуючий напрям міграції може бути представлено у вигляді діагоналі паралелограма (рис. 88).
Швидкість міграції частинок можна визначати за допомогою градуйованого мікроскопа з використанням секундоміра. В результаті електроендосмоса в кюветі мігрують не тільки заряджені частинки, але і сам електроліт. Центральне і периферичні течії цього середовища йдуть протитечією і при зіткненні взаємно погашаються, утворюючи зону спокою у вигляді площини, в якій течії відсутні. Загальна схема руху потоків електроліту в кюветі показана на рис. 89.
Необхідно сфокусувати мікроскоп з таким розрахунком, щоб спостерігати міграцію тільки тих частинок, які знаходяться саме в площині спокою. Таким чином, при дослідженні рухів наімельчайшіх частинок, що осідають вкрай повільно, треба встановлювати кювету горизонтально і вести спостереження зверху вниз. Зазвичай же кювету фіксують в поперечному положенні, відповідному площині спокою, і ведуть спостереження по горизонталі.
1-термостат- 2-мікроскоп- 3 - оптична система-4 - гелій-неоновий лазер 5 - міграційна кювету горизонтального типу-6 - пристосування для фіксації кювети в горизонтальному або вертикальному положенні.
Мал. 88. Міграція часток при мікроелектрофорезу.
Мал. 89. Потоки середовища в кюветі для мікроелектрофорезу.
Мал. 87. Установка для мікроелектрофорезу.
Chiu і Nyilas з співр. [42] вивчали методом целлюлярного електрофорезу конформаційні зміни фібриногену, адсорбованого мікропорошками двох речовин: скла і ізотропного вуглецю LTI (lowtemperature isotropic Carbon), що відрізняється високою тромборезістентностью- діаметр частинок порошків вимірювався в мікронах. Обсяг фібриногену, адсорбованого частинками, змінювали в досить широких межах, варіюючи умови адсорбції, т. Е. Концентрацію білка. Міграцію починали визначати тільки після того, як частинки досягали площині спокою. Аналізуючи по 12-14 часток, обчислювали середню ступінь електрофорезного переміщення, а потім будували графік її залежності від коефіцієнта 0 покриття, описуваного наступною формулою:
Коефіцієнт відносного поверхневого покриття частинок білком,
Криві такої залежності, які стосуються склу (9,85 м2 / г) і до ізотропному вуглецю LTI (27,7 м2 / г), наведені на рис. 90.
Як тільки коефіцієнт поверхневого покриття перевищує 20%, рухливість частинок скла різко знижується, рухливість же частинок вуглецю LTI не змінюється до тих пір, поки значення коефіцієнта 0 не досягне 0,6, і лише після цього починає поступово зменшуватися. Ця закономірність була інтерпретована наступним чином. На склі фібриноген адсорбується в невеликому обсязі, проте він поширюється по всіх ділянках негативно зарядженої поверхні і інтенсивно їх блокує. У той же час фібриноген, адсорбований на матеріалі LTI, майже не робить блокуючого дії на відповідні зони. Інакше кажучи, все полягає в тому, що при адсорбції фібриногену до скла конформація його макромолекул дуже сильно змінюється, тоді як адсорбція до вуглецевих матеріалів майже не викликає конформаційних перетворень.
Мал. 90. Рухливість адсорбувати фібриноген частинок (скло, LTI Carbon) при мікроелектрофорезу.
- - Частинки вуглецю (27,7 м2 / г;
- - Частинки скла (9,85 м2 / г).
Описане дослідження представляє єдину в своєму роді спробу застосувати електрофорез для аналізу електрозаряженності частинок матеріалів, адсорбована білок, і тим самим отримати нові відомості про конформаційних змінах білкових макромолекул. У цьому сенсі воно залишається поки унікальним. Труднощі методу можна поділити в такий спосіб. По-перше, необхідно враховувати, що внаслідок конформаційних перетворень білка змінюються умови його поверхневої зарядженості. По-друге, слід брати до уваги значні розбіжності в діаметрі, конфігурації, умовах поверхневої зарядженості, рівні вільної поверхневої енергії і в інших характеристиках частинок, обумовлені технічними причинами, зокрема подрібненням зразків. Існують і інші труднощі, пов`язані із застосуванням мікроелектрофорезу в біоматеріаловеденіі.
