Гістологічна і гістохімічна мікроскопія - полімери медичного призначення
Йдеться про методику морфологічних досліджень взаємодії білка, еритроцитів і інших біологічних субстанцій з чужорідними матеріалами з застосуванням оптичної мікроскопії, а також скануючих і пропускають електронних мікроскопів. За суттю своєю ця методика не відрізняється від сформованої практики мікроскопічних досліджень в патології, гістології, цитології і в інших областях медицини. Говорячи конкретніше, до матеріалу, введеному in vitro або in vivo в контакт з тією чи іншою частиною живого організму, застосовують серію таких, наприклад, операцій: фіксація- імплантація-зрізання тонких шарів-фарбування. Або ж інший серію: фіксація-осушка заморожуванням (сушка в критичній точці) -окрашіваніе. Після серії зразок піддають електронній мікроскопії. Обробка зразків, що передує фарбування, повинна відповідати трьом основним вимогам: не викликати змін структури матеріалу-зберігати всі властивості біологічної субстанції (білка, еритроцитів, клітин) - не змінювати локалізацію обох субстанцій. Очевидно, що маніпуляції з фарбування теж повинні відповідати деяким специфічним вимогам [43].
Особливості, що зустрічаються при реалізації способів гістологічної мікроскопії, доцільно проілюструвати кількома прикладами.
Розробляючи мембрани для гемодіалізу в штучній нирці, Rubin і співр. ([44] здійснили порівняльний аналіз взаємодії білка плазми крові з складовими еритроцитів в мембранах з колагену і з купрофана, застосовуючи для цієї мети оптичну, а також сканує електронну мікроскопію. Через диализатор з мембраною у вигляді циліндра з колагену або з купрофана протягом 5, 30 і 300 хв пропускали при 37 ° С кров собаки (в кров попередньо був доданий гепарин).
Таблиця 49. Адгезія клітин крові до гемодіалізного мембран
* 0,01 кв. дюйма = 6,542 мм 2. - Прим. пров.
Після закінчення кожного з цих тимчасових інтервалів мембрану промивали фізіологічним розчином і відбирали на пробу її зріз певної площі. Зразок охолоджували до 4 ° С і фіксували (pH 2,2) буферним розчином 6% глутарового альдегіду з 0,1 М какоділатом натрію, після чого висушене, використовуючи такий же буфер. Кожен зріз сушили в критичній точці і напилювали вуглець і металевий паладій, після чого досліджували поверхню плівки на скануючому електронному мікроскопі. Частина зразків після зневоднення піддавали фарбування на світлі і досліджували в оптичному мікроскопі. Деякі результати спостережень наведені в табл. 49.
Цифрові дані дозволяють констатувати, що на мембранах з купрофана адгезія еритроцитів протікає абсолютно рівномірно і досить енергійно. У той же час на колагенових мембранах адгезія еритроцитів дуже невелика, і навіть збільшення тривалості гемодіалізу викликає лише незначне зростання цього показника. Таким чином, можна припускати, що ділянки адсорбції еритроцитів на коллагеновой мембрані повністю блокуються на самому початку діалітіческого процесу. Що ж стосується адсорбції білка, то на мембранах з колагену вона займає 25%, а з купрофан -10% всієї площі. Електрофорез показав, що колагенові мембрани схильні до кращою адсорбції альбуміна- седиментации ж фібрину взагалі не спостерігалося. Все це дає підстави стверджувати, що рівень адгезії тромбоцитів до колагену дуже невисокий.
Мал. 91. Модель плівки живого організму (Singer, Nicolson, 1972).
1 домени, що не несуть електрозаряда- 2 - електрозаряженние домени.
Використовуючи просвічує електронну мікроскопію, Gorman і співр. [45] досліджували адсорбцію фібриногену до поверхні чистої слюди, а також слюди з напиленням вуглецем. Методика експериментів зводилася до наступних операцій. Спочатку здійснювали контакт амоній-ацетатного або натрій-фосфатного буферного розчину фібриногену бика з досліджуваним полімерним матеріалом протягом певного відрізка часу, після чого прополіскують, сушили, піддавали платиновому оттенением і армували вуглецевої плівкою.
Далі у вигляді бінарної мембрани або в формі репліки досліджували методом електронної мікроскопії і визначали молекулярне число фібриногену, рівномірно адсорбованого на певній площі зразка. Всі експерименти цієї серії проводили за єдиною методикою при мінімальній концентрації (0,06 7млн. Частини) фібриногену і при короткочасному його зіткненні зі зразками. Якщо ж взяти до уваги безліч варіацій контакту крові з полімерами у всій їх незмірну складності при широкому різноманітті полімерних матеріалів, то можна передбачити, що застосування описаного способу універсальної методики досліджень зустрінеться з дуже великими труднощами.
Для сучасних поглядів характерно все більш широке розповсюджується думка про те, що Мікрогетерогенна структура поверхні (характерний приклад - структура мікрорасслоенія) має найтісніший зв`язок з гемо- та гістосумісності медичних полімерів [18]. Відомо, що структура поверхні всіх плівок живого організму є мікрогетерогенних, як показано на рис. 91. Отже, і ця аналогія теж цілком переконливо підтверджує справедливість сказаного. Тим не менш, до цих пір взаємодія білка крові з поверхнею полімерів медичного призначення ще не розглядалося в сукупності зі структурою мікрорасслоенія. Мало того, навіть використання мікроспектрального аналізу ще не дає можливості розпізнати, дефеніровать і витлумачити ті процеси, які протікають в доменах з розмірами на рівні мікронів і їхніх часток.
Автори даної глави у співпраці з Окано і Сіновара «кинули рукавичку» цієї проблеми, спираючись на можливості проникаючої електронної мікроскопії. Зразки плівок кополімерів 2-оксіетілметакрілата зі стиролом різного мікрофазного розшарування (суміш полімерів, сополімери невпорядкованого будови, блоксополімери) приводили в контакт на 30 з зальбуміном або з у-глобуліном у вигляді сульфатних буферних розчинів (pH 8,4- 0,01 М або 0,1 М концентрація білка становить 1/10 або 1/100 фізіологічної концентрації). Далі зразки промивали, фіксували 10% формаліновим буфером, фарбували осмієвою кислотою і аналізували методом проникаючої електронної мікроскопії [46]. Частина мікрознімки представлена на рис. 92 і 93.
На рис. 92, А чітко видно мікрофазное розшарування перед контактом полімерів з белком- чорні плями - стиролові домени, біла область - домен полімеру 2-оксіетілметакрілата. На рис. 92, Б відображена поверхню плівки після контакту з розчином альбуміну (білок забарвлений осмієвою кислотою) - видно, що альбумін «уникає» стирольних доменів і вибірково адсорбується доменами полі-2-оксіетілметакрілата, В-поверхня плівки зразка після контакту з розчином у-глобуліна- білок забарвлений осмієвою кислотою.
На рис. 93, А відображена структура мікрофазового розшарування зразка перед контактом з білком плазми (забарвлене осмієвою кислотою: чорні ділянки - домени полі-2-оксіетил-метакрилата, білі - домени полістиролу). На рис. 92, Б видно мікроструктура поверхні зразка після зіткнення з розчином альбуміну (pH 7,4). Чітко проглядається дуже сильна тенденція до селективної адсорбції альбуміну доменами полі-2-оксіетілметакрілата- при цьому порівняно добре утримується безперервність білих полістирольних доменів. На рис. 92, В показана мікроструктура поверхні зразка після контактування з розчином y-глобуліну (pH 7,4). Видно, що основна маса у-глобуліну адсорбується на полістирольних (білих) доменах, причому безперервність останніх зникає.
Всі ці мікрофотографії дозволяють зробити ряд загальних висновків. Абсолютно однозначно, що альбумін адсорбируется навколо гідрофільних доменів полі-2-оксіетілметакрілата, а у-глобулін- переважно на гідрофобних полістирольних доменах. Таким чином, білки плазми чітко дефинирует різні структури доменів мікрофазового розшарування, проявляючи високу вибірковість при адсорбції на цих доменах.
Мал. 92. Селективна адсорбція білка плазми крові плівковими зразками змішаного сополимера 2-оксіетілметакрілата зі стиролом структури мікрофазового розшарування.
Пояснення в тексті.
Мал. 93. Електронні мікрофотографії виборчої адсорбції білка плазми крові блоксополимерами 2-оксіетілметакрілата зі стиролом структури мікрофазового розшарування.
Пояснення в тексті.
Той шлях, який повинен привести до розуміння природи сумісності крові з чужорідними матеріалами, - це саме детальне дослідження специфічних взаємодій всієї складної системи крові з поверхнею структур мікрофазного розшарування - від молекулярного до клітинного рівня. Цілком ймовірно, такий шлях єдиний. Можна очікувати, що гістологічні та гістохімічні методи, прийоми і способи аналізів виявляться дієвим знаряддям досліджень в цьому напрямку.
