Спосіб кругового дихроїзму - біоматеріаловеденіе - полімери медичного призначення
Перші кроки по використанню кругового дихроїзму (КД) в області біоматеріаловеденія (а саме для дослідження стереоструктуру біополімерів) належать автору цього розділу. Мета робіт полягала в тому, щоб, спільно використовуючи методи КД і УФ спектроскопії, кількісно проаналізувати процес адсорбції білка поверхнею полімеру найбільш простим і легким способом в умовах, максимально близьких до природних, існуючим в живому організмі.
Мал. 78. Принципова схема спектроскопії методом кругового дихроїзму (КД). Пояснення в тексті.
Мал. 79. Методична схема способу КД з використанням кювети, покритої плівкою полімеру.
Загальний принцип реалізації способу КД представлений схематично на рис. 78. Промінь світла падає від джерела 1 (ксенонова лампа) на фокусирующее дзеркало 2 і потрапляє в монохроматор 3 і далі в поляризующий елемент 4. Тут монохроматический поляризований промінь набуває плоску поляризацію і надходить потім в кювету Покеля 5, де розділяється на поляризовані промені лівого і правого обертання. Далі пучок проходить через кювету 6 з зразком полімеру і надходить в детектор 7, що представляє собою фотоелектронний помножувач. Тут визначається різниця між екстинкція зразка по відношенню до ліво- і правовращающим поляризованим круговим променям [34, 35].
В результаті робіт автора з співр. [36] був створений спосіб аналізу, заснований на використанні кювети з покриттям з досліджуваного матеріалу. Методика способу полягає в наступному. Використовують кювету з кварцу, придатну як для УФ спектроскопії, так і для способу КД. На внутрішню поверхню такої кювети або на поверхню вставленої в неї прокладки наносять покриття у вигляді плівки з досліджуваного полімеру. Далі вводять в кювету розчин білка (pH 7,4- 37 ° С) і здійснюють контактування його з полімером протягом заданого часу. Потім ретельно промивають кювету фосфорнокислим буферним розчином. Нарешті, наповнюють її цим буфером і аналізують один і той же зразок шляхом послідовних УФ спектроскопії і способу КД.
Рис 80. Спектральні криві КД а-спіралі (1), p-структури (2) і безладного клубка (3).
Таким чином, запропонована методика дозволяє практично одночасно визначати кількість білка, адсорбованого полімером, і відзначати всього денатураціонние-деградаційні зміни. Загальна схема такої методики представлена на рис. 79.
Використовуючи УФ пік при 220 нм, будували калібрувальну криву для альбуміну кров`яної сироватки корови (log I / I0 = e / c- I - довжина кювети, з - концентрація). Результати аналізів дозволили констатувати, що цей пік gt; не залежить від денатураціонние змін білка, а визначається його концентрацією. Використовуючи коефіцієнт еліптичності Ф222 для 22 нм, який був визначений способом КД, обчислювали коефіцієнт [0] Г22 середнього числа залишкових груп адсорбованого білка. Розрахунок вели за формулою:
де М0 - середній обсяг залишку, що дорівнює 118.
На рис. 80 наведені спектральні криві КД а-спіралі, p-структури і безладного клубка. Як видно з кривих, одна з характерних особливостей конфігурації спектрального контуру КД а-спіралі полягає в тому, що при 222&rsquo- нм і 208 нм цей контур має два негативних піку приблизно однакового розміру. Відомо, що негативний пік при 222 нм не залежить від природи і різновиди білка і становить -40 000, тому по наведеній нижче формулі можна визначити процентний вміст в білці а-спіральної структури.
Зміст а-спіральної структури,
За описаною методикою була досліджена адсорбція альбуміну і глобуліну в результаті 15-секундного контакту з
полііонних комплексами. Зокрема, маніпулювали з комплексом, формулу якого запропонував Цурута Тейдзі.
На рис. 81 показані спектри КД розчину альбуміну, а також альбуміну, адсорбованого на плівці з полііонних комплексу. Порівняння спектральних кривих дозволяє стверджувати, що масштаби денатурації білка практично незначні. На рис. 82 наведені спектри КД розчину глобуліну, а також гамма-глобуліну, адсорбованого на плівці полііонних комплексу.
При зіставленні спектральних кривих очевидно, що адсорбція викликає досить значні зміни в просторовій структурі білка.
З кривих на обох графіках (рис. 81, 82) видно, що навіть після 15-секундного поглинання на поверхні полімеру утворюється шар білка товщиною в кілька макромолекул. Було встановлено також, що у у-глобуліну зміст p-структури змінюється від 16 до 31%, т. Е. Дуже сильно.
На закінчення слід підкреслити, що, на відміну від ІК спектроскопії способом ATR, метод КД не пов`язаний з необхідністю сушки зразків і дозволяє маніпулювати в умовах, досить близьких до природних, тому він може з повною підставою розглядатися як вельми перспективний.
Мал. 81. Спектри КД розчину альбуміну (А) і альбуміну, адсорбованого на плівці полііонних комплексу (Б).
